ELISA方法檢測雞蛋中的氯霉素

ELISA方法檢測雞蛋中的抗生素趙蘭青，鄧明鏡，高陽

（北京科技大學(xué)，化學(xué)與生物工程學(xué)院，生技0901班，100083）［摘要］建立了以間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法為基礎(chǔ)，經(jīng)過包被抗原，加氯霉素標準品溶液和待測樣品溶液后，再加抗體，然后加酶標記二抗和反應(yīng)底物，最后加終止液后測量490nm下吸光度值等操作步驟后，測定了氯霉素濃度的檢測下限為5ng/mL，定量范圍為：5-50ng/mL。氯霉素濃度的對數(shù)值Logi。（vtg）與結(jié)合率B/Bo（%）的標準曲線方程為：y=-45.952X+115.48,R2=0.9943,根據(jù)0-50ng/mL相對應(yīng)的曲線計算了未知樣的濃度vtgS1=1.199ng/mL,vtgS2=386.1ng/mL,但是與實際濃度相差較大，且回收率異常。最后對實驗結(jié)果和干擾因素進行了分析,以及對失敗原因的探索,并進一步研究了實驗條件的優(yōu)化。［關(guān)鍵詞］間接競爭ELISA方法氯霉素 分光光度法引言ELISA屬于標記免疫學(xué)技術(shù)的一種,1971年由瑞典的EngVall和荷蘭VanWeeman等人提出，1974年Voller等用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為吸附載體吸附抗體（抗原），再與相應(yīng)的酶標記物結(jié)合，使ELISA操作更方便、易重復(fù)，靈敏度可高達ng至pg,因而成為生物化學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)檢驗的常規(guī)測定方法之一；原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。因為其操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在食品安全和衛(wèi)生檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。ELISA常用的測定方法主要有直接法和間接法兩種：直接法是酶標記抗體與待檢測樣本中固相抗原直接作用，加入底物后，顯色；間接法是使已知抗原吸附在固相載體上，與待檢測樣本中的抗體作用，再加入酶標記抗同種動物抗體的免疫球蛋白（二抗），使與特異抗原抗體復(fù)合物的抗體作用，加入酶底物，顯色。ELISA有許多改良方法，如夾心法、雙抗夾心法、競爭法、酶—抗酶法和均質(zhì)法等。常用方法大致可分為三類：（a）測定抗體的間接法；（b）測定抗原的雙抗夾心法；（c）測定抗原的競爭法。前兩種方法主要用于測定抗體和大分子抗原，適用于臨床診斷上，而競爭法是測定小分子抗原的方法，因而尤其適用于食品分析。本實驗旨在建立一種簡單、快速、回收率高的氯霉素含量測定方法，改良優(yōu)化其方法步驟，以節(jié)約實驗室檢測的費用及檢測的時間，并進一步應(yīng)用于食品安全檢測。實驗部分2.1試劑與器材2.1.1試劑抗體：鼠抗氯霉素（CAP）單克隆抗體抗原：CAP-BSA酶標記抗體（二抗）：HRP-羊抗鼠樣品：雞蛋緩沖液：1） 包被液：0.05mol/LpH9.6碳酸緩沖液（Na2CO30.159克，NaHCO30.294克，蒸餾水稀釋至100mL）。2） 洗滌及稀釋液：0.01mol/LpH7.4PBST溶液。（NaCI8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，Tween—20,0.5mL.蒸餾水加至1000mL）。3） 底物溶液：先配制pH5.0檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液。取0.1mol/L檸檬酸溶液24.3mL，加0.2mol/L（27.4g/L）NaHPO4溶液25.7mL，再加蒸餾水50mL，然后將80mg鄰苯二胺溶解其中，再加30%H2O20.20mL即可應(yīng)用，用時新鮮配制、避光。4） 終止液：2mol/LH2SO4。2.1.2器材聚苯乙烯微量反應(yīng)板（96孔），可調(diào)式微量吸液器（200uL），八道可調(diào)式移液器，培養(yǎng)皿，小燒杯，隔水式恒溫箱，酶聯(lián)免疫檢測儀2.2實驗步驟包被抗原用包被液將抗原稀釋為2ug/mL，每孔加150uL，4°C冰箱放置16~18小時。洗滌倒盡板孔中液體，加200uL洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。封閉用稀釋液將BSA稀釋成濃度為200ug/mL溶液，每孔加150uL，37C放置1小時。洗滌倒盡板孔中液體，加200uL洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。加標準品用稀釋液將氯霉素標準品稀釋成0.2ng/mL至100ng/mL溶液，每孔50微升。同時作稀釋液對照。（因為4.7中加入50uL抗體，所以氯霉素被稀釋為原濃度的1/2，即0.1ng/mL至50ng/mL）加被測液如下圖所示，加入被測樣，每孔50微升。表1酶標板上各孔的加樣設(shè)計123456789101112ABLKBLKBLKBLKBLKBBLK00SIBLKCBLK0.10.1SIBLKDBLK0.50.5S1BLKEBLK11S2BLKFBLK55S2BLKGBLK1010S2BLKHBLK5050BLKBLK（注：數(shù)字表示加氯霉素的濃度ng/mL，S1和S2分別表示待測樣1和待測樣2，BLK表示空白對照）2.2.7加抗體向各孔中加入50uL抗體（用洗滌液稀釋為200ng/mL）,37°C放置1小時。洗滌倒盡板孔中液體，加200uL洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。加二抗將二抗用稀釋液按1:5000稀釋，每孔100微升，放置37C1小時。洗滌倒盡板孔中液體，加200uL洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。加底物鄰苯二胺溶液加100微升，室溫暗處10—15分鐘。加終止液每孔加50微升H2SO4（2M）。觀察結(jié)果用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm讀數(shù)。結(jié)果與討論3.1標準曲線的繪制3.1.1酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm下吸光度表2酶聯(lián)免疫檢測490nm吸光度123456789101112A0.1250.0770.0790.0920.096B0.0840.8860.8770.8960.067C0.0880.8490.8770.8440.069D0.0880.8660.8710.8720.067E0.0980.8710.8340.1540.071F0.0920.7030.7670.150.075G0.0990.6440.6570.1660.089H0.1460.3710.3660.120.1113.1.2結(jié)合率B/B°(%)的計算隨機取5個空白的平均值(B5—F5),計算得平均值BLK=(0.067+0.069+0.067+0.071+0.075)/5=0.0698;氯霉素濃度為0時，其濃度的吸光度值OD0=(0.886+0.877)/2=0.8815;同理，其濃度為0.1-50ng/mL時，吸光度的平均值分別為：OD0.1=0.863OD0.5=0.8685OD1=0.8525OD5=0.735OD10=0.6505OD50=0.3685根據(jù)結(jié)合率B/B0(%)=(OD-Blank)/(OD0-Blank)X100,分別計算出結(jié)合率為：B/B0(%)—0.1=97.72B/B0(%)—0.5=98.40B/B0(%)—1=96.43B/B0(%)—5=81.95B/B0(%)—10=71.54B/B0(%)—50=36.803.1.3標準曲線的制作與優(yōu)化因為在溶液中，抗原與抗體結(jié)合率更傾向于與濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系，故繪制標準曲線時，應(yīng)以濃度的對數(shù)值為橫坐標。由以上數(shù)據(jù)得濃度的對數(shù)值Log】。(vtg)與結(jié)合率B/B0(%)的關(guān)系如下表：濃度(Vtg)(ng/mL)0.10.5151050Log10(vtg)-1-0.3010300.6989711.69897B/B0(%)97.7298.4096.4381.9571.5436.80我國關(guān)于樣品檢測下限的定義為：即相對于空白可檢測的最小樣品含量，也就是樣品最低檢測濃度。定義樣品檢測下限為三倍空白標準偏差，即3a空。本實驗中，可以依據(jù)標準曲線的線性程度判斷檢測下限。繪制標準曲線時，若橫坐標從Log】。(0.1)開始，將其繪成曲線圖，添加趨勢線和顯示公式，如下：

其B/Bo（%）幾乎全部接近于100,且數(shù)值隨Log】。（vtg）的變化不成線性，若橫坐標從Log10（0.5）或Log10（1）開始，其線性程度也不理想，說明0.1,0.5,1未達到檢測下限。R2=0.9243 R2=0.947經(jīng)過對個別點的取舍，曲線的線性程度提高，標準曲線(曲線4)方程：y=-45.952X+115.48，R2=0.9943。但是定量計算的范圍變窄(5-50ng/mL)，即只能檢測在此范圍內(nèi)濃度的氯霉素樣品。若結(jié)合率＞81.95或＜36.80，該標準曲線的參考價值不大。待測樣品中氯霉素含量的計算根據(jù)表2，待測樣品1吸光度的平均值ODS1=(0.896+0.844+0.872)/3=0.871;ODS2=(0.154+0.15+0.166)/3=0.157。所以相對應(yīng)的結(jié)合率為：B/B0(%)—S1=(ODsi-Blank)/(OD0-Blank)X100=(0.871-0.0698)/(0.8815-0.0698)X100=98.71;B/B0(%)—S2=(ODs2-Blank)/(OD0-Blank)X100==(0.157-0.0698)/(0.8815-0.0698)X100=10.74。但是兩個樣品的結(jié)合率均在精確定量范圍之外，為保證濃度最終結(jié)果的可靠性和科學(xué)性，根據(jù)曲線3的方程，計算得：Log10(vtgS1)=0.07896 vtgS1=1.199ng/mLLog10(vtgS2)=2.587 vtgS2=386.1ng/mL事實上,S1濃度vtgs1=0ng/mL,不在定量范圍之內(nèi)；S2濃度vtgs2=22ng/mL,在定量范圍內(nèi)。顯然偏差太大，這可能是由于稀釋過程中沒有規(guī)范操作等原因引起的。所以計算而出的濃度值參考價值不大?；厥章实挠嬎阋阎尤肼让顾貪舛萪=22ng/mL(S1濃度vtgs1=0ng/mL,S2濃度vtgs2=22ng/mL),回收率％=(S2-S1)/d*100%=1750.0%,回收率異常。正常的回收率應(yīng)在80%-120%之間，回收率偏差太大，已經(jīng)超出了正常偶然誤差的范圍，所以實驗中一定有紕漏。計算出得回收率意義不大。實驗結(jié)果及誤差分析本實驗中測出氯霉素的檢測下限為5ng/mL,其定量范圍為：5-50ng/mL。此范圍內(nèi)的標準曲線方程：y=-45.952X+115.48,R2=0.9943。但是總體數(shù)據(jù)較差，不能計算出待測樣的濃度,而且回收率異常,造成實驗失敗的影響因素：配置氯霉素標準溶液時，由于稀釋操作在微升水平上，濃度值易形成浮動而不準確，進而引起誤差；實驗中傾倒洗滌液時，動作不迅速，造成了相鄰孔的交叉污染；實驗過程中數(shù)據(jù)處理易受到環(huán)境等客觀因素的干擾，或是由于人為引起偶然誤差的負面影響。拱驗中可能由于實驗者用手觸摸了聚苯乙烯微量反應(yīng)板正面，因此部分孔中可能含有汗液等成分，干擾了吸光度值的最后測定。3.5影響ELISA測定結(jié)果的因素抗原在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來源和制備方法對實驗結(jié)果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。固相載體可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖酐、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。由于微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應(yīng)用。國產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板目前已大量應(yīng)用于ELISA測定，并且獲得了滿意的結(jié)果。但每批微量反應(yīng)板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質(zhì)有關(guān)。非特異性反應(yīng)干擾的排除除了設(shè)置稀釋液空白、陽性和陰性參比血清等對照外，可采用包埋、封閉等預(yù)處理，如在洗滌液和稀釋中加入牛血清白蛋白、明膠或吐溫—20等，以減少非特異性反應(yīng)的發(fā)生。高選擇性的單克隆抗體代替多克隆抗體也是提高ELISA特異性的另一有效途徑。酶和底物的選擇用于ELISA標記的酶，主要有辣根過氧化氫酶（HRP）、堿性磷酸酯酶（AP）、葡萄糖氧化酶和半乳糖苷酶等，而以HRP用得較多。酶底物本身要求無色，反應(yīng)后能穩(wěn)定呈色。一般HRP常采用鄰苯二胺（產(chǎn)物橘黃色，可穩(wěn)定呈色數(shù)小時）或鄰聯(lián)甲苯胺作酶底物；AP常用對硝基苯磷酸鹽作酶底物。3.6實驗條件的優(yōu)化3.6.1酶的底物的優(yōu)化HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：DH2+H2O2D+H2O上式中，DH2為供氫體，出。2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3,3‘，5te5'methylbenzidine,TMB）。OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，0PD?2HCL為水溶性。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02%H2O2的應(yīng)用液，只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。洗滌液的優(yōu)化洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。洗滌過程洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特