紫外分光光度法與紫外分光光度計(jì)的選購(gòu)

紫外分光光度法

與

紫外分光光度計(jì)的選購(gòu)主要內(nèi)容紫外可見光譜法應(yīng)用及其發(fā)展用好紫外可見分光光度計(jì)紫外可見光分光光度計(jì)的選購(gòu)體會(huì)一、紫外可見光譜法應(yīng)用及其發(fā)展UV-VIS波長(zhǎng)范圍190-400nm紫外區(qū)400-750nm可見區(qū)750-1100nm近紅外區(qū)吸收光譜來源吸收光度法：當(dāng)一束連續(xù)光源通過單色器，被分解為各個(gè)波長(zhǎng)單色光，單色光通過樣品后被選擇性吸收，用光檢測(cè)器給予記錄不被吸收的透過光，形成的圖像就是吸收光譜選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的吸收是選擇性的，利用被測(cè)物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)的光的吸收來了解物質(zhì)的特性，這就是光譜法的基礎(chǔ)。有機(jī)化合物的紫外—可見吸收光譜是三種電子躍遷的結(jié)果：σ電子、π電子、n電子。峰型及強(qiáng)度最大吸收波長(zhǎng)峰寬強(qiáng)度吸收光譜強(qiáng)度I0＝Ｉa+It+IrT%（透射率）＝It/I0×100%A=-lgT定量基礎(chǔ)——比爾定律A（λ）＝-lgT=ε（λ）×L×C

ε：摩爾吸光系數(shù)，是物質(zhì)對(duì)特定波長(zhǎng)光吸收能力的量度，其物理意義是1mol單位濃度1cm單位光程時(shí)的吸光度。

L：光程

C：濃度成立條件： 單色光、澄清的稀溶液

K由于共軛性吸收帶，起因與多烯、烯酮等B由于苯（環(huán)）性，起因于芳香族、雜芳香族化合物，有時(shí)候尚能顯示精細(xì)結(jié)構(gòu)R由于自由基性吸收、起因于CO、NO2等發(fā)色基團(tuán)苯環(huán)、酰基……CCH3On→p*p

→p*紫外可見分光光度計(jì)的主要應(yīng)用（1）定性分析（參加）（2）結(jié)構(gòu)分析（參加）（3）純度檢查

例如：CCl4中有無CS2，只要看318nm處的吸收峰；乙醇中是否含苯，只要看256nm的強(qiáng)吸收峰（4）定量分析（Beer定律，主要應(yīng)用）

例如：Cr6+測(cè)定；水中氨氮測(cè)定、土壤有效硼、維生素C……（5）動(dòng)力學(xué)分析

例如：測(cè)定反應(yīng)速度常數(shù)、測(cè)定催化效率、酶催化……UV-VIS的應(yīng)用及其最新進(jìn)展新發(fā)展之一——應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大

藥品檢驗(yàn)、醫(yī)療衛(wèi)生、化學(xué)化工、環(huán)保、地質(zhì)、冶金、石油、食品、生命科學(xué)、材料科學(xué)、計(jì)量科學(xué)等科研、教學(xué)及生產(chǎn)中，使用最多、覆蓋面最廣的分析儀器。新發(fā)展之二——許多分析方法衍生出專業(yè)的分析儀器：

水質(zhì)COD分析，水質(zhì)總氮分析，全自動(dòng)生化分析儀，膜厚分析儀，白度分析儀器，快速成像儀，農(nóng)殘快速分析儀、葉綠素分析儀、黑碳儀等等AethalometerTM

黑碳儀

新發(fā)展之三——新方法的應(yīng)用

——化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展（1）褶合光譜軟件包（ConvelutionSpectrum）第二軍醫(yī)大學(xué)吳玉田教授?？梢詫?duì)樣品不經(jīng)過分離，直接應(yīng)用紫外可見光度計(jì)分析含有6個(gè)不通組分的試樣，這一發(fā)明，對(duì)藥物分析工作來說，是一個(gè)重大突破，引起了國(guó)內(nèi)外廣泛注意。（2）PE公司Quset軟件包，與Lambda9紫外可見分光光度計(jì)聯(lián)用，可直接分析10個(gè)組分。（3）高階張量數(shù)據(jù)解析復(fù)雜黑白灰體系分析湖南大學(xué)俞洳勤院士，。（4）PLS、因子分析、遺傳算法……（5）導(dǎo)數(shù)光譜的應(yīng)用新發(fā)展之——多分析聯(lián)用技術(shù)生命物質(zhì)等聯(lián)用技術(shù)，HPLCDNA/蛋白質(zhì)分析流動(dòng)注射分析FIA聯(lián)用積分光度法的復(fù)興——積分球應(yīng)用、材料、太陽能譜、固體粉末表面性質(zhì)研究，突破了以液體為分析對(duì)象的局限，極大的擴(kuò)展了分析領(lǐng)域紫外可見分光光度計(jì)的組成（1）光源（2）單色器（3）吸收池（4）檢測(cè)器紫外可見分光光度計(jì)的分類1.單光束:一束單色光,一只比色皿,一只光電轉(zhuǎn)換器 優(yōu)點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,價(jià)格便宜 缺點(diǎn):光度準(zhǔn)確度等主要技術(shù)指標(biāo)比較差,故分析誤差較大.(因雜散光,光源波動(dòng),電子學(xué)的噪聲等都不能抵消)

注:一般要求較高的制藥行業(yè)、檢驗(yàn)行業(yè)、科研等行業(yè)不適宜。2.準(zhǔn)雙光束:二束光，只有一只比色皿。其中，一束光通過比色皿，另一束光不通過比色皿（這束光主要起抵消光源波動(dòng)對(duì)分析誤差影響的作用）

優(yōu)點(diǎn):結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單,價(jià)格較便宜，光度準(zhǔn)確度等指標(biāo)較單光束儀器好。3.雙光束：二束光，二只比色皿，一只或二只光電轉(zhuǎn)換器（以一只光電轉(zhuǎn)換器常見）如1810D系列和19系列 優(yōu)點(diǎn):光度準(zhǔn)確度等主要技術(shù)指標(biāo)好,分析準(zhǔn)確度高 缺點(diǎn):結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價(jià)格較貴?！髁骷夹g(shù)4.雙波長(zhǎng)：采用兩個(gè)單色器 優(yōu)點(diǎn)：主要適用于試樣的多組分測(cè)量?！呀?jīng)很少見單光束雙光束近十年來，紫外/可見分光技術(shù)變化不大，始終沒有革命性的突破。然而，隨著光學(xué)設(shè)計(jì)、電子技術(shù)和軟件的進(jìn)步，使得儀器的復(fù)雜性降低，可靠性和分析效能提高，這些都說明傳統(tǒng)儀器也在不斷發(fā)展。高性能新器件的發(fā)展，例如氙燈光源、CCD/PDA檢測(cè)器、光纖探頭附件儀器新進(jìn)展

目前國(guó)際上的高檔紫外儀器：

PElamda900/950（S.L.7×10－7，N±0.00005A

（P-P））

熱電Evolution300（S.L.8×10－7，N±

0.0002A

（P-P））

VarianCary5000i（S.L.5×10－7，N±

0.0002A

（P-P））日立U-3200（S.L.5×10－6，N×）

U-3400（S.L.1×10，N×）島津UV-3101PC（S.L.1×10－6，N×）

UV-2401PC（S.L.1.5×10－4，N×）北京普析通用

TU-1901（S.L.1×10－4，N±00035A（P-P））國(guó)際高檔紫外可見分光光度計(jì)發(fā)展

向5個(gè)方向追求：

（1）更低的雜散光

（2）更小的儀器噪聲

（3）向小型化、專業(yè)化發(fā)展

（4）附件的開發(fā)與發(fā)展

（5）向短波、長(zhǎng)波擴(kuò)展175～3300nm（1）雜散光定義：?jiǎn)紊黝~定通帶以外的透射輻射能量與總的透射能量之比，也就是光譜通帶以外“不要的”光通量就是雜散光。測(cè)定方法：標(biāo)準(zhǔn)濾色片法

或NaI(220nm)、NaNO2(340nm)溶液。重要性：是分析誤差的主要來源之一，它直接限制了被分析測(cè)試樣品濃度的上限雜散光與吸光度相對(duì)誤差例：

如對(duì)某生物酶檢測(cè)：

它的吸光度為1.95Abs，要求1%誤差；如果儀器的S.L.=0.2%（0.002s），行不行？不行！因其誤差為3.6%！只有S.L.=0.05%（0.005s），才可達(dá)1%！雜散光的影響，會(huì)使分析測(cè)試的結(jié)果偏離比爾定律雜散光對(duì)測(cè)量線性的影響實(shí)驗(yàn)技巧 因?yàn)殡s散光強(qiáng)度在邊緣波段比較大，所以在波長(zhǎng)小于220nm測(cè)試時(shí)，必須認(rèn)真檢查有無“假峰”出現(xiàn)。定義：一種隨時(shí)間而變化、但又是隨機(jī)的輸出信號(hào)。測(cè)定方法：開機(jī)預(yù)熱、500nm處時(shí)間掃描120秒，測(cè)定P-P值，注意不是RMS值！主要來源：光學(xué)系統(tǒng)、光源、檢測(cè)器、電子元器件及電路設(shè)計(jì)等。重要性：是分析誤差的主要來源之一，它直接限制了被分析測(cè)試樣品濃度的下限。（2）噪聲噪聲與吸光度相對(duì)誤差和吸光度真值的關(guān)系例如，某紫外可見風(fēng)光光度計(jì)的噪聲N=0.002A，在測(cè)試某樣品吸光度真值為0.1A。

則△A/A0=0.002/0.2×100%=2%

即由儀器噪聲引起的相對(duì)誤差則達(dá)到2%水平比較表廠商型號(hào)

PhotometricAccuracy(光度準(zhǔn)確度)StrayLight（雜散光）PhotometricNoise（噪聲）Draft（基線漂移）BaselineFlatness（基線平直度）日本ShimadzuUV-310PC＋0.002A(0-0.5A)＋0.004A(0.5-1A)+0.3%T0.0001%(220nm)0.0001%(340nm)NotListed0.0004A/h2H后±0.001A(210-800nm)SBW2nm日本ShimadzuUV-2401PC+0.002A(0-0.5A)＋0.004A(0.5-1A)+0.3%T(0-100%T)0.015%(220nm)0.015%(340nm)NotListed0.0004A/h2H后±0.001ASBW2nm低速掃描中國(guó)普析通用TU－1901+0.002A（0-0.5A）＋0.004A(0.5-1.0A)+0.3%T(0-100%T)0.01%(220nm,340nm)+0.00035A500nm,0A,SBW2nm0.0004A/h2h后，500nm，SBW2nm±0.001A(200-850nm)SBW2nm0A中、慢速掃描技術(shù)指標(biāo)比較表主要技術(shù)指標(biāo)TU-1901中國(guó)普析通用Cary50美國(guó)VarianU-3010日本日立2401PC日本島津波長(zhǎng)范圍190-900nm190-1100nm190-900nm190-900nm波長(zhǎng)準(zhǔn)確度+

0.3nm+0.5nm+0.3nm+0.3nm光譜帶度0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0nm1.5nm（固定）0.1,0.5,1,2,4,5nm0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0nm雜散光0.01%T(220nm)0.005%T(220nm)0.015%T(220nm)0.015%T（220nm）光度準(zhǔn)確度+0.002A(0-0.5A)+0.004A(0.5-1A)+0.005A(1A處)+0.004A(1A處)+0.004A(1A處)光度噪聲+0.0004A（P-P值）500nm.0A0.0001A，RMS，500nm,0A0.0001A，RMS，500nm,0A未給出基線漂移0.0004A/h;500nm,0A,預(yù)熱2h0.0004A/h;500nm,預(yù)熱30分鐘0.0004A/h;340nm0.0004A/h;500nm,0A預(yù)熱2h基線平直度+0.001A;SBW2nm190-900nm+

0.001A200-850nm+

0.001A200-850nm+

0.001A200-850nm光檢測(cè)器光電倍增管（PMT）2個(gè)硅光電二極管光電倍增管（PMT）光電倍增管（PMT）（3）儀器向小型化、專業(yè)化發(fā)展由于環(huán)境、野外、海油等分析現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試的需要，開發(fā)專業(yè)的便攜儀器成為一種趨勢(shì)。國(guó)際上已經(jīng)有好多制造商正在研究開發(fā)適合于各種不同使用對(duì)象的小型儀器。美國(guó)OceanOpticPC2000卡式分光光度計(jì)；USB接口的USB2000微型光度計(jì)；

美國(guó)CID公司CI700；

普析通用公司PORS15；

美國(guó)HACH公司DR2400/DR2500

農(nóng)殘速測(cè)儀器

PORS15水質(zhì)分析儀USB2000SPAD-502葉綠素儀器農(nóng)殘分析儀（4）附件的開發(fā)與發(fā)展附件的開發(fā)成為儀器發(fā)展的主要內(nèi)容之一，附件的增加滿足了很多客戶特殊的測(cè)量要求。二、用好紫外可見分光光度計(jì)紫外方法分析應(yīng)用中值得注意的幾個(gè)問題暗電流：直接造成光度準(zhǔn)確度不好，測(cè)定誤差大。包括儀器的電路部分的固有的暗電流；由于光學(xué)系統(tǒng)密封不好以及樣品室密封不好進(jìn)來的光照到接收器上產(chǎn)生的電流。校正條件：重裝軟件；電壓變化；環(huán)境發(fā)生變化；發(fā)現(xiàn)光度準(zhǔn)確度有差異。2.重復(fù)性不好：首先要檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性和噪聲是否合格。如不合格，檢測(cè)電壓是否穩(wěn)定、是否可靠接地；石英比色皿與玻璃比色皿混用。比色皿不干凈。比色皿制作質(zhì)量揮發(fā)性強(qiáng)的有機(jī)溶劑要加蓋。溶液本身的問題。比色皿3、正確使用參比溶液與空白工作曲線中參比（空白）有好多種，如溶劑參比，試劑參比，樣品參比，褪色參比等等應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇不同的參比溶液。

（1）如果被測(cè)試液、顯色劑及所用的其它試劑均無顏色，可選用蒸餾水做參比溶液。

（2）如果顯色劑有顏色而被測(cè)試液和其它試劑無色時(shí)，可用不加被測(cè)試液的顯色劑溶液作參比溶液。

（3）如果顯色劑無顏色，而被測(cè)試液中存在其它有色離子，可用不加顯色劑的被測(cè)試液作參比溶液。

（4）如果顯色劑和被測(cè)試液均有顏色，可將一份試液加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，將被測(cè)組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑和其它試劑均按照操作手續(xù)加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。4、光譜帶寬的選擇

儀器分辨能力的指標(biāo)，是分析誤差的主要來源之一

Owen提出：紫外可見分光光度計(jì)的光譜帶寬應(yīng)該小于等于自然帶寬1/10時(shí)，分析準(zhǔn)確度可達(dá)99.5%

儀器帶寬nm儀器帶寬/自然帶寬Aobs/A△A△A/A×100%0.40.020.99950.00040.0520.10.9950.00390.4650.250.9710.02452設(shè)自然帶寬為20nm，實(shí)測(cè)A=0.85Abs例：我國(guó)藥典規(guī)定對(duì)青霉素鈉測(cè)試使用1nm光譜帶寬。使用原則：在一定條件下，吸光度隨光譜帶寬變化，以獲得最大吸光度值的帶寬為準(zhǔn)，同時(shí)考慮噪聲帶來的影響帶寬nm210.30.2吸光度Abs0.8050.8250.8650.823誤差%6.94.6

4.95、分析波長(zhǎng)的選擇與動(dòng)態(tài)范圍

1、波峰最靈敏、誤差較小

2、肩峰要求儀器波長(zhǎng)準(zhǔn)確度好

三、紫外可見光分光光度計(jì)選購(gòu)體會(huì)國(guó)內(nèi)外的生產(chǎn)廠家和主要產(chǎn)品歐美

PELambda750

，850，950等系列

熱電Evolution300/600

等系列

德國(guó)耶拿

SPECORD200

，SPEKOL1300

等系列

瓦里安

CARY50,CARY5000等系列

……日本

島津UV-1700，MultiSpec-1500UV-3150等系列

日立U-1800，U-2800，U-3310，U-4100

……國(guó)內(nèi)普析通用1901系列1810系列T6系列

瑞利UV-2100

等系列

尤尼柯UV-3802

等系列

萊伯泰科

LabTechUV-1000/1100系列

上海精科UV762等系列

……Lambda950

六性：適用性可靠性智能性經(jīng)濟(jì)性美學(xué)性工藝性李昌厚《紫外可見分光光度計(jì)》

化學(xué)工業(yè)出版社1、適用性：S.L.：濃度大的試樣（食品、農(nóng)科等領(lǐng)域重要）N：生化、海洋等領(lǐng)域SBW：2nm（藥典）；固定、可調(diào)

2、可靠性：狹義——故障率、可靠性設(shè)計(jì)。廣義——光度準(zhǔn)確度PA、故障、售后