蛋白質(zhì)芯片地地的應(yīng)用進(jìn)展及其存在問地的題目

實用標(biāo)準(zhǔn)文案蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用進(jìn)展及其存在問題馬麗娟，王卓，胡晉紅（第二軍醫(yī)大學(xué) 長海醫(yī)院藥學(xué)部 上海 200433 ）摘要：蛋白質(zhì)芯片是繼基因芯片后發(fā)展起來的生物檢測技術(shù)。 它的出現(xiàn)將從根本上改變生物醫(yī)學(xué)實驗和診斷等多方面的現(xiàn)狀， 并表現(xiàn)了良好的前景。 對蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，同時對其存在問題進(jìn)行了分析。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)芯片 檢測技術(shù) 應(yīng)用 存在問題通過人類基因組計劃 ,研究者已經(jīng)測定了人類基因組序列 ,并發(fā)現(xiàn)了成千上萬的新基因。但同時人們要面對一個新的問題 ,僅基因組學(xué)的研究并不能得到生物功能的完整信息 :我們通過基因組工程得到了蛋白質(zhì)的基因序列 ,但僅僅從基因組順序我們依然無法了解蛋白質(zhì)的定位、結(jié)構(gòu)、修飾 (磷酸化,糖基化,乙?；退獾?)等信息,更無法確定蛋白質(zhì)的功能 [1]。因為蛋白質(zhì)才是生命活動的執(zhí)行者和體現(xiàn)者。 1994年Wilkin 和Williams 首次提出了蛋白質(zhì)組(proteome) 的概念。與經(jīng)典的蛋白質(zhì)化學(xué)研究相比 ,它的研究對象不再只是一種或幾種蛋白質(zhì),而是著眼于全面性和整體性來研究所有蛋白質(zhì)的性質(zhì)與功能及蛋白質(zhì)相互作用。人們需要一種新的技術(shù)來進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析 ,蛋白芯片 (protein chips)或稱蛋白微陣列(proteinmicroarrays) 技術(shù)于是應(yīng)運而生。一、蛋白質(zhì)芯片的概念及特點蛋白質(zhì)芯片是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新的方法 [2，3]。它類似于基因芯片，是將蛋白質(zhì)點到固相物質(zhì)上，然后與要檢測的組織或細(xì)胞等進(jìn)行“雜交” ，再通過自動化儀通訊作者：胡晉紅（1949-）碩士和博士生導(dǎo)師，長海醫(yī)院藥學(xué)部主任。作者簡介：馬麗娟，女，碩士生。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案器分析得出結(jié)果。這里所指的“雜交”是指蛋白與蛋白之間如（抗體與抗原）在空間構(gòu)象上能特異性的相互識別。 將各種蛋白質(zhì)有序地固定在玻片、 凝膠、微孔板等各種載體上形成密集蛋白質(zhì)芯片 ,用來高通量地測定蛋白質(zhì)的生物活性 ,如酶活性,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間及蛋白質(zhì) -其他分子,如蛋白質(zhì)-DNA,蛋白質(zhì)-配基間的相互作用 [4]。蛋白質(zhì)芯片具有以下特點： [5，6]（1）特異性強(qiáng)，這是由抗原抗體之間，蛋白與配體之間的特異性結(jié)合決定的； （2）敏感性高，可以檢測出樣品中微量蛋白的存在，檢測水平已達(dá) ng級；（3）通量高，在一次實驗中對上千種目標(biāo)蛋白同時進(jìn)行檢測，效率極高； （4）應(yīng)用性強(qiáng)，樣品的前處理簡單，只須對少量實際標(biāo)本進(jìn)行沉降分離和標(biāo)記后，即可加于芯片上進(jìn)行分析和檢測。二、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用1、蛋白質(zhì)功能研究方面的應(yīng)用MacBeath 和Schreiber [7]用蛋白質(zhì)芯片來研究蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-小分子以及酶-底物之間的相互作用，并且討論了這種方法的可行性。 Zhu等用酵母蛋白質(zhì)芯片對酵母蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行全分析， 發(fā)現(xiàn)了新的鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白和磷脂結(jié)合蛋白， 同時發(fā)現(xiàn)了許多鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白共同存在一個潛在的鍵合域。 他們還應(yīng)用該蛋白質(zhì)芯片觀察了蛋白與藥物之間的相互作用，并測定了后轉(zhuǎn)錄修飾。 和酵母雙雜交技術(shù)相比， 蛋白質(zhì)芯片克服了它的許多局限性，它將成為研究蛋白質(zhì)功能的有力工具。、臨床方面的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在臨床方面有著廣泛的應(yīng)用，尤其是在疾病的診斷和療效判定，即生物學(xué)標(biāo)志物的檢測上，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有很大的應(yīng)用價值和前景。Rosty[8]等同樣利用蛋白質(zhì)芯片和 SELDI技術(shù)對胰腺癌患者（ 15例）的胰液和其他胰腺疾?。?例）的胰液進(jìn)行了 比較。結(jié)果在 10例（67%）胰腺癌患者和 1例（17%）其他胰腺疾病患者的胰液中發(fā)現(xiàn)一個大約為 16。57kD 的蛋白質(zhì)峰。經(jīng)過蛋白質(zhì)芯片免疫測精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案定，確定該蛋白質(zhì)為肝癌 -小腸-胰腺/胰腺炎相關(guān)蛋白 I（HIP/PAP-I）。HIP/I 在胰腺癌患者的胰液及血清中的表達(dá)量上的差異較血清更為顯著。 這提示我們，通過對胰液中 HIP/PAP-I的檢測將有助于胰腺癌的診斷。蛋白質(zhì)芯片還可應(yīng)用于自身性免疫疾病的診斷 [9]。蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用 ,給腫瘤診斷和預(yù)后提供了一種高效 ,高通量的方法 ,適合腫瘤的普查。一般是先從抗體庫中挑出對腫瘤診斷或預(yù)后有潛在意義的抗體 ,制成抗體芯片。然后提取正常組織和腫瘤組織的蛋白質(zhì)用不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記 ,后與芯片反應(yīng),通過計算機(jī)分析得出結(jié)論。 Englert 等[9]將抗體點在基片上制成抗體芯片，用來檢測正常組織和腫瘤組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)如明膠酶 A等在腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。、蛋白質(zhì)芯片在分子藥理學(xué)研究中的應(yīng)用分子藥理學(xué)研究的基本理論是受體學(xué)說。受體的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，對于受體的研究可以闡明藥物，激素及神經(jīng)遞質(zhì)的作用原理和生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)急智， 為藥物設(shè)計，靶點的選擇和用藥方案的確定提供理論的依據(jù)。孤兒受體缺乏配體無法利用傳統(tǒng)受體 /配體方法研究其藥理學(xué)作用。 蛋白質(zhì)芯片將成為解決這一難題的有力工具， 可將孤兒受體固定于載體表面， 利用非標(biāo)記技術(shù)找到其相應(yīng)的配體。根據(jù)Schwartz 等提出的受體別構(gòu)模型及 Pejman Ghanouni 等研究成果[10]，直接以熒光標(biāo)記孤兒受體， 檢測在受體配體誘導(dǎo)下， 隨受體構(gòu)象的改變的標(biāo)記孤兒受體熒光值。 這一新方法一旦成熟，將會為藥理學(xué)的研究開辟一片新天地。、新藥研制方面的應(yīng)用低耗，快速，高效地篩選出新藥或待選化合物是目前新藥開發(fā)工作急需解決的問題 [11]。蛋白質(zhì)芯片高通量， 并行性的特點，為新藥的研制提供了一條新的思路， 大大加快了化合物篩選的速度。蛋白質(zhì)芯片有助于了解藥物與其效應(yīng)蛋白的相互作用 ,并可以在對化學(xué)藥物作精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案用機(jī)制不甚了解的情況下直接研究蛋白質(zhì)譜。目前，國內(nèi)已有人利用基因芯片對中藥復(fù)方 -黃連解毒湯進(jìn)行了嘗試性研究 [12。Reilly等[13]應(yīng)用高密度芯片研究了給予中毒量醋氨酚的大鼠肝臟中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)編碼細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，轉(zhuǎn)錄因子 LRG-21，細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（SOCS）-2-蛋白，血漿酶原活化抑制分子 -1（PAI-1）等多種蛋白的基因表達(dá)增多了兩倍多，提示它們在增加或阻止進(jìn)一步的肝臟毒性作用中具有潛在的重要性。蛋白質(zhì)芯片突破了酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)的局限性，通過兩類基本蛋白質(zhì)芯片研究技術(shù)——蛋白質(zhì)功能芯片和蛋白質(zhì)檢測芯片，對蛋白質(zhì)進(jìn)行直接體外研究，以獲得新型藥物靶標(biāo)。在藥物研發(fā)中，區(qū)分和確定蛋白質(zhì)的作用是發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療藥物的第一步。 Zhu等[15]克隆了5800個酵母細(xì)胞的開放閱讀框架（ ORF），過表達(dá)且純化其相應(yīng)的蛋白質(zhì)，可用于研究不同蛋白質(zhì)之間的相互作用， 也可以用于研究蛋白質(zhì)與藥物之間的相互作用和蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。 Lueking 等[16]從人胎兒腦 cDNA 表達(dá)庫（hExl）中克隆出 92個cDNA，將反轉(zhuǎn)錄的蛋白陣列用以檢測來自噬菌體表面 (phagedisplay) 的單抗或 scFV片段，目的是找出共同抗原決定簇及進(jìn)行質(zhì)量控制。、其他方面應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片研究藥物作用的機(jī)理及細(xì)胞對藥物所作出的反應(yīng) [17]。在臨床試驗中 ,利用蛋白質(zhì)芯片跟蹤藥物所引起的蛋白質(zhì)的表達(dá)就可以確定被檢藥物對人體是否有毒副作用,或達(dá)到多大劑量才會引起毒副作用。 此外,蛋白質(zhì)芯片還能運用于環(huán)境監(jiān)測及食品工業(yè)中 ,用來檢測環(huán)境或食品由微量的有毒化學(xué)物質(zhì)或病原菌。Grow等[18]利用表面增強(qiáng)拉曼散射(surfaceenhancedRamanscattering,SERS)芯片技術(shù),根據(jù)各生物體(革蘭氏陽性李斯特菌,革蘭氏陰性軍團(tuán)菌,芽孢桿菌的芽孢和隱孢子蟲卵囊)拉曼散射指紋圖譜,檢測病原體與所含毒素。Stokes等[19]采用配備微流體傳輸系統(tǒng)的二維感光芯片,利用集成電路原理與免疫診斷技術(shù)檢測大腸桿菌O157:H7,這可以杜絕大規(guī)模腸道感染的發(fā)生。精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案三、存在問題蛋白質(zhì)芯片的研究盡管在很多方面取得了許多進(jìn)展，但是該項目畢竟是剛剛起步，仍有許多關(guān)鍵技術(shù)，特別是涉及應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)有待研究和突破。由于蛋白質(zhì)本身的變化太多，且空間構(gòu)象在很大程度上決定其活性與功能，相對于目前基因芯片研究的進(jìn)展速度而言，蛋白質(zhì)芯片的研究顯然相對滯后。首先是成本問題，蛋白質(zhì)芯片的制作工藝相當(dāng)繁瑣、復(fù)雜，特別是涉及大量不同種類的蛋白的高效表達(dá)與純化，而且儀器也需要有專門的，一般的實驗室都承受不起，但隨著經(jīng)濟(jì)的進(jìn)一步改善，從根本上會滿足需要的.其次是此技術(shù)要求有專門的技術(shù)人員去操作，如何提高蛋白質(zhì)芯片的各個操作環(huán)節(jié)集中到一個或幾個儀器里邊，使即使對芯片技術(shù)不熟悉的人也可以操作，這將是把技術(shù)推廣到臨床未來發(fā)展的一個重要發(fā)展方向.再者，蛋白質(zhì)芯片在制作過程中實驗條件發(fā)生微小的變化便可能引起最后結(jié)果的不同，實驗條件不宜控制，使得實驗結(jié)果的可重復(fù)性相對不足.第四，制備全面、高通量分析的蛋白質(zhì)芯片仍需大量的蛋白和高特異性，高選擇性的抗體，而cDNA庫表達(dá)，純化的蛋白由于沒有合適的表達(dá)系統(tǒng)，缺乏有效的轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)而影響表達(dá)蛋白的活性，盡管采用了原核表達(dá)系統(tǒng)，可以大大量產(chǎn)生外源蛋白，但對于某些外源蛋白來說，卻能在包涵體中聚集和積累，而且宿主細(xì)菌對某些蛋白不能正確的折疊以及進(jìn)行磷酸化或糖基化等修飾，這將影響芯片的檢測效率.第五，細(xì)胞中存在許多膜結(jié)合蛋白，如酵母中膜結(jié)合蛋白和分泌蛋白就占了總蛋白的28.2%，許多膜結(jié)合蛋白只有和膜脂結(jié)合在一起才有活性，所以提取或重建時要將蛋白和相應(yīng)的膜脂一起，這對于蛋白質(zhì)芯片的制作是困難的；第六，對于肝炎病毒感染所引起的免疫反應(yīng)，蛋白質(zhì)芯片的準(zhǔn)確受限于所選擇的抗原或抗體的來源、純度與特異性，并且蛋白質(zhì)類抗體的生產(chǎn)與應(yīng)用存在著抗原性、免疫原性的強(qiáng)弱，異源抗體的類風(fēng)濕因子和自身抗體的干擾、罕見抗體的高工作量篩選、克隆株（細(xì)胞）的不易保存、無法標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、體內(nèi)外的識別特異精彩文檔實用標(biāo)準(zhǔn)文案性差異、對溫度敏感所發(fā)生的不可逆變性等因素的限制， 蛋白質(zhì)芯片的廣泛使用還需要一定的技術(shù)支持；最后是目前，對于實驗的許多結(jié)果還不能做出完美的解釋， 這將依賴于生物學(xué)的整體發(fā)展，這也促進(jìn)了人們對生物學(xué)進(jìn)行更深層次的研究。四、展望作為一種新興的蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有的高通量、快速、平行、自動化等無法比擬的優(yōu)點， 將極大地推動人類揭示疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及尋找更合適有效治療的進(jìn)程[20]。雖然它還存在很多有待解決的問題，但隨著微加工技術(shù)、納米技術(shù)[21]和其他技術(shù)的發(fā)展，改進(jìn)技術(shù)細(xì)節(jié)，降低成本， 蛋白質(zhì)芯片存在的問題將逐步得到解決。 將逐步實現(xiàn)它對人類蛋白質(zhì)組學(xué)、 醫(yī)學(xué)研究、藥物開發(fā)和臨床診斷的巨大推動作用。 特別是隨著人類基因組計劃的完成， 以研究蛋白質(zhì)功能為重點的后基因組時代已拉開序幕， 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)將從根本上改變生物學(xué)和生物技術(shù)的觀點和效率，為生命科學(xué)的發(fā)展做出卓越貢獻(xiàn)[22-24] 。參考文獻(xiàn)1Gygi．S．P．，RochonY，F(xiàn)ranzaBReta1．CorrelationbetweenproteinandmRNAabundanceinyeast．Mo1．CellBiol．1999,19(3)：1720—1730.2AlbalaJS．Array-basedproteomics：thelatestchipchallenge[J]．ExpertRevMolDiagn，2001，1(2)：145-152．3MouradianS．Lab-on-a-chip：applicationsinproteomics[J]．CurtOpinChemBiol，2002，6(1)：51-56．4李瑤．基因芯片與功能基因組 [M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2004:32-34.5StollD ，eta1．Proteinmicroarraytechnology ．FrontBiosci 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