多糖分離純化及含量測定

多糖分離純化及含量測定第一頁，共五十八頁，2022年，8月28日多糖的提取方法1.溶劑提取法水提醇沉法、酸提法、堿提法、超臨界流體萃取法2.酶解提取法單一酶解法、復合酶解法3.強化提取法超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、高壓脈沖法第二頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.溶劑法：水提醇沉法多糖是極性大分子化合物，提取時應選擇水、醇等極性強的溶劑。水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。用水作溶劑來提取多糖時，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲漉，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分數(shù)達到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置一定的時間，多糖的質(zhì)量分數(shù)和得率均較高。第三頁，共五十八頁，2022年，8月28日影響多糖提取率的因素有：水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時間以及提取次數(shù)等。該種方法提取多糖不需特殊設備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時，提取率也不高。第四頁，共五十八頁，2022年，8月28日溶劑法：酸提法為了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基礎上發(fā)展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團的多糖在較低pH值下難以溶解；含有胺基的多糖可使用乙酸或鹽酸調(diào)節(jié)提取液成酸性進行提取，然后再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入銅鹽等生成不溶性絡合物或鹽類沉淀而析出。第五頁，共五十八頁，2022年，8月28日影響多糖提取率的因素有：水的用量、pH值、提取溫度、浸提固液比、提取時間以及提取次數(shù)等。由于H＋的存在抑制了酸性雜質(zhì)的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖產(chǎn)品純度相對較高；但在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，且酸會對容器造成腐蝕，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之處。第六頁，共五十八頁，2022年，8月28日溶劑法：堿提法有的酸性多糖,或分子量較大的多糖,在熱水中溶解度不大,一般在稀堿溶液中溶解度較大,所以常用稀的NaOH溶液或Na2CO3溶液提取。不過用稀堿溶液提取時,提取溫度必須保持在10℃以下,否則多糖容易發(fā)生降解反應。多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，例如粘多糖的提取多采用堿提取法。第七頁，共五十八頁，2022年，8月28日多糖堿法提取雖然可提高多糖的收率,且可縮短提取時間,但提取液中含有其它雜質(zhì)如蛋白質(zhì),粘度過大,過濾困難,且有些多糖在堿性較強時會水解。通常先用熱水法提取,然后殘渣再用稀堿溶液提取,這樣可將大部分多種類型的多糖提取出來。第八頁，共五十八頁，2022年，8月28日溶劑法：超臨界流體萃取法超臨界流體是指物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上時的狀態(tài)，這種流體兼有液體和氣體的特點，即密度大，粘稠度小，有極高的溶解，滲透到提取材料的基質(zhì)中，發(fā)揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大，提取結(jié)束后，再通過減壓將其釋放出來，具有保持有效成分的活性和無溶劑殘留等優(yōu)點。第九頁，共五十八頁，2022年，8月28日超臨界流體萃取技術是近年來發(fā)展起來的一種新的提取分離技術。由于CO2的超臨界條件（TC＝31.26℃，Tp＝7.38MPa）容易達到，常作為超臨界萃取的溶劑，在壓力為8～40MPa時的超臨界CO2

足以溶解任何非極性、中極性化合物，在加入夾帶劑后則可溶解極性化物。第十頁，共五十八頁，2022年，8月28日由于糖類的化合物分子量較大、羥基多、極性大，用純二氧化碳提取產(chǎn)率較低，加入夾帶劑或加大壓力則可提高提取率。該法的缺點是設備復雜，運行成本高，提取范圍有限。第十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日2.酶解法：單一酶解法單一酶解法是指使用一種酶來提取多糖，從而提高提取率的生物技術。其中經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、纖維素酶等。

蛋白酶對植物細胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用，使其結(jié)構(gòu)變得松散；蛋白酶還會使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們對原料的結(jié)合力，有利于多糖的浸出。第十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日纖維素酶則能特異性地降解纖維素，使植物細胞的細胞壁破裂，有利于多糖易從胞內(nèi)釋放。影響因素：酶種類和添加量、酶解溫度(℃)、酶解pH值、水解時間、料液比有直接關系。第十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日酶解法：復合酶解法復合酶解法采用一定比例的果膠酶、纖維素酶及中性蛋白酶，主要利用纖維素酶和果膠酶水解纖維素和果膠，使植物組織細胞的細胞壁破裂，釋放細胞壁內(nèi)的活性多糖，多糖釋放的多少和復合酶的加入量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值及料液比有直接的關系。酶解法提取的實質(zhì)是通過酶解反應強化傳質(zhì)過程。該法具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點。第十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日3.物理強化法：超聲波輔助提取法超聲波是頻率高于20kHz的聲波，它方向性好，穿透能力強，易于獲得較集中的聲能。超聲波提取是利用超聲波的機械效應、空化效應及熱效應。機械效應可增大介質(zhì)的運動速度及穿透力，能有效的破碎生物細胞和組織，從而使提取的有效成分溶解于溶劑之中；第十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日空化作用,形成高溫和高壓的環(huán)境,增加物質(zhì)分子運動的頻率和速度、溶劑的穿透力,從而加速目標成分進入溶劑,提高提取率。熱效應增大了有效成分的溶解速度，這種熱效應是瞬間的，可使被提取成分的生物活性盡量保持不變。影響因素有：超聲波的頻率、功率、溫度、時間、料液比、超聲波發(fā)生器的型式。第十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日超聲提取可極大地提高提取效率,節(jié)約溶劑,避免高溫對提取成分的影響,與常規(guī)提取法相比,具有提取時間短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點。值得注意的是超聲時間不宜過長,否則提取量反而下降,原因可能是由于超聲處理時間過長,導致多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,糖鏈斷裂,使多糖提取含量下降。第十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日物理強化法：微波輔助提取法微波是指波長在1mm到1m范圍（相對頻率為300~300000MHz）的電磁波，介于紅外與無線電波之間。微波協(xié)助萃取植物藥材時，一方面是利用微波透過萃取劑到達物料內(nèi)部，由于物料腺細胞系統(tǒng)含水量高，水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量的熱量，所以能快速被加熱，使胞內(nèi)溫度迅速升高，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞。第十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日進一步加熱，導致細胞內(nèi)部和細胞壁水分減少，細胞收縮，表面出現(xiàn)裂紋。孔洞或裂紋的存在使胞外溶劑容易進入細胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)有效成分，再擴散到萃取劑中；第十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日另一方面，在固液萃取過程中，固體表面的液膜通常是由極性強的萃取劑所組成，在微波輻射作用下，強極性分子將瞬時極化，并以每秒2.45×109次的速度做極性變換運動，這就可能對液膜層產(chǎn)生一定的微觀“擾動”影響，使附在固相周圍的液膜變薄，溶劑與溶質(zhì)之間的結(jié)合力受到一定程度的削弱，從而使固液浸取的擴散過程所受的阻力減小，促進擴散過程的進行。第二十頁，共五十八頁，2022年，8月28日在微波協(xié)助浸取過程中，萃取劑種類、微波劑量、物料含水量、溫度、萃取時間及pH值等都對萃取效果產(chǎn)生影響。其中，萃取劑種類、微波作用時間和溫度對萃取效果影響較大。微波輔助提取多糖和其他的萃取方法比較，微波萃取效率高，操作簡單，且不會引入雜質(zhì)，多糖純度高，能耗小，操作費用低，符合環(huán)境保護要求，是很好的多糖提取方法。第二十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日物理強化法：高壓脈沖法高壓脈沖法是對兩電極間的流態(tài)物料反復施加高電壓的短脈沖（典型為20～80kV/cm）進行處理。動物、植物、微生物的細胞，在外加電場作用下，產(chǎn)生橫跨膜電位，絕緣的生物膜由于電場形成了微孔，通透性發(fā)生變化，當整個膜電位達到極限值(約為1V)時，膜破裂，膜結(jié)構(gòu)變成無序狀態(tài)，形成細孔，滲透能力增強。電位差達到臨界點，細胞破裂。從而有利于多糖的提取。第二十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日二、多糖的分離純化1.除蛋白

Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法2.色素的去除吸附法（DEAE-纖維素、硅藻土等）、氧化法（過氧化氫）、離子交換法3.多糖的純化超濾法、季胺鹽沉淀法、柱層析法和色譜法等第二十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日1.除蛋白采用醇沉或其它溶劑沉淀得到的粗多糖中常含有較多的蛋白質(zhì),需要除蛋白。除蛋白的方法傳統(tǒng)上有Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等。第二十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日Sevage法根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中變性的特點，用V(氯仿)∶V(戊醇或正丁醇)為5∶1或4∶1，混合物劇烈振搖20～30min，蛋白質(zhì)變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。一般按多糖水溶液的1/5~1/4體積加入。第二十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日此種方法只能除去少量蛋白質(zhì)，須反復多次，多糖有損失，得率不高,且氯仿對人體也有一定毒性,操作時應注意。該法優(yōu)點是條件溫和,可避免多糖的降解。利用蛋白酶可水解蛋白質(zhì)的特性,在多糖樣品溶液中加入一些蛋白質(zhì)水解酶如中性蛋白酶和糜蛋白酶,再用Sevage法效果更佳。此法不能除去脂蛋白，因為脂蛋白溶于氯仿。第二十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日三氯乙酸法三氯乙酸是一種有機酸，使多糖提取液中的蛋白質(zhì)與有機酸作用而變性沉淀。該法是在多糖水提液中滴加5%～10%與多糖水提取液等體積的三氯乙酸，混勻靜置過夜，離心除去膠狀沉淀，重復以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，得無蛋白質(zhì)的多糖。第二十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日三氯乙酸濃度越大，除蛋白質(zhì)效果越好，但對多糖的影響也越大，可能是三氯乙酸對多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作用，使多糖降解，而且這種破壞作用隨著三氯乙酸濃度增大而增強。第二十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日三氟三氯乙烷法將多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫攪拌10min左右，離心分離得上層水層，水層繼續(xù)用上述方法反復處理幾次，得無蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率較Seavg法高，但溶劑沸點低，易揮發(fā)，不宜大量應用。第二十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日2.色素的去除中草藥來源的多糖,可能含有酚型化合物而顏色較深,這類色素大多呈負性離子,不能用活性炭吸附劑脫色,可以用弱堿性樹脂DEAE-纖維素來吸附色素，這樣不僅可以達到脫色的目的,而且可以進行多糖的分離。若多糖與色素結(jié)合,易被DEAE纖維素吸附,不能被水洗脫,這類色素可用低溫氧化法脫色，溫度較高下氧化易引起多糖的降解。

第三十頁，共五十八頁，2022年，8月28日對于同時含有游離蛋白質(zhì)和色素的多糖,可通過生成金屬絡合物的方法以同時除去蛋白和色素,方法是加入菲林試劑、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等與多糖生成不溶性絡合物,經(jīng)分離后用陰離子交換樹脂分解絡合物得到多糖。第三十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日3.多糖的純化

超濾法季胺鹽沉淀法柱層析法色譜法其他方法第三十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日超濾法膜分離技術（membraneseparationtechnology，MST）是一種高效分離技術，分離過程以選擇透過性膜作為分離介質(zhì)，通過在膜兩側(cè)施加某種推動力（壓力差、化學位差、電位差等），使原料液中組分有選擇性的通過膜。目前應用較多的是超濾和微濾技術。如采用中空纖維超濾膜,對多糖去蛋白質(zhì)后的提取液通過超濾去除小分子雜質(zhì)。第三十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日季胺鹽沉淀法季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑,可與酸性糖形成不溶性沉淀,常用于酸性多糖的分離。當溶液的pH值增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高,也會與中性多糖形成沉淀。常用的季銨溴化物(CTAB)及其氫氧化物(CTA-OH)和十六烷基氯化吡啶(CPC),其濃度一般為1%~10%(W/V),它們可在酸性、中性、微堿性和堿性中分級沉淀分離出酸性多糖。第三十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日柱層析方法纖維素柱層析陰離子交換柱層析凝膠柱層析親和層析第三十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日纖維素柱層析柱中的載體是纖維素。先用乙醇液將柱內(nèi)纖維素平衡好,然后將多糖混合物全部沉淀于惰性的纖維素上面。用不同濃度乙醇水溶液(如80%,60%,40%,20%)梯度洗脫,則不同多糖就依次洗脫出來。先洗脫的是分子量最小的多糖,最終洗脫的是分子量最大的多糖。在洗脫過程中,由于各種多糖在柱上進行無數(shù)次的溶解和沉淀過程,最終將各種多糖分離開來。第三十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日這種方法實質(zhì)上與分步沉淀法相反,可稱其為分步溶解法。其理論塔板數(shù)較高,所以流出液的純度高。但該法的缺點是流速慢,純化周期長,特別是對于粘度較大的酸性多糖,更顯得流速過慢。第三十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日陰離子交換柱層析至今應用最廣泛的陰離子交換劑有二乙基氨基乙基纖維素(DEAE-cellulose),DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)及DEAE-瓊脂糖(DEAE-Sepharose)三種,其中以DEAE-cellulose應用得最廣泛。DEAE-cellulose具有開放性的骨架,多糖能自由進入載體中并進行迅速擴散。它有較大的比表面積,雖然其離子交換容量僅為0.70~0.75mmol/g,但其對多糖的吸附量較離子交換樹脂大許多。

第三十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日陰離子交換柱層析是目前多糖純化中（也是柱層析中）應用最普遍的一種方法,特別是對于體積較大的多糖溶液,大多數(shù)首先采用陰離子交換柱層析。通過柱層析,多糖溶液得到濃縮及初步純化(有的多糖通過該步驟即可得到各種均一多糖組分)。第三十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日由于纖維素上的離子交換基團較少,排列疏散且呈弱堿性,所以對大分子的吸附較弱,用一定離子濃度的鹽就可將其洗脫下來。陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖。它的分離機理包括離子交換,而更重要的是吸附與解吸附,所以其不僅可應用于中性多糖與酸性多糖的分離,也可應用于不同中性多糖的分離。第四十頁，共五十八頁，2022年，8月28日凝膠柱層析根據(jù)多糖分子的大小和形狀的不同即按分子篩的原理進行分離的。凝膠柱層析在多糖的分離純化上應用得很普遍。通常在獲得粗多糖后,先用陰離子交換柱層析、透析、干燥,溶解后再用凝膠柱層析。凝膠柱層析是目前植物多糖最常用的高級純化方法。第四十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日常用的凝膠有各種型號的交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)、瓊脂糖凝膠(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝膠(Bio-gel)三大類，以及后來在這些凝膠上進行性能改良的新一代凝膠,如Sephacryl、Superdex和Superose等。展開劑為各種濃度的鹽溶液及緩沖溶液,離子強度最好不低于0.2mol/L(否則拖尾嚴重)。第四十二頁，共五十八頁，2022年，8月28日親和層析某些特定多糖具有和某些相對應的專一分子可逆結(jié)合的特性,如一種凝集素(刀豆球蛋白)能專一地與分支多糖結(jié)合。分子之間的這種結(jié)合能力稱為親和力,使它們結(jié)合后再將其解離,可以純化多糖。第四十三頁，共五十八頁，2022年，8月28日把欲分離的可親和的一對分子的一方作為配基(ligand)與不溶性載體結(jié)合使固定化,裝入色譜柱(親和柱),然后把含有欲分離的多糖溶液作流動相,這時溶液中只有能和配基具有親和力的多糖分子被結(jié)合而吸附,其他多糖則流出柱外,然后再改變流動相的離子強度及pH,使配基與多糖解離,則被純化的多糖就流出柱外。第四十四頁，共五十八頁，2022年，8月28日其他方法分級沉淀法大多數(shù)活性多糖可溶于水，3個碳以下的多糖還可溶于乙醇，隨著聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐漸降低。根據(jù)這一性質(zhì)可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的體積濃度逐漸增加到50，100，200，900mL/L，從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析出。第四十五頁，共五十八頁，2022年，8月28日如在五味子多糖提取液中加入無水乙醇，使其體積分數(shù)分別達到10%，30%，45%，65%，進行分級沉淀，最后將剩余的母液直接蒸發(fā)濃縮，得到5個分級的五味子多糖組分。第四十六頁，共五十八頁，2022年，8月28日三、多糖含量的測定方法多糖含量測定常規(guī)方法是以無水葡萄糖為對照品,采用苯酚-硫酸法,或者蒽酮-硫酸法。上述兩種方法由于操作簡單,試劑容易獲得而在多糖含量測定中被廣泛采用。第四十七頁，共五十八頁，2022年，8月28日苯酚-硫酸法的原理多糖在硫酸存在下先水解成單糖,再脫水生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。由五碳糖生成的是糠醛,甲基五碳糖生成的是5-甲糠醛,六碳糖生成的是5-羥甲糠醛。糠醛酸在此條件下往往脫羧,并生成糠醛?？啡┘捌溲苌锖捅椒涌s合成有色物質(zhì),在480nm處有最大吸收,吸收值與糖的含量呈線性關系。第四十八頁，共五十八頁，2022年，8月28日蒽酮-硫酸法的原理蒽酮-硫酸法其原理是糖類與濃硫酸在沸水浴中迅速脫水生成糠醛或其衍生物,再與蒽酮試劑縮合,形成藍綠色溶液,在620nm處有最大吸收,吸收值與糖的含量呈線性關系。第四十九頁，共五十八頁，2022年，8月28日這兩種方法也存在較為嚴重的缺陷:首先,葡萄糖是單糖,而植物多糖的組成是多樣的,只用葡萄糖作為參照不確切;其次,顯色試劑的不專屬,單糖的干擾嚴重,實際上測得的結(jié)果是總糖的結(jié)果。在未嚴格純化的植物多糖樣品中,這種情況更為普遍。第五十頁，共五十八頁，2022年，8月28日為排除還原性單糖的干擾,可采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)比色法測定還原糖含量。其原理是在堿性溶液中,3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色氨基化合物,在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應液的顏色強度呈比例關系。再將通過硫酸-苯酚法或者蒽酮-硫酸法得到的總糖結(jié)果減去還原糖,即得較準確的多糖含量。第五十一頁，共五十八頁，2022年，8月28日糖醛酸含量測定糖醛酸