基因診斷和基因治療

基因診斷和基因治療第一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第二十五章基因診斷和基因治療GeneDiagnosisandGeneTherapy第二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)基因診斷GeneDiagnosis第三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日基因診斷的優(yōu)勢(shì)：①可在源頭上識(shí)別基因正常與否，屬于“病因診斷”②針對(duì)特定基因，特異性強(qiáng)③所用的PCR等技術(shù)具有放大效應(yīng)，故靈敏度高④適用性強(qiáng)，診斷范圍廣是指利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法?；蛟\斷的定義：第四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日、基因診斷的主要對(duì)象和樣品來(lái)源主要是DNA分子，涉及到功能分析時(shí)，還可定量檢測(cè)RNA（主要是mRNA）和蛋白質(zhì)等分子。臨床上可用于基因診斷的樣品有血液、組織塊、羊水和絨毛、精液、毛發(fā)、唾液和尿液等。對(duì)象：樣品來(lái)源：第五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日二、基因診斷技術(shù)分類(lèi)定性分析定量分析基因分型檢測(cè)基因突變測(cè)定基因拷貝數(shù)測(cè)定基因表達(dá)產(chǎn)物量基本流程：基因診斷的基礎(chǔ)核酸抽提目的序列的擴(kuò)增分子雜交信號(hào)檢測(cè)核酸分子雜交DNA序列分析技術(shù)幾種技術(shù)聯(lián)合使用第六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（一）基因缺失或插入的診斷1．DNA印跡法其可以區(qū)分正常和突變樣品的基因型，并可獲得基因缺失或插入片段大小等信息。DNA印跡一般可以顯示50bp～20kbp的DNA片段，片段大小的信息是該技術(shù)診斷基因缺陷的重要依據(jù)。2．PCR法裂口PCR（gap-PCR），簡(jiǎn)便靈敏而更適用于臨床診斷。該方法的思路是：設(shè)計(jì)并合成一組序列上跨越突變（缺失或插入）斷裂點(diǎn)的引物，從擴(kuò)增片段的大小直接判斷是否存在缺失或插入突變。第七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（二）基因點(diǎn)突變的診斷1．等位基因特異性寡核苷酸分子雜交檢測(cè)點(diǎn)突變的有效技術(shù)是等位基因特異性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide，ASO）分子雜交。第八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日2．反向點(diǎn)雜交反向點(diǎn)雜交（reversedotblot，RDB）是改進(jìn)的ASO技術(shù)。一次檢測(cè)可以同時(shí)篩查多種突變，大大提高了基因診斷效率。3．變性高效液相色譜DHPLC技術(shù)的基本原理是利用待測(cè)樣品DNA在PCR擴(kuò)增過(guò)程的單鏈產(chǎn)物可以隨機(jī)與互補(bǔ)鏈相結(jié)合而形成雙鏈的特性，依據(jù)最終產(chǎn)物中是否出現(xiàn)異源雙鏈來(lái)判斷待測(cè)樣品中是否存在點(diǎn)突變。4．DNA序列分析用于基因突變類(lèi)型已經(jīng)明確的遺傳病的診斷及產(chǎn)前診斷。第九頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日三、基因診斷的醫(yī)學(xué)應(yīng)用（一）遺傳性疾病診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)基因診斷目前可用于遺傳篩查和產(chǎn)前診斷。疾病致病基因突變類(lèi)型診斷方法α地中海貧血α珠蛋白缺失為主Gap-PCR、DNA雜交、DHPLCβ地中海貧血β珠蛋白點(diǎn)突變?yōu)橹鞣聪螯c(diǎn)雜交、DHPLC甲型血友病凝血因子Ⅷ點(diǎn)突變?yōu)橹鱌CR-RFLP乙型血友病凝血因子Ⅸ點(diǎn)突變、缺失等PCR-STR連鎖分析苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶點(diǎn)突變PCR-STR連鎖分析、ASO分子雜交馬凡綜合癥原纖蛋白點(diǎn)突變、缺失PCR-VNTR連鎖分析、DHPLC我國(guó)部分代表性常見(jiàn)單基因遺傳病基因診斷第十頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（二）多基因常見(jiàn)病的預(yù)測(cè)性診斷預(yù)測(cè)性診斷可為被測(cè)者提供某些疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估意見(jiàn)。第十一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（三）傳染病病原體檢測(cè)適用情況①病原微生物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，確定感染源；②病毒或致病菌的快速分型，明確致病性或藥物敏感性；③需要復(fù)雜分離培養(yǎng)條件，或目前尚不能體外培養(yǎng)的病原微生物的鑒定。第十二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（四）療效評(píng)價(jià)和用藥指導(dǎo)PCR等基因診斷技術(shù)已成為臨床上檢測(cè)和跟蹤微小殘留病灶的常規(guī)方法。在系統(tǒng)闡明人類(lèi)藥物代謝酶類(lèi)及其他相關(guān)蛋白的編碼基因遺傳多態(tài)性的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)不同藥物代謝基因靶點(diǎn)的藥物遺傳學(xué)檢測(cè)，將為真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥提供技術(shù)支撐。第十三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（五）DNA指紋鑒定是法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別的核心技術(shù)人與人之間的某些DNA序列特征具有高度的個(gè)體特異性和終生穩(wěn)定性，正如人的指紋一般，故稱(chēng)為DNA指紋（DNAfingerprinting）。STR等位基因在家庭中遺傳示意圖第十四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)基因治療GeneTherapy第十五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日是以改變?nèi)诉z傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療，即通過(guò)一定方式將人正?；蚧蛴兄委熥饔玫腄NA片段導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以矯正或置換致病基因的治療方法。它針對(duì)的是疾病的根源，即異常的基因本身?；蛑委煹亩x第十六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日一、基因治療的基本策略（一）缺陷基因精確的原位修復(fù)第十七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日基因矯正genecorrection基因置換genereplacement致病基因的突變堿基進(jìn)行糾正用正常基因通過(guò)重組原位替換致病基因這兩種方法屬于對(duì)缺陷基因精確的原位修復(fù)，既不破壞整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)，又可達(dá)到治療疾病的目的，是最為理想的治療方法。第十八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（二）基因增補(bǔ)不刪除突變的致病基因，而在基因組的某一位點(diǎn)額外插入正?；颍隗w內(nèi)表達(dá)出功能正常的蛋白質(zhì)，達(dá)到治療疾病的目的。這種對(duì)基因進(jìn)行異位替代的方法稱(chēng)為基因添加（geneaugmentation）或稱(chēng)基因增補(bǔ)，是目前臨床上使用的主要基因治療策略。第十九頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（三）基因沉默或失活有些疾病是由于某一或某些基因的過(guò)度表達(dá)引起的，向患者體內(nèi)導(dǎo)入有抑制基因表達(dá)作用的核酸，如反義RNA、核酶、干擾小RNA等，可降解相應(yīng)的mRNA或抑制其翻譯，阻斷致病基因的異常表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。這一策略稱(chēng)為基因失活（geneinactivation）或基因沉默（genesilencing）。第二十頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日第二十一頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日二、基因治療的基本程序基因治療的基本過(guò)程可分為5個(gè)步驟：①選擇治療基因②選擇攜帶治療基因的載體③選擇基因治療的靶細(xì)胞④在細(xì)胞和整體水平導(dǎo)入治療基因⑤治療基因表達(dá)的檢測(cè)第二十二頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（一）選擇治療基因許多分泌性蛋白質(zhì)如生長(zhǎng)因子、多肽類(lèi)激素、細(xì)胞因子、可溶性受體（人工構(gòu)建的去除膜結(jié)合特征的受體），以及非分泌性蛋白質(zhì)如受體、酶、轉(zhuǎn)錄因子的正?；蚨伎勺鳛橹委熁?。簡(jiǎn)言之，只要清楚引起某種疾病的突變基因是什么，就可用其對(duì)應(yīng)的正?；蚧蚪?jīng)改造的基因作為治療基因。第二十三頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（二）選擇攜帶治療基因的載體基因治療用載體有病毒載體和非病毒載體兩大類(lèi)，多選用病毒載體。野生型病毒必須經(jīng)過(guò)改造，剔除其復(fù)制必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力。目前用作基因轉(zhuǎn)移載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）、腺病毒（adenovirus）、腺相關(guān)病毒（adeno-associatedvirus,AAV）、單純皰疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）等。第二十四頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒屬于RNA病毒，其基因組中有編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶（integrase）的基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有基因轉(zhuǎn)移效率高、細(xì)胞宿主范圍較廣泛、DNA整合效率高等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)一是有感染性病毒的可能；二是增加了腫瘤發(fā)生機(jī)會(huì)。第二十五頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日2.腺病毒載體腺病毒屬DNA病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮細(xì)胞的感染。安全性高轉(zhuǎn)染效率高可用細(xì)胞范圍廣缺點(diǎn)基因組較大，構(gòu)建復(fù)雜不能長(zhǎng)期表達(dá)免疫原性較強(qiáng)，易被排斥優(yōu)點(diǎn)第二十六頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（三）選擇基因治療的靶細(xì)胞靶細(xì)胞通常是體細(xì)胞（somaticcell），包括病變組織細(xì)胞或正常的免疫功能細(xì)胞。1.造血干細(xì)胞：造血干細(xì)胞（hematopoieticstemcell，HSC）是骨髓中具有高度自我更新能力的細(xì)胞，能進(jìn)一步分化為其他血細(xì)胞，并能保持基因組DNA的穩(wěn)定。2.皮膚成纖維細(xì)胞：皮膚成纖維細(xì)胞具有易采集、可在體外擴(kuò)增培養(yǎng)、易于移植等優(yōu)點(diǎn)。

3.肌細(xì)胞：肌細(xì)胞有特殊的T管系統(tǒng)利于注射的質(zhì)粒DNA經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入。環(huán)狀質(zhì)粒不整合入基因組DNA，能在肌細(xì)胞內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間保留。

第二十七頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日（四）將治療基因?qū)肴梭w將外源基因直接注入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)?；蜻f送genedelivery間接體內(nèi)療法exvivo直接體內(nèi)療法invivo將需要接受基因的靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，在體外培養(yǎng)，將攜帶有治療基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，篩選出接受了治療基因的細(xì)胞，繁殖擴(kuò)大后再回輸體內(nèi)，使治療基因在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物。第二十八頁(yè)，共三十頁(yè)，2022年，8月28日基因?qū)爰?xì)胞生物學(xué)法非生物學(xué)法病毒載體所介導(dǎo)的基因?qū)?，是通過(guò)病毒感染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，其特點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)移效率高，但安全問(wèn)題需要重視。用物理或化學(xué)法，將治療基因