標記免疫技術

標記免疫技術標記免疫技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術2021/3/102標記免疫技術免疫測定技術免疫組化技術示蹤物及標記技術酶免疫技術熒光免疫技術放射免疫技術化學發(fā)光技術金免疫技術生物素-親和素免疫放大技術

……2021/3/103第一節(jié)酶免疫技術

基本原理

利用酶催化底物反應的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學反應的檢測敏感性的一種標記免疫技術。2021/3/104

基本特點：

①標記后保留酶和抗原(抗體)的活性。②酶促反應專一性，保證特異性。③底物反應放大作用，提高敏感性。④酶標試劑保存穩(wěn)定。⑤操作簡便，安全易行。2021/3/105一、

酶免疫技術的分類

酶免疫組化用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術均相酶免疫測定酶免疫測定固相酶免疫測定異相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定2021/3/106二、酶免疫技術的技術要點

（一）固相載體基本要求結合容量高，結合穩(wěn)定；可與抗原抗體復合物等大分子蛋白結合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經(jīng)濟。2021/3/107種類與選擇1.塑料制品2.微顆粒3.膜載體2021/3/108（二）酶與酶作用底物1.用于標記酶的要求：酶活性高標記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標記抗原與抗體的免疫反應性酶催化底物后信號易判定或測定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質穩(wěn)定，安全無害，價廉2021/3/1092.常用酶及其底物（1）辣根過氧化物酶（HRP）

常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應顯橙黃色，應避光，致癌性。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。2021/3/1010（2）堿性磷酸酶（AP）

常用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標記物收率低于HRP，且價高，故應用不如HRP普及。2021/3/1011（三）酶標記抗體或抗原基本要求：

酶標記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價高，親和力強，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化。2021/3/1012酶標記方法

1.交聯(lián)法

以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法

用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標記物制備。2021/3/1013（四）標記抗體鑒定（五）免疫吸附劑（六）試劑最佳工作濃度的選擇2021/3/1014三、酶聯(lián)免疫吸附試驗

(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)(一)基本原理：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）

在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應（抗原抗體反應）2021/3/1015用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。（酶標抗原抗體復合物的分離）

加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析。（顯色反應）2021/3/1016（二）ELISA技術類型：ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。

2021/3/10171．雙抗體夾心法2021/3/1018特點：非競爭結合反應常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇

2021/3/10192．間接法2021/3/10203.競爭法2021/3/1021特點：用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。酶標Ag（Ab）與樣品或標準品中的非標記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結合的能力。反應體系中，固相Ab（Ag）和酶標Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結合位點少于酶標記與非標記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。反應后，結合與固相載體上復合物中被測定的酶標Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標記Ag（Ab）的濃度成反比。2021/3/10224.捕獲法（反向間接法）

主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。2021/3/1023注意事項：加樣

應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。保溫

1、一般均采用水浴箱，使溫度迅速平衡。

2、為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。2021/3/1024洗滌：

決定著實驗的成敗。目的：洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。2021/3/1025比色

比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。用特定的波長測讀吸光值。

比色結果的表達以往通用光密度（opticaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。2021/3/1026四、均相酶免疫吸測定

基本原理：利用酶標抗體結合抗原形成復合物后，標記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復合物與游離酶標抗體分離的情況下，直接測定系統(tǒng)中總的標記酶活性的改變，進而推算出待檢樣品中的抗原量。

主要用于小分子抗原或半抗原的檢測.2021/3/1027(一)酶擴大免疫測定技術:

（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）基本原理:半抗原與酶結合成酶標半抗原，保留半抗原和酶的活性。當酶標半抗原與抗體結合后，所標的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。2021/3/1028（二）克隆酶供體免疫測定

（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）

利用重組DNA技術制備β-半乳糖苷酶的兩個片段：大片段稱為酶受體（enzymeacceptor,EA），小片段稱為酶供體（enzymedonor,ED），兩個片段本身均不具酶活性，但結合在一起就具有酶活性，利用這一特性建立的均相酶免疫測定稱為克隆酶供體免疫測定(CEDIA)。

CEDIA的反應模式為競爭法。2021/3/1029基本原理：標本中的抗原和ED標記的抗原與特異性抗體競爭結合，形成兩種抗原抗體復合物。ED標記的抗原與抗體結合后由于空間位阻，不能再與EA結合。反應平衡后，剩余的ED標記抗原與EA結合，形成具有活性的酶，加入底物測定酶活力，酶活力的大小與標本中抗原含量呈正比。2021/3/1030五、固相膜免疫測定

固相膜免疫測定與ELISA相類似,其特點是以微孔膜作為固相.標記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素（NC）膜。類型：免疫滲濾試驗：穿流形式免疫層析試驗：橫流形式斑點酶免疫吸附試驗（dot-ELISA）免疫印跡法

(Westernblot)2021/3/1031（一）斑點ELISA(dot-ELISA)2021/3/1032（二）免疫印跡法

（immunoblottingtest，IBT）亦被稱為Westernblot分三個階段進行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉移酶免疫定位

2021/3/1033免疫印跡法原理示意圖

2021/3/1034第二節(jié)熒光免疫技術

免疫熒光技術(immunofluorescencetechnique)是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種方法。2021/3/1035基本原理

利用熒光素標記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本中的待檢抗原特異結合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結合在標本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。2021/3/1036一、免疫熒光顯微技術（一）基本原理：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。2021/3/1037（二）熒光抗體的制備（1）熒光抗體的標記作為標記的熒光素應符合以下要求：

①應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高,與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質，與蛋白質的結合物穩(wěn)定，易于保存。

⑤標記方法簡單、安全無毒。2021/3/1038熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學方式共價結合而成。常用于標記的熒光素：異硫氰酸熒光黃（FITC）

四乙基羅丹明（RB200）

四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標記方法：攪拌法(適合大樣品)

透析法(適合小樣品)標記抗體的純化：透析法、層析分離法2021/3/1039（2）熒光抗體的鑒定F/P比率：

將制備的熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測讀A280（蛋白質特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰。

2021/3/1040F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細胞染色的以F/P＝2.4為宜。

2021/3/1041抗體效價：效價越大標記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在1:16-1:32者較為理想?？贵w特異性

：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強烈熒光。

2021/3/1042（三）技術類型

直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異熒光染色因素少。缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體。2021/3/1043間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。2021/3/1044（四）熒光免疫顯微技術在

醫(yī)學檢驗中的應用1．血清中自身抗體的檢測2．各種微生物階快速檢查和鑒定3．寄生蟲感染的診斷4．白細胞分化抗原的檢測5．人類白細胞抗原(HLA)的檢測6．腫瘤組織中腫瘤抗原的檢測7．組織中免疫球蛋白和補體組分的檢測8．激素和酶的組織定位2021/3/1045二、熒光免疫測定技術

熒光免疫測定同酶免疫測定一樣，根據(jù)抗原抗體結合后是否需要將結合狀態(tài)與游離狀態(tài)的的熒光標記抗原（或抗體）分離開，而將之為均相和非均相兩種類型。

2021/3/1046(一)時間分辨熒光免疫測定

1.基本原理時間分辨熒光免疫測定(time-resolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA)是熒光分析（FIA）的基礎上，用具較長壽命熒光的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的作為標記物來標記抗體或抗原，從而檢測標本中的相應抗原或抗體的新技術。

2021/3/10472.技術類型

(1)固相雙位點夾心法(2)固相抗原競爭法(3)固相抗體競爭法2021/3/1048(二)熒光偏振免疫測定

FPIA是一種均相競爭熒光免疫分析法。其原理是：標本中的抗原與熒光標記的抗原競爭結合抗體。反應平衡后，與抗體結合的熒光標記抗原的量與標本中抗原濃度的量呈反比。由于抗體的分子量遠大于抗原的分子量，游離的熒光標記抗原與結合抗體的熒光標記抗原所產(chǎn)生的偏振熒光強度相差甚遠。因此在FPIA中測定的偏振熒光強度與標本中抗原的濃度呈反比。通過小分子抗原標準品與熒光偏振強度關系建立標準曲線，可檢測小分子抗原的濃度。2021/3/1049第三節(jié)放射免疫技術

放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術還包括放射受體分析（使用受體測量抗原）和放射配體結合分析（使用配體研究受體）。特點:靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強、重復性好等2021/3/1050一、放射免疫分析（RIA）基本原理

采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結合有限量特異性抗體（Ab）的反應。2021/3/1051二、免疫放射分析（IRMA）基本原理單位點IRMA：利用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物，反應平衡后，用固相抗原結合反應液中剩余的未結合標記抗體并將其分離，測定上清液的放射量。2021/3/1052雙位點IRMA

先用固相抗體與抗原反應結合,然后再用過量的標記抗體與已結合于固相抗原的另一抗原決定簇結合,形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物,洗棄反應液中剩余的標記抗體,測定固相上的放射性。2021/3/1053IRMA與RIA的異同點1.標記物2．反應速率3．反應原理4．特異性5．靈敏度和檢測范圍6．分析誤差

2021/3/1054第四節(jié)發(fā)光免疫技術

發(fā)光免疫技術(luminescenceimmuno-technique)是將發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測定相結合而建立的一種新的超微量免疫分析技術。該方法既具有免疫反應的高度特異性又有發(fā)光分析的高靈敏度。2021/3/1055根據(jù)發(fā)光免疫技術中發(fā)光標記物不同，分為三種類型。化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmuneassay，CLIA)化學發(fā)光酶免疫分析(luminescenceenzymeimmunoassay，IEIA)生物發(fā)光免疫分析（bioluminescenceimmunoassay，BLIA）2021/3/1056一、發(fā)光與發(fā)光底物（一）發(fā)光（二）光照發(fā)光（三）生物發(fā)光（四）化學發(fā)光氨基苯二酰肼類、吖啶酯（acridiniumester，AE）類2021/3/1057二、化學發(fā)光標記技術

（一）發(fā)光標記法的分類生物標記法（直接合成法）直接化學發(fā)光劑物質標記法（直接偶聯(lián)法）催化劑和協(xié)同因子標記抗原抗體法（間接偶聯(lián)法）2021/3/1058（二）標記方法碳二亞胺（EDC）縮合法重氮鹽偶聯(lián)法（重氮化法）過碘酸鹽法戊二醛法琥珀酸酐法異硫氰酸酯衍生物法O-（羧甲基）羧胺法2021/3/1059第五節(jié)金標記免疫技術

金標記免疫技術（immunogoldlabelingtechnique）是以膠體金作為標記抗原或抗體，檢測樣品中抗體或抗原的性質、含量、形態(tài)學特征等進行分析的綜合技術。它是利用金顆粒光學檢測的靈敏性與免疫反應的特異性相結合的一種技術。2021/3/1060一、膠體金的特性（一）膠體特性（二）光學特性（二）穩(wěn)定性（三）溶膠的聚沉現(xiàn)象2021/3/1061二、膠體金標記技術的類型

（一）斑點金免疫滲濾試驗1.原理斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)是以NC膜為載體，包被抗原或抗體于滲濾裝置中，依次滴加標本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時與膜上的抗原或抗體快速結合并起到濃縮作用，達到快速檢測目的(一般5min左右完成)。2021/3/10622.技術類型

（1）雙抗體夾心法（2）間接法金免疫滲濾裝置示意圖

2021/3/1063（二）斑點免疫層析試驗1.原理斑點免疫層析試驗（dot-immunochromatographicassay，DICA）簡稱免疫層析試驗（ICA），也以NC膜為載體，但利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般。在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結合而被固相化，無關物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判斷實驗結果。2021/3/10642.技術類型

（1）雙抗體夾心法（2）競爭法（3）間接法免疫層析試驗原理示意圖

2021/3/1065第六節(jié)生物素-親和素

免疫放大技術

生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem，BAS）是以生物素和親和素具有的獨特結合特性為基礎，結合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質，它們的結合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級放大效應。2021/3/1066一、生物素-親和素系統(tǒng)的特點生物素（biontin，B）由卵黃和肝組織中提取，分子量244.31kD生物素分子有兩個環(huán)狀結構

Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)，與親和素結合的主要部位；

II環(huán)為噻吩環(huán)，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的惟一結構，經(jīng)化學修飾后成為活化生物素。2021/3/1067親和素（avidin，AV）亦稱抗生物素蛋白、卵白素由卵白蛋白中提取，4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68kD耐熱井耐受多種蛋白水解酶的作用．尤其是與生物素結合后，穩(wěn)定性更好。每個親和素能結合4個分子的生物素，二者之間的親和力極強，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬倍，因此二者的結合特異性高和穩(wěn)定性好。2021/3/1068

BAS特點：靈敏度

①形成的生物素衍生物，保持原有生物活性，比活度高，具多價性。②每個親和素分子有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。③具有多級放大作用，提高靈敏度。2021/3/1069特異性

①具有極高的親和力，其反應呈高度專一性；②不會因反應試劑的高度稀釋而受影響，可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。穩(wěn)定性

①親和常數(shù)極高，解離常數(shù)很小，反應不可逆；②酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結合。2021/3/1070適用性

①可與酶、熒光素和放射性核素等各類標記技術結合，用于檢測體液、組織或細胞中的抗原-抗體、激素—受體和核酸系統(tǒng)以及其他多種生物學反應體系，②可制成親和介質，用于分離提純上述各反應體系中的反應物。其他

①可制成多種通用性試劑，實驗成本低；②結合具高速、高效的特性，所需的溫育時間短，實驗往往只需數(shù)小時即可完成．2021/3/1071二、生物素的理化性質與標記生物素及其活化

生物素經(jīng)活化后，可容易地與各種抗原、抗體、酶及核酸分子中相應基團偶聯(lián)形成生物素化標記物。

常用的活化生物素的標記制備方法

①標記蛋白質氨基的活化生物素②標記蛋白質醛基的活化生物素③標記蛋白質巰基的活化生物素

④標記核酸的活化生物素2021/3/1072生物素化蛋白質衍生物

特性：

一個蛋白質分子可聯(lián)結多個生物素分子，具較高的比活性，在與親和素的反應中成為多價。生物素化大分子的多價性，是BAS多級放大作用的物質基礎。

類型：（二類）①生物素化的大分子生物活性物質如：抗原、抗體等②標記材料結合生物素后制成的標記物如：酶類等2021/3/1073蛋白質生物素標記注意事項：①應根據(jù)抗原或抗體分子結構中基團種類（氨基、醛基或巰基）及分子理化性質（酸性、中性或堿性），選擇相應的活化生物素和反應條件。②控制每個蛋白質分于上標記的生物素分子數(shù)量在一定范圍，以免影響標記物活性。③在生物索與被標記物間加入交聯(lián)臂樣結構，減少大分于物質造成的空間位阻，利于結合。④生物素與抗原、抗體等蛋白質結合后應不影響后者的免疫活性。2021/3/1074三、親和素、鏈霉親和素的理化性質與標記親和素及其活性

親和素在純水中的溶解度類似于球蛋白，而在50％硫酸銨溶液中的溶解度又與白蛋白相似，親和素富含的色氨酸與其活性密切相關，是親和素與生物素咪唑環(huán)酮結合的基團。2021/3/1075鏈霉親和素及其活性

①鏈霉親和素（streptavidin，SA）是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質，分子量為65kD。②鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，結合生物素的活性基團是肽鏈中色氨酸殘基；③與親和素一樣，一個鏈霉親和素分子也能結合4個生物素分子。④鏈霉親和素可在N端10～12和Ｃ端19-21間斷裂，形成的核心鏈霉親和素仍然保持完整的結合生物素的能力。2021/3/1076親和素（或鏈霉親和素）的標記

幾乎所有用于標記的物質均可以同親和素（AV）或鏈霉親合素（SA）結合。小分子