第11章色譜分析法概論

1第十一章

色譜分析法概論

Chromatography《分析化學下冊》課程進樣空氣峰t信號2

色譜法的概述色譜法的基礎知識色譜分離的基本理論色譜法的發(fā)展趨勢主要內容31906年俄國植物學家茨維特（M.Tswett）從分離植物色素實驗中發(fā)明了色譜分離方法。俄國植物學家茨維特11.1概述1906，俄國植物學家M.Tswett發(fā)明色譜法，是色譜之父。1931，對液固吸附色譜的杰出貢獻者庫恩，分離出60多種胡蘿卜素，核黃素、維生素，獲1938年諾貝爾化學獎。蒂塞利烏斯（Tiselius）因電泳分析方法的研究，發(fā)現(xiàn)血清蛋白組分，獲1948年諾貝爾化學獎。1941，馬?。∕artin）和辛格（Synge）創(chuàng)始分配色譜特別是紙色譜而共獲1952年諾貝爾化學獎。氨基酸自動分析儀發(fā)明人S·穆爾（StanfordMoore）和W.H.斯坦（WilliamHowardStein)，定量分析方法解決了有關氨基酸、多肽、蛋白質等復雜的生物化學問題，獲1972年諾貝爾化學獎。45611.2色譜法的基本知識色譜過程：實現(xiàn)色譜操作的基本條件是必須具備相對運動的兩相，固定相(stationaryphase)和流動相(mobilephase)。色譜過程是組分的分子在流動相和固定相間多次“分配”的過程。組分的結構和性質微小差異與固定相作用差異隨流動相移動的速度不等差速遷移色譜分離。BAABBABBABABct流動相樣品液色譜柱固定相檢測器7色譜的基本術語：1.色譜的流出曲線色譜流出曲線：是由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖所繪制的曲線，又稱為色譜圖?；€：是在操作條件下，沒有組分流出時的流出曲線?；€反映儀器(主要是檢測器)的噪音隨時間的變化。峰高

(h)：組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時的檢測信號，即色譜峰頂至基線的距離。峰寬

(W)：色譜峰的寬度取決于組分在柱中遷移擴散程度。8標準差(σ)：正態(tài)色譜流出曲線上兩拐點間距離之半，即0.607倍峰高處的峰寬之半。σ的大小表示組分被帶出色譜柱的分散程度。σ越大，組分越分散；反之越集中。峰寬

(W)：色譜峰兩側拐點作切線在基線上所截得的距離。

W=4σ半峰寬

(W1/2)：峰高一半處的峰寬W1/2=2.355σ；W=1.699W1/2三種描述方法：92.保留值保留時間(tR)：從進樣到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時的時間間隔。死時間

(t0)：分配系數(shù)為零的組分，即不被固定相吸附或溶解的組分的保留時間。調整保留時間

()：某組分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的組分在柱中多停留的時間。10保留體積(VR)：從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時，所需通過色譜柱的流動相體積。死體積(V0)：由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間。固定相顆粒間間隙、導管的容積、檢測器內腔容積的總和。調整保留體積（）：由保留體積扣除死體積后的體積。

注意：VR’是定值，tR’與FC成反比113.相對保留值相對保留值(r)：兩組分的調整保留值之比。保留指數(shù)(I)

：用保留時間緊鄰待測組分的兩個正構烷烴來標定組分的相對保留值，又稱Kovats指數(shù)：Ix為待測組分的保留指數(shù)；z與z+n為正構烷烴對的碳原子數(shù)，n通常為1；規(guī)定正己烷、正庚烷及正辛烷為600、700及800。12例：在ApiezonL柱上，柱溫100℃，用正庚烷及正辛烷為參考物質對，測得t0=30.0，正庚烷的tR=204.0，乙酸正丁酯的tR=340.0及正辛烷的tR=403.4。說明乙酸正丁酯在ApiezonL柱上的保留行為相當于7.756個碳原子的正構烷烴的保留行為。注意：烷烴類組分保留指數(shù)只與被測物質及色譜柱固定相、柱溫有關，不受固定相用量、載氣種類及流速等條件影響。Ix=100（）=775.6134.相平衡常數(shù)分配系數(shù)（distributioncoefficient；K）：是在一定溫度和壓力下，達到分配平衡時，組分在固定相(s)與流動相(m)中的濃度(C)之比。注意：分配系數(shù)僅與組分、固定相和流動相的性質及溫度（和壓力）有關。是組分的特征常數(shù)。保留因子（capacityfactor；k）：在一定溫度和壓力下，達到分配平衡時，組分在固定相和流動相中的質量(m)之比，稱為質量分配系數(shù)或分配比。與固定相和流動相的體積有關。tR=t0(1+k)tR=t0(1+K

)145.分離參數(shù)分離度(resolution；R)：又稱分辨率。是相鄰兩色譜峰保留時間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。設正常峰，W1≈W2=4σ當R=1.5時，99.7%面積（tR±3σ）被分開，?tR=6σ，稱6σ分離。分離因子()：又稱為分配系數(shù)比或選擇性系數(shù)。15色譜法的分類：

1.按流動相的分子聚集狀態(tài)分類: GC、LC、SFC等

2.按固定相的分子聚集狀態(tài)分類: GSC、GLC、LSC、LLC等

3.按操作形式分類:

柱色譜法、平面色譜法、毛細管電泳法等

4.按色譜過程的分離機制分類:

分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法、親合色譜法等161.按兩相分子的聚集狀態(tài)分類2.按固定相的固定方式分類柱色譜：填充柱、毛細管柱色譜平面色譜：紙色譜、薄層色譜

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換能力不同空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同3.按分離的機制分類液相色譜：液-固色譜、液-液色譜氣相色譜：氣-固色譜、氣-液色譜

色譜分類17色譜基本類型的分離機理：1.吸附色譜分離原理：利用被分離組分對固定相表面吸附中心吸附能力的差別而實現(xiàn)分離。吸附過程是試樣中組分的分子(X)與流動相分子(Y)爭奪吸附劑表面活性中心的過程，即為競爭吸附過程。吸附系數(shù)與吸附劑的活性、組分的性質和流動相的性質有關。圖11-1

吸附色譜示意圖.X.溶質分子；Y.流動相分子；a.吸附劑；m.流動相。18固定相：多為吸附劑，如硅膠、氧化鋁。硅膠表面硅醇基為吸附中心。經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜：一般硅膠高效液相色譜：球型或無定型全多孔硅膠和堆積硅珠。氣相色譜：高分子多孔微球等流動相：有機溶劑（硅膠為吸附劑）洗脫能力：主要由其極性決定。強極性流動相占據(jù)吸附中心的能力強，洗脫能力強，使k值小，保留時間短。Snyder溶劑強度o：吸附自由能，表示洗脫能力。o值越大，固定相對溶劑的吸附能力越強，即洗脫能力越強。19洗脫順序：

ka=KaSa/Vm

在色譜柱（Sa與Vm一定）時，Ka大的組分保留強，后被洗脫，Ka小的組分在吸附劑上保留弱，先被洗脫。

Ka與組分的性質（極性、取代基的類型和數(shù)目、構型有關）。以硅膠為吸附劑：極性強的組分吸附力強。①飽和碳氫化合物為非極性化合物，不被吸附。②基本母核相同，引入的取代基極性越強，則分子的極性越強，吸附能力越強；極性基團越多，分子極性越強(但要考慮其他因素的影響)。③不飽和化合物的吸附力強，雙鍵數(shù)越多，吸附力越強。④分子中取代基的空間排列。20

一些溶劑在硅膠上的o值溶劑

溶劑強度（o）溶劑

溶劑強度（o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40異丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70212.分配色譜法分離原理:利用被分離組分在固定相或流動相中的溶解度差別而實現(xiàn)分離。溶質分子在固定相中溶解度越大，或在流動相中溶解度越小，則K越大。在LLC中K主要與流動相的性質（種類與極性）有關；在GLC中K與固定相極性和柱溫有關。

圖11-2分配色譜示意圖。Xm流動相中游離的組分分子Xs固定相中溶解的組分分子22固定相:

又稱固定液（涂漬在惰性載體顆粒上的一薄層液體）；化學鍵合相（通過化學反應將各種有機基團鍵合到載體上形成的固定相）。流動相:

氣液分配色譜法：氣體，常為氫氣或氮氣。液液分配色譜法：與固定相不相溶的液體。

正相液液分配色譜：流動相的極性弱于固定相的極性。反相液液分配色譜：流動相的極性強于固定相的極性。洗脫順序:由組分在固定相或流動相中溶解度的相對大小而決定。正相液液分配色譜：極性弱的組分后被洗脫。(庫侖力和氫鍵力）反相液液分配色譜：極性強的組分先出柱。233、離子交換色譜法分離原理：利用被分離組分離子交換能力的差別而實現(xiàn)分離。分為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。

固定相和流動相：固定相：離子交換劑（離子交換樹脂、化學鍵合離子交換劑）。

流動相：一定pH和離子強度的緩沖溶液。影響保留行為的因素：受被分離離子、離子交換劑、流動相的性質影響。m21R圖11-3離子交換色譜示意圖1.固定離子；2.可交換離子R.樹脂骨架；m.流動相244、分子排阻色譜法（MEC）分離原理：根據(jù)被分離組分分子的線團尺寸進行分離。也稱為凝膠色譜法。根據(jù)空間排阻（stericexclusion）理論，孔內外同等大小的溶質分子處于擴散平衡狀態(tài)：滲透系數(shù)：Kp=Xs/Xm

（0＜Kp＜1

）由溶質分子的線團尺寸和凝膠孔隙的大小所決定。在一定分子線團尺寸范圍內，Kp與分子量相關，即組分按分子量的大小分離。分子排阻色譜示意圖Ge.凝膠；m.流動相Gem大分子流動相凝膠孔隙25固定相：多孔凝膠：軟質、半軟質和硬質。主要性能參數(shù)：

平均孔徑：

排斥極限（Kp=0）：不能滲透進入凝膠的任何孔隙最低分子量

分子量范圍：排斥極限（Kp=0）與全滲透點（Kp=1）之間的分子量范圍。選擇凝膠時應使試樣的分子量落入此范圍。流動相:

要求：能溶解試樣、潤濕凝膠，粘度要低。水溶性試樣選擇水溶液為流動相（稱為凝膠過濾色譜gelfiltrationchromatography；GFC）；非水溶性試樣選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機溶劑為流動相（凝膠滲透色譜gelpermeationchromatography；GPC）。26小結色譜過程方程式：分配系數(shù)大的組分保留時間長（保留體積大），晚流出色譜柱。K在分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和凝膠色譜中，分別為狹義分配系數(shù)K、吸附系數(shù)Ka、選擇性系數(shù)KA/B和滲透系數(shù)Kp，Vs分別為色譜柱（或薄層板）內固定液體積、吸附劑表面積、離子交換劑總交換容量和凝膠孔內總容積。2711.3色譜法基本理論

色譜理論包括兩方面:熱力學理論：研究分配(分離)過程，塔板理論（platetheory）。動力學理論：研究各種動力學因素對峰展寬的影響，速率理論（ratetheory）。要使R大，必須：

1、?tR大---?k大----熱力學

2、W小---峰展寬小---動力學1、

影響保留行為的因素推導色譜過程方程：在實驗條件一定時，固定相和流動相的選擇和體積都是確定的，故tR取決于K，也就是取決于組分的性質，所以保留時間是對組分進行色譜定性的指標。Vs固定相的體積Vm流動相的體積K↑,tR↑,組分后出柱K＝0，組分不保留K→∞，組分完全保留2、

等溫線在一定溫度條件下，組分在固定相和流動相的分配達到平衡時，在兩相中的濃度之比值K為常數(shù)，由此繪制出的cs與cm的關系曲線，稱為等溫線。bccscmtRb前延峰a正常峰c拖尾峰aWh/2h0.05hW0.05hAB對稱因子/拖尾因子完全對：fs=1.00對稱峰：fs=0.95~1.05前延峰：fs＜0.95(A＞B)拖尾峰：fs＞1.05(A＜B)303、塔板理論

始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點不同而分離。色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。塔板理論假定：①在色譜柱內每一“塔板”H內，組分在兩相間瞬間達到分配平衡。②流動相間歇式進入色譜柱，每次進入一個塔板體積。③分配系數(shù)在各塔板內是常數(shù)。④縱向擴散可以忽略。31（一）質量分配和轉移

1、單一組分B（kB=0.5）的分配和轉移

①設色譜柱的塔板數(shù)n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）號。 ②將單位質量的B加到第0號塔板上。 ③分配平衡后，0號塔板內ms/mm＝0.333/0.667。 ④進入一個塔板體積的流動相（一次轉移）。32

組分B(kB=0.5)在n=5的色譜柱內及出口的分布

Nr01234柱出口

010000010.3330.667000020.1110.4440.44500030.0370.2220.4440.2960040.0120.0990.2690.3950.1980

50.0040.0410.1640.3290.3290.132

60.0010.0160.0820.2190.3290.219

700.0060.0380.1280.2560.219800.0020.0170.0680.1700.1709000.0070.0330.1020.11410000.0020.0160.0560.06833

組分A(kA=1)在色譜柱內和出口的分布

nr01234柱出口

010000010.50.5000020.250.50.2500030.1250.3750.3750.1250040.0630.2500.3750.2500.0630

50.0320.1570.3130.3130.1570.03260.0160.0950.2350.3130.2350.07970.0080.0560.1650.2740.2740.118

80.0040.0320.1110.2200.2740.137

90.0020.0180.0720.1660.2470.137100.0010.0100.0450.0940.2070.1242、兩組分的分離A(kA=1)和B(kB=0.5)兩組分34結果：

組分B:k=0.5,當n=6和7時，柱出口產生B的濃度最大點。組分A：k=1，n=8和9時，柱出口處達到濃度最大點。兩組分開始分離，k小的組分B在柱后先出現(xiàn)濃度極大值,即先出柱。一根色譜柱n=103以上，組分有微小的分配系數(shù)(容量因子)差別即可實現(xiàn)完全分離。分配系數(shù)(容量因子)不等是分離的前提。注意：1、柱出口處的質量分數(shù)的計算。2、質量（濃度）最大點的N，即保留體積。35

(二)流出曲線

以組分A在柱出口處的質量分數(shù)對n作圖。N柱出口

0010203040

5

0.03260.07970.118

80.13790.137100.124

k=1的組分從色譜柱中的流出曲線圖當塔板數(shù)很大時，流出曲線趨于正態(tài)分布曲線。36(三)塔板高度和塔板數(shù)是色譜柱效參數(shù)。理解：在tR一定時，W(W1/2)

越小，N越大，H越小，色譜柱的分離效率越高。因此，理論塔板數(shù)是評價柱效能的指標。37優(yōu)點：塔板理論是半經(jīng)驗性理論，在解釋流出曲線的形狀、濃度極大點的位置、評價柱效高低等方面是成功的。局限：塔板理論的基本假設與事實不完全相符，它無法解釋譜帶擴展的原因，也無法解釋色譜過程與流動相流速、柱內分子擴散傳質過程以及色譜操作參數(shù)等動力學因素的關系。這些問題，在速率理論中得到了圓滿的解決。384、速率理論塔板理論的不足：

1.組分在兩相中不可能真正達到分配平衡；

2.組分在色譜柱中的縱向擴散不能忽略;3.沒有考慮各種動力學因素對傳質過程的響；

4.無法解釋柱效與流動相流速的關系；

5.不能說明影響柱效有哪些主要因素。

1956年，荷蘭學者范第姆特(VanDeemter)提出了色譜過程動力學理論——速率理論。塔板高度渦流擴散項縱向擴散項傳質阻抗項H=A

+B/u+Cu39符號名稱單位H塔板高度cmA渦流擴散項cmB縱向擴散系數(shù)cm2·s-1C傳質阻力系數(shù)su載氣線流速cm·s-1圖11-6范氏方程中各項對板高的貢獻VanDeemter方程方程中各項的意義符號名稱關系式備注A渦流擴散項(多路徑項)A=2λdpdp固定相顆粒平均直徑；λ渦流擴散因子，與填充的均勻性有關B/u縱向擴散項(分子擴散項)B=2rDgr

曲折因子，反映固定相顆粒的空間結構。填充柱r＝0.5-0.7,空心柱r＝1；Dg組分分子在載氣中的擴散系數(shù)Cgu氣相傳質阻力項k′：容量因子Clu液相傳質阻力項df：固定液液膜厚度，Cl：

組分在固定液中的擴散系數(shù)40渦流擴散（eddydiffusion