不同濃度醫(yī)用臭氧對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞

不同濃度醫(yī)用臭氧對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的體外觀察內(nèi)容研究的意義和主要內(nèi)容

國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容初步計(jì)劃

經(jīng)費(fèi)預(yù)算

可行性預(yù)測(cè)

不利因素

參考文獻(xiàn)研究的意義和主要內(nèi)容醫(yī)用臭氧是臭氧和氧氣的混合物，應(yīng)用于臨床已有100多年的歷史。醫(yī)用臭氧技術(shù)在臨床各專(zhuān)業(yè)中被廣泛關(guān)注，并顯示了良好的應(yīng)用前景。在疼痛臨床中，自1988年Verga將臭氧注入腰大肌及椎旁間隙治療腰腿痛，臭氧開(kāi)始越來(lái)越多的用于疼痛治療。研究的意義和主要內(nèi)容對(duì)于腰腿痛病人，醫(yī)用臭氧椎間盤(pán)內(nèi)和椎旁注射取得了良好的療效。但是臭氧作為一種極強(qiáng)的氧化劑，在治療過(guò)程中有可能會(huì)誤入或滲入蛛網(wǎng)膜下腔，這是否會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷，或是多大劑量能造成損傷，已經(jīng)引起了臨床醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注和重視。研究的意義和主要內(nèi)容星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，它的功能在近年來(lái)被人們?cè)絹?lái)越多地認(rèn)識(shí)到，甚至有人把星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元比作中樞神經(jīng)系統(tǒng)中同等重要的功能伙伴。研究的意義和主要內(nèi)容并且星形膠質(zhì)細(xì)胞參與構(gòu)成了血腦屏障，最先接觸蛛網(wǎng)膜下腔中的毒性物質(zhì)，而它本身也有強(qiáng)大的抗氧化能力，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞在抵抗臭氧的毒性作用中可能發(fā)揮了很大的作用，但廣泛查閱未檢索到相關(guān)報(bào)道。本研究擬從生化改變和形態(tài)學(xué)兩方面觀察不同濃度的醫(yī)用臭氧對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，以期為臨床工作提供有意義的參考。國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展國(guó)內(nèi)外關(guān)于臭氧的研究多集中于免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等方面。在疼痛領(lǐng)域，對(duì)臭氧的研究都集中在臭氧的治療作用，尤其是臭氧溶解椎間盤(pán)髓核作用和消炎止痛作用。國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展在臭氧的毒性方面，本科前期觀察了不同濃度的醫(yī)用臭氧2ml（30mg/L,50mg/L,80mg/L）經(jīng)小腦延髓池注入蛛網(wǎng)膜下腔后，兔行為學(xué)未受到明顯影響，而隨著醫(yī)用臭氧濃度的增加，腦脊液的抗氧化水平逐漸提高，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)被抑制；當(dāng)超出機(jī)體抵抗氧化的代償能力時(shí)，抗氧化水平不再繼續(xù)提高，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)短暫增強(qiáng)。這表明隨著劑量的增加醫(yī)用臭氧鞘內(nèi)注射有潛在的神經(jīng)毒性，研究結(jié)果發(fā)表在中華麻醉學(xué)雜志上，這一結(jié)論為進(jìn)一步研究醫(yī)用臭氧的神經(jīng)毒性提供了初步的研究結(jié)果。國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展但關(guān)于臭氧對(duì)離體細(xì)胞作用的研究，國(guó)外多是集中在臭氧對(duì)血液細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的作用上，國(guó)內(nèi)幾乎沒(méi)有在此方面的研究；而對(duì)于離體神經(jīng)細(xì)胞的作用，國(guó)內(nèi)外都沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)參照Kim等人的方法，并略作改動(dòng)。大致步驟如下：（1）取1～2天齡的大鼠，經(jīng)75%乙醇消毒后，用手術(shù)剪將頭部剪下，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。（2）沿縱軸剪開(kāi)皮膚和顱骨，打開(kāi)顱腔，取出腦組織并移入另一含有預(yù)冷生理鹽水的培養(yǎng)皿中，去除嗅部，小心分離出兩側(cè)的大腦皮質(zhì)。注：在取材過(guò)程中，為防止污染，所用的消毒手術(shù)器械每一步驟均要加以更換。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（3）小心地撕去腦膜，通常腦膜呈粉紅色，若皮質(zhì)組織已不見(jiàn)該顏色一般說(shuō)明腦膜已去除干凈。（4）將組織切成約0.2×0.2×0.2mm3大小的碎塊后，移入另一含有9ml生理鹽水的培養(yǎng)皿中。（5）加入無(wú)菌的1ml0.25%胰蛋白酶液(預(yù)先用5%調(diào)節(jié)Ph7.3),置37℃水浴振蕩消化20-30分鐘。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（6）加入20ml含血清的DMEM完全培養(yǎng)基,并用吸管柔和的吹打3次。（7）靜置數(shù)分鐘待組織下沉后，將細(xì)胞懸液移入另一新的離心管，再加入15mlDMEM至剩余組織中，稍用力吹打3-4次后，再讓組織下沉，收集細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（8）重復(fù)步驟（7）3-4次，直至組織全部分散成細(xì)胞懸液。將收集的細(xì)胞懸液用130um的篩網(wǎng)過(guò)濾。（9）過(guò)濾后的細(xì)胞懸液用50ml的無(wú)菌離心管分裝，以1000r/min離心10min。（10）盡可能吸去上清液，每管加入10mlDMEM/F12，并柔和吹打3min,讓細(xì)胞碎片和殘余組織團(tuán)塊下沉后，收集細(xì)胞懸液。（11）用吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37C，5%CO2孵育40分鐘，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶，重復(fù)此步驟3~4次以除去成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（12）取0.1%苔盼藍(lán)與細(xì)胞懸液以1：1稀釋后，檢查活細(xì)胞的數(shù)量，將細(xì)胞密度稀釋成1.5×106

／ml,

接種入75cm2的培養(yǎng)瓶中，5％C02／95％空氣，37℃，飽和濕度培養(yǎng)。（培養(yǎng)液組成：DMEM/F12，添加10％胎牛血清、4mmol／L一谷氨酰胺、10萬(wàn)U青霉素／10萬(wàn)U鏈霉素、15mmol／LHEPES）。(13)接種三天后更換培養(yǎng)液，以后每隔兩天換液一次。定期換液觀察至培養(yǎng)第8天時(shí)細(xì)胞已融合，用0．25%胰蛋白酶消化處理后傳代，兩次傳代后約第三周時(shí)即可得純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

1星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（14）星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定采用膠原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫組化染色：以無(wú)水酒精固定貼壁細(xì)胞10min，PBS漂洗；過(guò)氧化酶阻斷劑，室溫下孵育10min；一抗(鼠抗)一抗GFAP抗體室溫下60min；生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫下孵育10min；鏈親和素一過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育10min；DAB染色，蘇木精對(duì)比染色，中性樹(shù)膠封固。進(jìn)行膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)抗血清反應(yīng)，顯示陽(yáng)性反應(yīng)(光鏡下觀察呈棕褐色)的是星形膠質(zhì)細(xì)胞。

GFAP鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度90%以上可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

2實(shí)驗(yàn)分組

將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液分為純氧組（O2組）及各濃度臭氧組（02-O310組，02-O320組，02-O340組，02-O360組，02-O380組），────────────────────分組平行試驗(yàn)數(shù)量處理P組O2組5通入純氧O2-O310組5通入10mg/L臭氧O2-O320組5通入20mg/L臭氧O2-O340組5通入40mg/L臭氧O2-O360組5通入60mg/L臭氧O2-O380組5通入80mg/L臭氧────────────────────說(shuō)明：醫(yī)用臭氧是氧氣和臭氧的混合物，臭氧代謝生成氧氣。氧氣具有生物活性，要全面的觀察醫(yī)用臭氧的生物效應(yīng)除了要考慮到臭氧本身的作用外還要考慮到在混合氣體中共同存在和經(jīng)由代謝生成的氧氣的作用。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

3干預(yù)手段將各組細(xì)胞懸液中分別通入純氧及臭氧（濃度各為10mg/L，20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L），體積與細(xì)胞培養(yǎng)液按體積以1：1計(jì)，在10分鐘內(nèi)通完，分別孵育2h,4h后進(jìn)行顯微鏡下觀察及生化檢測(cè)。臭氧抽取方法：將臭氧發(fā)生器接通電源，通過(guò)調(diào)校臭氧濃度及氧氣輸入量按鈕或去所需濃度的醫(yī)用臭氧。用一次性注射器接至臭氧輸出端口，并用力下壓，臭氧即可依靠自身壓力充滿(mǎn)注射器，第一管廢棄不用，獲得的醫(yī)用臭氧需立即使用。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

4觀測(cè)指標(biāo)4.1相差顯微鏡下星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形狀不規(guī)則、呈多角形或星形，扁平狀;胞體較大,直徑大約為9-10um,胞質(zhì)較豐富、胞突較多較長(zhǎng);細(xì)胞核大，呈圓形或卵圓形，常偏于胞體一側(cè),染色質(zhì)少。生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清，并可見(jiàn)細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

4觀測(cè)指標(biāo)若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)酰?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周?chē)霈F(xiàn)絲絮狀物，細(xì)胞死亡會(huì)崩解漂浮在培養(yǎng)液中。在受到外界損傷因素時(shí)，細(xì)胞會(huì)變得腫脹，突起增多。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

4觀測(cè)指標(biāo)4.2細(xì)胞計(jì)數(shù)這是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本技術(shù)之一，也是比較簡(jiǎn)便實(shí)用的觀測(cè)指標(biāo)。在細(xì)胞培養(yǎng)研究中，了解細(xì)胞的數(shù)量和存活情況是很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，由此可以判斷培養(yǎng)條件和方法是否合適，而且通過(guò)細(xì)胞數(shù)量的變化可以初步了解所使用的某些因素對(duì)細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

4觀測(cè)指標(biāo)細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，由于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或通透性發(fā)生改變，某些染料可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞染色，從而可以根據(jù)細(xì)胞是否著色來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，并根據(jù)活細(xì)胞和死細(xì)胞的比例即活細(xì)胞百分率來(lái)判斷細(xì)胞受損的程度。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

4觀測(cè)指標(biāo)4.3生化指標(biāo)生物膜中的不飽和脂肪酸對(duì)自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物具有極強(qiáng)的敏感性,過(guò)量可導(dǎo)致?lián)p傷。文獻(xiàn)表明，脊髓損傷后5～30min自由基即有升高，2小時(shí)后脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物升高最明顯，此后不同性質(zhì)損傷變化不同。這表明在脊髓損傷后的急性期改變中氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡起重要作用。4.3.1超氧化物歧化酶（SOD）SOD是氧化-抗氧化系統(tǒng)中重要的酶,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。SOD專(zhuān)一以超氧陰離子自由基為底物，能清除自由基并終止其連鎖反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，同時(shí)本身被消耗。它的含量可反映體內(nèi)自由基的變化情況，能夠反映抵抗自由基損傷的能力。SOD活力的高低與衰老、腫瘤、炎癥、自身免疫病、血液病、輻射、藥物作用等有著密切的聯(lián)系，對(duì)疾病的病因?qū)W探討，診斷治療的觀察有著重要意義。4.3.2丙二醛（MDA）MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化物終產(chǎn)物之一,具有細(xì)胞毒性。其含量多少能體現(xiàn)機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，能夠反映細(xì)胞受損的程度。機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，如:醛基(丙二醛)、酮基、羥基、氫過(guò)氧基或過(guò)氧基，以及新的氧自由基等。脂質(zhì)過(guò)氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類(lèi)分解產(chǎn)物，而且通過(guò)鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，放大活性氧的作用。4.3.2丙二醛（MDA）

因此，初始的一個(gè)活性氧能導(dǎo)致很多脂類(lèi)分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中，一些是無(wú)害的，另一些則能引起細(xì)胞及功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過(guò)生物膜中多不飽和脂肪酸(PUFA)的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷。因而測(cè)試MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。4.3.3乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)乳酸脫氫酶是存在于細(xì)胞漿內(nèi)參與糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化時(shí)的一種催化酶。LDH在正常人體血漿中含有少量，均系來(lái)源于組織細(xì)胞，但在某些疾病時(shí)所累及的細(xì)胞會(huì)額外釋放入血或腦脊液，故臨床上常用血清或腦脊液LDH活性測(cè)定來(lái)診斷疾病和進(jìn)行藥物治療作用的評(píng)價(jià)。4.3.3乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，如果培養(yǎng)的細(xì)胞受損，LDH也會(huì)由細(xì)胞漏出至培養(yǎng)液中，因此通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率的測(cè)定可以較客觀地衡量細(xì)胞的受損程度。在相同的條件下細(xì)胞培養(yǎng)液LDH的漏出率高的細(xì)胞損傷程度就大。4.3.3乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)在本試驗(yàn)中，生物膜尤其是細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸對(duì)由臭氧產(chǎn)生的自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化物具有極強(qiáng)的敏感性，過(guò)量可導(dǎo)致?lián)p傷，而且細(xì)胞膜相對(duì)于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)首先接觸到內(nèi)環(huán)境中的毒性物質(zhì)，因而細(xì)胞膜是臭氧攻擊的重要靶點(diǎn)，會(huì)更多的受到損傷。細(xì)胞膜損傷后會(huì)導(dǎo)致通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的成分會(huì)比較容易的漏出，LDH也會(huì)漏出。細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重，LDH就會(huì)漏出越多，因而測(cè)定LDH漏出率可以較特異的反應(yīng)細(xì)胞膜的損傷程度。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

4觀測(cè)指標(biāo)如上所述，LDH漏出率，MDA和SOD分別代表著損傷和抗損傷因素，并且對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷反應(yīng)靈敏，是分析醫(yī)用臭氧對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有無(wú)毒性的合適指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法5.1相差顯微鏡直接觀察法細(xì)胞形態(tài)觀察（1）調(diào)整好相差顯微鏡（2）觀察瓶皿準(zhǔn)備（3）調(diào)光（4）調(diào)焦和攝影（5）細(xì)胞觀察實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法5.2細(xì)胞計(jì)數(shù)和活細(xì)胞百分率（1）取清潔計(jì)數(shù)板和專(zhuān)用蓋玻片，用絲綢輕輕拭干。（2）取細(xì)胞懸液0.3ml，加入0.9ml0.5%濃度的臺(tái)盼藍(lán)（PBS配置），混勻后滴半滴于血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，以充滿(mǎn)不外溢為宜。也可直接將細(xì)胞懸液在一側(cè)滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過(guò)少或出現(xiàn)氣泡。（3）在顯微鏡下用10X物鏡觀察計(jì)數(shù)四角大分格中的細(xì)胞數(shù)。代入下式得出細(xì)胞密度。細(xì)胞數(shù)/mL=(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)X104X稀釋倍數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色法可計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)以測(cè)定細(xì)胞存活百分率。一般臺(tái)盼藍(lán)染色可使死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。細(xì)胞存活百分率=(4大格活細(xì)胞數(shù)/4大格活細(xì)胞+死細(xì)胞數(shù))x100%實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法5.3生化指標(biāo)測(cè)定5.3.1SOD測(cè)定:黃嘌呤氧化酶法。原理是超氧陰離子自由基能氧化羥胺形成的亞硝酸鹽并在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)可測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基有專(zhuān)一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少測(cè)定管的吸光度低,從而計(jì)算出被測(cè)樣品中的SOD活力。方法：作用終止后,吸去培養(yǎng)液,以冰生理鹽水洗滌細(xì)胞2次,用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞,冰生理鹽水收集,在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞,顯微鏡下觀察無(wú)完整細(xì)胞后,按照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD活性,結(jié)果以U·mg-1(pro)表示。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法/生化指標(biāo)測(cè)定5.3.2MDA測(cè)定:硫代巴比妥酸(TBA)法。原理是過(guò)氧化脂質(zhì)在酸性條件下分解成MDA，MDA與TBA結(jié)合成紅色色素，其吸收峰為535nm。方法：作用終止后,吸去培養(yǎng)液,以冰生理鹽水洗滌細(xì)胞2次,用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞,冰生理鹽水收集,在冰浴中用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞,顯微鏡下觀察無(wú)完整細(xì)胞后,按照試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量,結(jié)果以nmol·mg-1(pro)表示。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法/生化指標(biāo)測(cè)定

5.3.3LDH測(cè)定：比色測(cè)定法。原理乳酸與氧化型輔酶I(NAD)在LDH催化作用下生成丙酮酸和還原型輔酶I(NADH)，丙酮酸再和2,4一二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4一二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，從而通過(guò)比色法測(cè)定丙酮酸含量推算出LDH的活力。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法/生化指標(biāo)測(cè)定5.3.3.1細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)終止后，吸出待測(cè)培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，以3000rpm離心10分鐘，取上清液進(jìn)行檢測(cè)，用乳酸脫氫酶試劑盒測(cè)定LDH含量。按照LDH測(cè)定試劑盒說(shuō)明,在分光光度計(jì)上于340nm處檢測(cè),結(jié)果以U·L-1表示。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法/生化指標(biāo)測(cè)定/LDH5.3.3.2細(xì)胞勻漿液LDH活性測(cè)定將待測(cè)培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液吸出后，加入等量PBS液，用細(xì)胞刮板刮取細(xì)胞并收集到相應(yīng)編號(hào)的容器內(nèi)，在超聲波破碎上將細(xì)胞破碎，然后進(jìn)行細(xì)胞勻漿液LDH活性的測(cè)定。按照LDH測(cè)定試劑盒說(shuō)明,在分光光度計(jì)上于340nm處檢測(cè),結(jié)果以U·L-1表示。實(shí)驗(yàn)方法和內(nèi)容

5測(cè)定方法/生化指標(biāo)測(cè)定/LDH5.3.3.3細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率的測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率(%)=:培養(yǎng)液LDH總活性/(培養(yǎng)液LDH總活性+細(xì)胞勻漿液LDH總活性)X100%注:：1）培養(yǎng)液LDH總活性=培養(yǎng)液LDH的活性X培養(yǎng)液的體積;2)細(xì)胞勻漿液LDH總活性二細(xì)胞勻漿液LDH的活性X細(xì)胞勻漿液蛋白含量X細(xì)胞勻漿液的體積;3)計(jì)算時(shí)一定要注意單位的換算。初步計(jì)劃2007、4-----2007、5準(zhǔn)備試劑、材料、聯(lián)系相關(guān)科室。2007、5-----2007、7預(yù)實(shí)驗(yàn)階段。2007、7-----2007、11正式實(shí)驗(yàn)階段，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)總結(jié)。2007、11-----2008、2整理材料、分析結(jié)果、論文撰寫(xiě)、準(zhǔn)備答辯。經(jīng)費(fèi)預(yù)算神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：2000元；SOD、MDA、LDH測(cè)定：4000元；顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察、計(jì)數(shù)：2000元?？尚行灶A(yù)測(cè)1本科室技術(shù)力量雄厚，科研能力強(qiáng)。2已開(kāi)展的相關(guān)研究提供了可借鑒的理論指導(dǎo)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。不利因素1相關(guān)基礎(chǔ)研究報(bào)道較少，缺少直接借鑒的經(jīng)驗(yàn)。2所需科研經(jīng)費(fèi)數(shù)目較大。3神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)比較困難。參考文獻(xiàn)張維，傅志儉，謝珺田，趙學(xué)軍。鞘內(nèi)注射醫(yī)用臭氧對(duì)兔行為學(xué)和腦脊液超氧化物歧化酶、丙二醛水平的影響，中華麻醉學(xué)雜志,2006，26：552-554;HallED,BranghlerJM.Roleoflipidperoxidationinpost-traumaticspinalcorddegeneration.Cent

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SystTrauma,1986,3(4):281;3L.JANSKY1,P.REYMANOVá1,J.KOPECKY.DynamicsofCytokineProductioninHumanPeripheralBlood,MononuclearCellsStimulatedbyLPSorInfectedbyBorrelia

Physiol.Res.52:593-598,2003;4Velio

BocciCA.OzoneasJanus:thiscontroversialgascanbeeithertoxicormedicallyusefulMediatorsofInflammation,200413(1),3_/11;5楊志軍,魏玲.星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能研究進(jìn)展,華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜