牛輪狀病毒的分離鑒定和疫苗研究進(jìn)展

我國(guó)牛輪狀病毒的分離鑒定和疫苗研究進(jìn)展摘要：本文對(duì)牛輪狀病毒的分離鑒定和疫苗研制這兩方面的研究進(jìn)展做一綜述。關(guān)鍵詞：牛輪狀病毒；犢牛腹瀉；分離鑒定；疫苗；牛輪狀病毒（BovineRotavirus，BRV）是引起牛傳染性腹瀉疾病的重要病原之一。自然條件下，不同品種、不同年齡的牛都均具感染性，但以犢牛主發(fā)。據(jù)報(bào)道，目前國(guó)內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的BRV均為A組或G5、G6、G8、和G10血清型。迄今國(guó)內(nèi)已檢測(cè)到的BRV均屬于G6、G10血清型的，對(duì)BRV的研究多集中在毒株的檢測(cè)和疫苗的研制方面，本文就此做以綜述。分離鑒定1.1分離方法自1969年Mebus等[1]在電鏡下觀察到BRV并成功分離毒株以來(lái)，各國(guó)有關(guān)BRV分離方法的研究報(bào)告不斷出現(xiàn)。我國(guó)在這方面的研究報(bào)道始于1984年，吳城等[2]從福建某縣采集了25份患有BRV腹瀉疾病的牛糞便，經(jīng)處理接種于牛腎原代細(xì)胞，傳代后細(xì)胞始終未出現(xiàn)典型病變。而次年劉純榮等[3]應(yīng)用MA-104細(xì)胞由耗牛病料分離出了4株輪狀病毒。李昌仁等[4]1987年同樣使用MA-104細(xì)胞成功的從黑龍江省腹瀉犢牛糞便中分離出了4株BRV，命名為DNRV1、DNRV2、DNRV3、DNRV4。孫繼國(guó)等[5]1996年對(duì)BRVNCDV株在MA-104、LLc-mk2和Hela三種細(xì)胞中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了比較研究，結(jié)果是在MA-104細(xì)胞上生長(zhǎng)最好，HeLa細(xì)胞上不生長(zhǎng)，在LLc-mk2細(xì)胞上雖然能生長(zhǎng)，但無(wú)細(xì)胞病變。蘇小康等[6]2005年應(yīng)用Marc145細(xì)胞成功分離出了一株BRV。目前分離BRV所使用的細(xì)胞首選為MA-104細(xì)胞。它能夠給BRV提供一個(gè)很好的增殖環(huán)境。1.2鑒定方法有關(guān)毒株的鑒定方法種類繁多，根據(jù)其各自的優(yōu)缺點(diǎn)應(yīng)用在不同的情況下。通常為了對(duì)分離株進(jìn)行充分、系統(tǒng)的鑒定會(huì)同時(shí)采用一種以上的方法?，F(xiàn)將常用、可靠的鑒定方法簡(jiǎn)介如下。1.2.1電鏡法在BRV的檢測(cè)中常用的電鏡方法有直接電鏡和免疫電鏡兩種。直接電鏡法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠，但檢出率受病毒粒子數(shù)量、完整性的影響，因此往往結(jié)合其他方法一同使用。免疫電鏡比直接電鏡敏感性更高，更易觀察，檢出率是直接電鏡的10倍以上，并可同時(shí)檢出不同的血清型。我國(guó)李決等[7]人1987年應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)、PAGE和ELISA等方法，首次在河南的腹瀉犢牛糞便中檢測(cè)出了輪狀病毒。后來(lái)又有關(guān)平原等[8]應(yīng)用直接電鏡和免疫電鏡方法對(duì)腹瀉犢牛的糞便、腸內(nèi)容物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在兩種病料中均見BRV粒子。證實(shí)了電鏡方法用作BRV腹瀉診斷是可行的。近年欒婧婧等[9]從爆發(fā)犢牛腹瀉的牛群中分離到一株BRV，應(yīng)用電鏡技術(shù)較為系統(tǒng)的觀察了病毒在宿主細(xì)胞中的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和宿主的結(jié)構(gòu)變化,豐富了BRV的鑒定依據(jù)。因電子顯微鏡具有極高的放大倍數(shù)，可使病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見的特點(diǎn)，使其至今仍廣泛應(yīng)用在BRV的檢測(cè)中。但電鏡檢測(cè)所需成本較高，不適于大量樣品的檢測(cè)。1.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）PAGE可將BRVRNA的11條帶清晰的呈現(xiàn)在電泳圖上，根據(jù)這11條帶的分布進(jìn)行A~G的分組，同時(shí)反映了病毒RNA基因組的差異和變異，現(xiàn)已檢測(cè)到的BRV均為A組，其電泳條帶呈4：2：3：2的特征分布。倪亞偉[10]1986年采用PAGE的方法對(duì)已分離出的四株BRV進(jìn)行鑒定，結(jié)果電泳圖譜呈現(xiàn)出BRV典型的11條帶，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)分離株BRV6576和BRV6555的第7、8、9三條帶之間的距離具有明顯差異。這為分子流行病學(xué)的調(diào)查提供了依據(jù)。付新成等[11]2009年從疑似輪狀病毒腹瀉犢牛糞便樣品中提取病毒RNA，PAGE檢測(cè)結(jié)果是6個(gè)樣品中有4個(gè)樣品的電泳條帶呈現(xiàn)A組BRV特有的4∶2∶3∶2分布。由此證明該牛群存在A組BRV感染。PAGE作為BRV鑒定方法之一，具有特異性強(qiáng)，操作、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但病毒的RNA易降解導(dǎo)致假陰性的結(jié)果出現(xiàn)。1.2.3早在1983年世界衛(wèi)生組織已將ELISA列為診斷輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法。在我國(guó)有關(guān)這方面的報(bào)道最早見于1985年劉純榮等[12]應(yīng)用ELISA、ELISA阻斷試驗(yàn)、免疫電鏡、PAGE和細(xì)胞培養(yǎng)等方法對(duì)四川省耗牛進(jìn)行檢測(cè)。證實(shí)了BRV是四川耗牛腹瀉的主要病原。類似的報(bào)道還有李決等[7]人和林雪等[13]人先后對(duì)河南地區(qū)犢牛糞便樣品的檢測(cè)時(shí)應(yīng)用到了此方法。梅魁敏等人[14]應(yīng)用該方法在江西省養(yǎng)牛業(yè)中檢測(cè)到BRV的存在。2009年曹竹婷等[15]確定了間接ELISA檢測(cè)牛血清中BRV抗體的最佳工作條件及判定標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)表明該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，適合于對(duì)BRV特異性抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和批量檢測(cè)。ELISA不僅適用于臨床標(biāo)本的抗原、抗體的檢測(cè)，也適合于進(jìn)行大規(guī)模樣品的檢測(cè)，開展流行病學(xué)調(diào)查。除具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定等特點(diǎn)還易于自動(dòng)化操作。1.2.4RT-PCRRT-PCRRT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。分為兩步，先以RNA為模板合成cDNA，之后以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多采用該方法鑒定未知毒株。敏感性可達(dá)到1pg水平，有很強(qiáng)的特異性和可重復(fù)性。欒婧婧等[16]2006年建立了半巢式RT-PCR快速檢測(cè)犢牛輪狀病毒的方法，該方法設(shè)計(jì)了針對(duì)BRVVP7基因和BRVG6血清型的兩種特異性引物，根據(jù)特異性擴(kuò)增結(jié)果鑒定毒株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有較好特異性、敏感性。在快速診斷BRV腹瀉疾病的同時(shí)又鑒定了該病毒屬于G6血清型的。常繼濤等[17]2008年采集了內(nèi)蒙古、黑龍江、新疆、北京、安徽等地犢牛腹瀉糞便樣品，對(duì)其中11份PAGE檢測(cè)陽(yáng)性者，采用半巢氏多重PCR的方法進(jìn)行了G血清型的鑒定。結(jié)果是其中4份為國(guó)內(nèi)已有的G6血清型，另外7份為國(guó)內(nèi)從未檢測(cè)到的G10血清型。將這11份樣品接種到MA104細(xì)胞上，最終僅分離到一株病毒，采用半巢氏多重PCR的方法對(duì)其進(jìn)行G、P血清型的鑒定，結(jié)果是該分離株血清型為G10P[11]的，命名為HM26。鑒于目前BRV與其他致牛腹瀉病原體的混合感染,我國(guó)學(xué)者建立了能同時(shí)檢出多種牛腹瀉病原體的方法。如張儉偉等[18]在2008年建立了能夠同時(shí)檢測(cè)牛輪狀病毒(BRV)與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的雙重RT-PCR方法，降低了檢測(cè)成本和檢測(cè)時(shí)間。次年柳強(qiáng)等[19]根據(jù)GenBank中牛冠狀病毒（BCV）、BRV核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)并合成了兩對(duì)特異性擴(kuò)增BCV、BRV的引物，優(yōu)化了PCR反應(yīng)條件，最終建立了可以同時(shí)檢測(cè)這兩種病原的雙重RT-PCR方法。隨后，在對(duì)多種病毒進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)僅有BCV、BRV出現(xiàn)大小分別為244bp和382bp的特異性條帶，表現(xiàn)出極高的特異性。另外對(duì)BCV和BRV檢測(cè)的敏感度分別為1個(gè)和100個(gè)TCID50/100μL。1.2.5核苷酸序列測(cè)定核酸序列測(cè)定是指是通過(guò)化學(xué)方法測(cè)定DNA片段中的核苷酸排列順序的技術(shù)，是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，可分辨出不同序列之間僅一個(gè)堿基的差別，適合于同源序列之間的分析比較。近年國(guó)內(nèi)外開始將其應(yīng)用到BRV的鑒定中。我國(guó)應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)BRV的報(bào)道較少。欒婧婧等[20]2006年從爆發(fā)犢牛腹瀉的牛群中分離到一毒株，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增該毒株的保護(hù)性抗原VP7基因，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體后進(jìn)行序列測(cè)定，在Genebank中進(jìn)行同源性檢索,發(fā)現(xiàn)該序列與RF株和輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株NCDV的同源性分別為98.9%和98.3%。與已發(fā)表的G6血清型輪狀病毒的VP7基因序列的同源性在84.7%~99.06%之間。由此可見,該分離毒株為G6血清型BRV。次年姜向陽(yáng)等[21]從疑似輪狀病毒腹瀉犢牛糞樣中分離到一株牛輪狀病毒。通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增VP1基因，連入載體并測(cè)序，經(jīng)DNAStar軟件分析,可知分離株的VP1基因與RF株和UK株的核苷酸同源性分別為98.9%和95%,證明分離毒株是一株牛輪狀病毒。2疫苗的研究BRV腹瀉同其他病毒性疾病一樣,均無(wú)特效療法。因此，接種疫苗是預(yù)防本病的最佳方法。早在1973年USDA（）美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了第一個(gè)新生犢牛輪狀病毒口服減毒疫苗用于免疫預(yù)防，時(shí)至今日，本病疫苗的研制仍為人們探討和研究。目前多數(shù)研究集中于BRV弱毒疫苗和滅活疫苗作產(chǎn)前免疫這兩個(gè)方面?，F(xiàn)就我國(guó)疫苗的研究現(xiàn)狀介紹如下。2.1弱毒活疫苗弱毒活疫苗系利用人工致弱或天然弱毒的毒株制成的疫苗。這類疫苗的特點(diǎn)是用量少、免疫力產(chǎn)生快且堅(jiān)強(qiáng)；由于制苗之種毒為活毒，接種后可與于體內(nèi)增殖，故存在變異——毒力變強(qiáng)，即“返祖”的危險(xiǎn)；同時(shí)也存在免疫機(jī)體排毒可能。因此，在弱毒活疫苗的研制中需要對(duì)其安全性倍加關(guān)注。1993年我國(guó)的林繼煌等[22]人用BRV014株的高代細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)產(chǎn)前3個(gè)月和1個(gè)月的黃牛進(jìn)行兩次免疫，每次肌注10ml，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。利用反向間接血凝抑制(RIHI)試驗(yàn)測(cè)定受試牛的血清和初乳之BRV抗體的變化，檢測(cè)結(jié)果是二者滴度均為免疫組高于對(duì)照組，且差異顯著?？贵w持續(xù)期免疫組為13天，而對(duì)照組僅有5天。本研究還對(duì)所產(chǎn)犢牛的腹瀉發(fā)生率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果是免疫組腹瀉發(fā)生率只有10.8%，而照組則高達(dá)57.1%；在病情和病程表現(xiàn)上也是前者較后者輕微，短暫。該研究為我國(guó)的BRV弱毒活疫苗的研制首開先河，為后續(xù)弱毒活疫苗的研制提供了參考。但此項(xiàng)工作未測(cè)接種疫苗的病毒滴度和病毒的排出率，因此做為疫苗的安全問(wèn)題留有懸筆。何孔旺等[23]1998年同樣用BRV014株的高代次(50代以上)細(xì)胞培養(yǎng)物(TCID50=10-6.5)于孕牛產(chǎn)前3個(gè)月和1個(gè)月經(jīng)肌肉各免疫注射21次，每次肌注次8~10ml，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。利用RIHI試驗(yàn)測(cè)定受試牛的結(jié)果可明顯提高母牛初乳中的特異性BRV抗體的變化,檢測(cè)結(jié)果是免疫組初乳中抗體滴度最高可達(dá)1：4096，并且在直到產(chǎn)后20d抗體滴度仍能維持在1∶64，。這與對(duì)照組有顯著差異。抗體持續(xù)期免疫組為16天，而對(duì)照組僅有3天。此外對(duì)所產(chǎn)犢牛腹瀉發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)臨床觀察,顯示，免疫2次的母牛所組所產(chǎn)犢牛的腹瀉發(fā)生率較對(duì)照組降低83.8%。以上研究為說(shuō)明該高代次細(xì)胞培養(yǎng)物作為BRV弱毒活疫苗的研制提供了候選毒株具有良好應(yīng)用前景。基于我國(guó)BRV主要流行的血清型有G6、G10兩種，因此研制多價(jià)（二價(jià)）疫苗更具應(yīng)用價(jià)值。而且BRVRNA分11節(jié)段，可利用生物重組技術(shù)獲得基因重配的減毒活疫苗。常繼濤等[24]2009年借鑒人輪狀病毒的研究平臺(tái)，以羊輪狀病毒LLR-85毒株（G10）和BRVNCDV毒株（G6）為親本，構(gòu)建出一株具有G6血清型的，對(duì)牛天然弱毒的基因重配毒株，并命名為R191，其VP7基因來(lái)源于NCDV株，其余的10個(gè)基因節(jié)段來(lái)源于LLR-85毒株，以R191毒株與和LLR-85毒株制成的二價(jià)減毒疫苗涵蓋了BRVG6和G10我國(guó)BRV主要流行的血清型的二價(jià)減毒疫苗。經(jīng)田間試驗(yàn)表明該疫苗具有良好的免疫原性和較低的病毒釋放率。可作為預(yù)防BRV多價(jià)弱毒活感染的疫苗的候選毒株研制提供了參考。BRVRNA分11節(jié)段，便于通過(guò)生物技術(shù)手段獲得基因重配株。將來(lái)隨著新血清型的出現(xiàn)，運(yùn)用該方法可以很容易制得包含新血清型的多價(jià)弱毒活疫苗，實(shí)現(xiàn)對(duì)BRV腹瀉疾病及時(shí)、全面的預(yù)防。2.2滅活疫苗滅活疫苗系選用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株或免疫原性特別好的弱毒株，經(jīng)人工培養(yǎng)，用化學(xué)或物理方法殺死（滅活）后制成，至今常用的滅活方法是用甲醛等化學(xué)試劑滅活。這類疫苗較弱毒活疫苗安全性高，但免疫原性差，使用時(shí)一般要加佐劑以提高其免疫原性。滅活疫苗是利用理化方法甚至簡(jiǎn)單加熱使病毒失去增殖能力后制成的一種安全性較高的疫苗。雖能引起免疫反應(yīng)，但其部分抗原成分被破壞，故免疫力差，在使用時(shí)一般要加入佐劑提高免疫原性。我國(guó)有關(guān)BRV滅活疫苗的研究開展較晚，報(bào)道較少。張儉偉等[25]2007年將BRVCHLY株（TCID50=10-6.59）按常規(guī)方法制成油乳佐劑滅活疫苗。對(duì)產(chǎn)前2個(gè)月和1個(gè)月的荷斯坦牛進(jìn)行兩次免疫，每次3ml，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。用間接ELISA、中和試驗(yàn)測(cè)定受試牛之乳清和所產(chǎn)犢牛血清中BRV抗體的變化。選取12頭同期發(fā)情配種的荷斯坦孕牛，隨機(jī)平均分為免疫組和對(duì)照組，免疫組在產(chǎn)前2月和1月分兩次免疫該疫苗，每次注射3ml，對(duì)照組不做任何免疫。采集母牛分娩后的第1、2、3、4、6、8、10、14和21天的牛乳和犢牛血清。用間接ELISA、中和試驗(yàn)檢測(cè)乳清和血清中BRV抗體。結(jié)果,是在檢測(cè)期間對(duì)照組乳清中特異性IgG、IgA及中和抗體效價(jià)均小于200。而免疫組母牛乳清中及其所產(chǎn)犢牛血清中特異性IgG、IgA及中和BRV抗體效價(jià)分別在第1d1天和第2天達(dá)到了最大值，然后隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。，而對(duì)照組其效價(jià)一直處于較低水平，兩組差異極顯著在犢牛血清檢測(cè)中對(duì)照組特異性抗體均小于200，免疫組特異性抗體在第2d上升到最大值。表明犢?？蓮某跞橹形誃RV特異性抗體,顯著提高血清中的特異性抗體水平。本研究還進(jìn)行了攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是免疫組所產(chǎn)犢牛的發(fā)病率較對(duì)照組所產(chǎn)犢牛低，潛伏期也是前者長(zhǎng)于后者用2ml106.59TCID50/ml的BRVCHLY株對(duì)21日齡犢牛攻毒,。證實(shí)了該疫苗對(duì)犢牛腹瀉有保護(hù)作用。此研究以上為滅活疫苗的研制奠定了理論基礎(chǔ)。[26]又于2008年次年又以同一毒株，按常規(guī)方法制備油乳佐劑疫苗和鋁佐劑疫苗，比較不同佐劑疫苗的免疫原性。免疫小鼠和懷孕的新西蘭兔。ELISA檢測(cè)小鼠、懷孕的新西蘭兔在免疫前后血清中特異性抗體的變化和仔兔血清中特異性抗體的滴度。結(jié)果證明了是兩種疫苗均具有良好的免疫原性。但其對(duì)犢牛的保護(hù)作用還有待研究。同年曹竹婷等[27]做了類似的研究，結(jié)果是免疫組動(dòng)物2008年用終濃度為0.1%的甲醛滅活BRV山東分離株CHLY（G6血清型），并按常規(guī)方法制成油乳劑滅活疫苗。田間試驗(yàn)分為兩組，其中一組實(shí)驗(yàn)對(duì)3月齡內(nèi)的90頭犢牛隨機(jī)分組免疫，另一組對(duì)30頭懷孕牛在產(chǎn)前30~90天一免，兩周后二免。免疫后30天內(nèi)該疫苗沒(méi)有因注射該疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而產(chǎn)生副作用，證實(shí)了該疫苗的安全性。用已建立的間接ELISA和中和試驗(yàn)對(duì)免疫后組犢牛血清中和牛初乳中的特異性抗體和牛初乳中特異性抗體水平進(jìn)行檢測(cè)較對(duì)照組有顯著提高，證實(shí)了該疫苗具有很好的免疫原性。3結(jié)束語(yǔ)BRV的危害一直未能杜絕根除，而且愈演愈烈，影響了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，因此，人們一直以來(lái)不斷對(duì)他進(jìn)行研究，除本文所提到上述的分離鑒定和疫苗的研究外還有許多方面也在積極的研究中，例如：?jiǎn)慰寺】贵w的制備、流行病學(xué)和的研究和結(jié)構(gòu)功能。。。。。。等的研究。參考文獻(xiàn)：[1]MebusCA.UnderdahlNR,RhodesMB,etal.Calfdiarrhoeareproducedwithavirusfromafieldoutbreak[M].Bulletin:UniversityofNebraskaAgriculturalExperimentStationResearch,1969:233.[2]吳城，金學(xué)浩，曾廣謐等.福建省牛流行性腹瀉病原一牛輪狀病毒的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，15（4），249-256.[3]劉純榮，陳曉蘭，劉琦等.用細(xì)胞培養(yǎng)分離耗牛輪狀病毒[J].中國(guó)人獸共患病雜志，（10），57-58.[4]李昌仁，王君偉，李英霞等.黑龍江省犢牛腹瀉糞便中輪狀病毒的分離與鑒定[J].東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，21（1），51-56.[5]孫繼國(guó)，鄭世學(xué)，劉美紅.犢牛腹瀉輪狀病毒在3個(gè)傳代細(xì)胞上培養(yǎng)特性的研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，19（1），59-63.[6]蘇小庚，吳周良，王正秀.犢牛輪狀病毒的分離鑒定[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，28（4），93-100.[7]李決，林雪.在犢牛腹瀉糞便中檢出輪狀病毒[J].鄭州牧專學(xué)報(bào)，（1），24-25.[8]關(guān)平原，郭延春.應(yīng)用直接透射電鏡配合免疫電鏡診斷牛輪狀病毒性腹瀉[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，15（12），8-9.[9]欒婧婧，楊少華，馬廣強(qiáng).新分離牛輪狀病毒及其血清型的研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，27（6），141-144.[10]倪亞煒.豬和牛輪狀病的分離與鑒定[J].病毒學(xué)報(bào)，2（1），36-40.[11]付新成，李聰研，張艷玲等.聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)犢牛輪狀病毒[J].動(dòng)物保健，（17），38-39.[12]劉純榮，劉琦，陳曉蘭等.耗牛腹瀉病原-輪狀病毒的調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，（10），19-21.[13]林雪，包文奇，李決.應(yīng)用聚丙烯酞胺凝膠電泳檢測(cè)牛、豬輪狀病毒試驗(yàn)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，（9），33-34.[14]梅魁敏，伍學(xué)州，范青生.用ELISA法和核酸電泳法檢測(cè)牛輪狀病毒[J].徽生物學(xué)通報(bào)，18（6），366-367.[15]曹竹婷，楊少華，楊宏軍.檢測(cè)牛輪