標(biāo)記免疫技術(shù)

標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)2021/3/102標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)生物素-親和素免疫放大技術(shù)

……2021/3/103第一節(jié)酶免疫技術(shù)

基本原理

利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。2021/3/104

基本特點：

①標(biāo)記后保留酶和抗原(抗體)的活性。②酶促反應(yīng)專一性，保證特異性。③底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性。④酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定。⑤操作簡便，安全易行。2021/3/105一、

酶免疫技術(shù)的分類

酶免疫組化用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術(shù)均相酶免疫測定酶免疫測定固相酶免疫測定異相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定2021/3/106二、酶免疫技術(shù)的技術(shù)要點

（一）固相載體基本要求結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經(jīng)濟。2021/3/107種類與選擇1.塑料制品2.微顆粒3.膜載體2021/3/108（二）酶與酶作用底物1.用于標(biāo)記酶的要求：酶活性高標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性酶催化底物后信號易判定或測定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無害，價廉2021/3/1092.常用酶及其底物（1）辣根過氧化物酶（HRP）

常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。2021/3/1010（2）堿性磷酸酶（AP）

常用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)記物收率低于HRP，且價高，故應(yīng)用不如HRP普及。2021/3/1011（三）酶標(biāo)記抗體或抗原基本要求：

酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價高，親和力強，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化。2021/3/1012酶標(biāo)記方法

1.交聯(lián)法

以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法

用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標(biāo)記物制備。2021/3/1013（四）標(biāo)記抗體鑒定（五）免疫吸附劑（六）試劑最佳工作濃度的選擇2021/3/1014三、酶聯(lián)免疫吸附試驗

(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)(一)基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）

在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）2021/3/1015用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）

加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）2021/3/1016（二）ELISA技術(shù)類型：ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。

2021/3/10171．雙抗體夾心法2021/3/1018特點：非競爭結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇

2021/3/10192．間接法2021/3/10203.競爭法2021/3/1021特點：用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結(jié)合位點少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（Ab）的濃度成反比。2021/3/10224.捕獲法（反向間接法）

主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。2021/3/1023注意事項：加樣

應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。保溫

1、一般均采用水浴箱，使溫度迅速平衡。

2、為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。2021/3/1024洗滌：

決定著實驗的成敗。目的：洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。2021/3/1025比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。用特定的波長測讀吸光值。

比色結(jié)果的表達以往通用光密度（opticaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。2021/3/1026四、均相酶免疫吸測定

基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進而推算出待檢樣品中的抗原量。

主要用于小分子抗原或半抗原的檢測.2021/3/1027(一)酶擴大免疫測定技術(shù):

（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）基本原理:半抗原與酶結(jié)合成酶標(biāo)半抗原，保留半抗原和酶的活性。當(dāng)酶標(biāo)半抗原與抗體結(jié)合后，所標(biāo)的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被抑制。2021/3/1028（二）克隆酶供體免疫測定

（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）

利用重組DNA技術(shù)制備β-半乳糖苷酶的兩個片段：大片段稱為酶受體（enzymeacceptor,EA），小片段稱為酶供體（enzymedonor,ED），兩個片段本身均不具酶活性，但結(jié)合在一起就具有酶活性，利用這一特性建立的均相酶免疫測定稱為克隆酶供體免疫測定(CEDIA)。

CEDIA的反應(yīng)模式為競爭法。2021/3/1029基本原理：標(biāo)本中的抗原和ED標(biāo)記的抗原與特異性抗體競爭結(jié)合，形成兩種抗原抗體復(fù)合物。ED標(biāo)記的抗原與抗體結(jié)合后由于空間位阻，不能再與EA結(jié)合。反應(yīng)平衡后，剩余的ED標(biāo)記抗原與EA結(jié)合，形成具有活性的酶，加入底物測定酶活力，酶活力的大小與標(biāo)本中抗原含量呈正比。2021/3/1030五、固相膜免疫測定

固相膜免疫測定與ELISA相類似,其特點是以微孔膜作為固相.標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素（NC）膜。類型：免疫滲濾試驗：穿流形式免疫層析試驗：橫流形式斑點酶免疫吸附試驗（dot-ELISA）免疫印跡法

(Westernblot)2021/3/1031（一）斑點ELISA(dot-ELISA)2021/3/1032（二）免疫印跡法

（immunoblottingtest，IBT）亦被稱為Westernblot分三個階段進行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫定位

2021/3/1033免疫印跡法原理示意圖

2021/3/1034第二節(jié)熒光免疫技術(shù)

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種方法。2021/3/1035基本原理

利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。2021/3/1036一、免疫熒光顯微技術(shù)（一）基本原理：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。2021/3/1037（二）熒光抗體的制備（1）熒光抗體的標(biāo)記作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求：

①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價健的化學(xué)基團，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

⑤標(biāo)記方法簡單、安全無毒。2021/3/1038熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價結(jié)合而成。常用于標(biāo)記的熒光素：異硫氰酸熒光黃（FITC）

四乙基羅丹明（RB200）

四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記方法：攪拌法(適合大樣品)

透析法(適合小樣品)標(biāo)記抗體的純化：透析法、層析分離法2021/3/1039（2）熒光抗體的鑒定F/P比率：

將制備的熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測讀A280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰。

2021/3/1040F/P值越高，說明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細胞染色的以F/P＝2.4為宜。

2021/3/1041抗體效價：效價越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在1:16-1:32者較為理想?？贵w特異性

：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強烈熒光。

2021/3/1042（三）技術(shù)類型

直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異熒光染色因素少。缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。2021/3/1043間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。2021/3/1044（四）熒光免疫顯微技術(shù)在

醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用1．血清中自身抗體的檢測2．各種微生物階快速檢查和鑒定3．寄生蟲感染的診斷4．白細胞分化抗原的檢測5．人類白細胞抗原(HLA)的檢測6．腫瘤組織中腫瘤抗原的檢測7．組織中免疫球蛋白和補體組分的檢測8．激素和酶的組織定位2021/3/1045二、熒光免疫測定技術(shù)

熒光免疫測定同酶免疫測定一樣，根據(jù)抗原抗體結(jié)合后是否需要將結(jié)合狀態(tài)與游離狀態(tài)的的熒光標(biāo)記抗原（或抗體）分離開，而將之為均相和非均相兩種類型。

2021/3/1046(一)時間分辨熒光免疫測定

1.基本原理時間分辨熒光免疫測定(time-resolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA)是熒光分析（FIA）的基礎(chǔ)上，用具較長壽命熒光的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的作為標(biāo)記物來標(biāo)記抗體或抗原，從而檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原或抗體的新技術(shù)。

2021/3/10472.技術(shù)類型

(1)固相雙位點夾心法(2)固相抗原競爭法(3)固相抗體競爭法2021/3/1048(二)熒光偏振免疫測定

FPIA是一種均相競爭熒光免疫分析法。其原理是：標(biāo)本中的抗原與熒光標(biāo)記的抗原競爭結(jié)合抗體。反應(yīng)平衡后，與抗體結(jié)合的熒光標(biāo)記抗原的量與標(biāo)本中抗原濃度的量呈反比。由于抗體的分子量遠大于抗原的分子量，游離的熒光標(biāo)記抗原與結(jié)合抗體的熒光標(biāo)記抗原所產(chǎn)生的偏振熒光強度相差甚遠。因此在FPIA中測定的偏振熒光強度與標(biāo)本中抗原的濃度呈反比。通過小分子抗原標(biāo)準(zhǔn)品與熒光偏振強度關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可檢測小分子抗原的濃度。2021/3/1049第三節(jié)放射免疫技術(shù)

放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術(shù)還包括放射受體分析（使用受體測量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點:靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強、重復(fù)性好等2021/3/1050一、放射免疫分析（RIA）基本原理

采用定量的標(biāo)記抗原（Ag＋）和非標(biāo)記抗原（Ag）競爭性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。2021/3/1051二、免疫放射分析（IRMA）基本原理單位點IRMA：利用過量標(biāo)記抗體與待測抗原進行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離，測定上清液的放射量。2021/3/1052雙位點IRMA

先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相抗原的另一抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物,洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體,測定固相上的放射性。2021/3/1053IRMA與RIA的異同點1.標(biāo)記物2．反應(yīng)速率3．反應(yīng)原理4．特異性5．靈敏度和檢測范圍6．分析誤差

2021/3/1054第四節(jié)發(fā)光免疫技術(shù)

發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmuno-technique)是將發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測定相結(jié)合而建立的一種新的超微量免疫分析技術(shù)。該方法既具有免疫反應(yīng)的高度特異性又有發(fā)光分析的高靈敏度。2021/3/1055根據(jù)發(fā)光免疫技術(shù)中發(fā)光標(biāo)記物不同，分為三種類型?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmuneassay，CLIA)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(luminescenceenzymeimmunoassay，IEIA)生物發(fā)光免疫分析（bioluminescenceimmunoassay，BLIA）2021/3/1056一、發(fā)光與發(fā)光底物（一）發(fā)光（二）光照發(fā)光（三）生物發(fā)光（四）化學(xué)發(fā)光氨基苯二酰肼類、吖啶酯（acridiniumester，AE）類2021/3/1057二、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)

（一）發(fā)光標(biāo)記法的分類生物標(biāo)記法（直接合成法）直接化學(xué)發(fā)光劑物質(zhì)標(biāo)記法（直接偶聯(lián)法）催化劑和協(xié)同因子標(biāo)記抗原抗體法（間接偶聯(lián)法）2021/3/1058（二）標(biāo)記方法碳二亞胺（EDC）縮合法重氮鹽偶聯(lián)法（重氮化法）過碘酸鹽法戊二醛法琥珀酸酐法異硫氰酸酯衍生物法O-（羧甲基）羧胺法2021/3/1059第五節(jié)金標(biāo)記免疫技術(shù)

金標(biāo)記免疫技術(shù)（immunogoldlabelingtechnique）是以膠體金作為標(biāo)記抗原或抗體，檢測樣品中抗體或抗原的性質(zhì)、含量、形態(tài)學(xué)特征等進行分析的綜合技術(shù)。它是利用金顆粒光學(xué)檢測的靈敏性與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種技術(shù)。2021/3/1060一、膠體金的特性（一）膠體特性（二）光學(xué)特性（二）穩(wěn)定性（三）溶膠的聚沉現(xiàn)象2021/3/1061二、膠體金標(biāo)記技術(shù)的類型

（一）斑點金免疫滲濾試驗1.原理斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)是以NC膜為載體，包被抗原或抗體于滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜貼置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達到快速檢測目的(一般5min左右完成)。2021/3/10622.技術(shù)類型

（1）雙抗體夾心法（2）間接法金免疫滲濾裝置示意圖

2021/3/1063（二）斑點免疫層析試驗1.原理斑點免疫層析試驗（dot-immunochromatographicassay，DICA）簡稱免疫層析試驗（ICA），也以NC膜為載體，但利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般。在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判斷實驗結(jié)果。2021/3/10642.技術(shù)類型

（1）雙抗體夾心法（2）競爭法（3）間接法免疫層析試驗原理示意圖

2021/3/1065第六節(jié)生物素-親和素

免疫放大技術(shù)

生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem，BAS）是以生物素和親和素具有的獨特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，結(jié)合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，它們的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級放大效應(yīng)。2021/3/1066一、生物素-親和素系統(tǒng)的特點生物素（biontin，B）由卵黃和肝組織中提取，分子量244.31kD生物素分子有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)

Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)，與親和素結(jié)合的主要部位；

II環(huán)為噻吩環(huán)，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的惟一結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后成為活化生物素。2021/3/1067親和素（avidin，AV）亦稱抗生物素蛋白、卵白素由卵白蛋白中提取，4個相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68kD耐熱井耐受多種蛋白水解酶的作用．尤其是與生物素結(jié)合后，穩(wěn)定性更好。每個親和素能結(jié)合4個分子的生物素，二者之間的親和力極強，比抗原與抗體間的親和力至少高1萬倍，因此二者的結(jié)合特異性高和穩(wěn)定性好。2021/3/1068

BAS特點：靈敏度

①形成的生物素衍生物，保持原有生物活性，比活度高，具多價性。②每個親和素分子有四個生物素結(jié)合部位，可同時以多價形式結(jié)合生物素化的大分子衍生物和標(biāo)記物。③具有多級放大作用，提高靈敏度。2021/3/1069特異性

①具有極高的親和力，其反應(yīng)呈高度專一性；②不會因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響，可最大限度地降低反應(yīng)試劑的非特異作用。穩(wěn)定性

①親和常數(shù)極高，解離常數(shù)很小，反應(yīng)不可逆；②酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結(jié)合。2021/3/1070適用性

①可與酶、熒光素和放射性核素等各類標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，用于檢測體液、組織或細胞中的抗原-抗體、激素—受體和核酸系統(tǒng)以及其他多種生物學(xué)反應(yīng)體系，②可制成親和介質(zhì)，用于分離提純上述各反應(yīng)體系中的反應(yīng)物。其他

①可制成多種通用性試劑，實驗成本低；②結(jié)合具高速、高效的特性，所需的溫育時間短，實驗往往只需數(shù)小時即可完成．2021/3/1071二、生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記生物素及其活化

生物素經(jīng)活化后，可容易地與各種抗原、抗體、酶及核酸分子中相應(yīng)基團偶聯(lián)形成生物素化標(biāo)記物。

常用的活化生物素的標(biāo)記制備方法

①標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素②標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素③標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素

④標(biāo)記核酸的活化生物素2021/3/1072生物素化蛋白質(zhì)衍生物

特性：

一個蛋白質(zhì)分子可聯(lián)結(jié)多個生物素分子，具較高的比活性，在與親和素的反應(yīng)中成為多價。生物素化大分子的多價性，是BAS多級放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

類型：（二類）①生物素化的大分子生物活性物質(zhì)如：抗原、抗體等②標(biāo)記材料結(jié)合生物素后制成的標(biāo)記物如：酶類等2021/3/1073蛋白質(zhì)生物素標(biāo)記注意事項：①應(yīng)根據(jù)抗原或抗體分子結(jié)構(gòu)中基團種類（氨基、醛基或巰基）及分子理化性質(zhì)（酸性、中性或堿性），選擇相應(yīng)的活化生物素和反應(yīng)條件。②控制每個蛋白質(zhì)分于上標(biāo)記的生物素分子數(shù)量在一定范圍，以免影響標(biāo)記物活性。③在生物索與被標(biāo)記物間加入交聯(lián)臂樣結(jié)構(gòu)，減少大分于物質(zhì)造成的空間位阻，利于結(jié)合。④生物素與抗原、抗體等蛋白質(zhì)結(jié)合后應(yīng)不影響后者的免疫活性。2021/3/1074三、親和素、鏈霉親和素的理化性質(zhì)與標(biāo)記親和素及其活性

親和素在純水中的溶解度類似于球蛋白，而在50％硫酸銨溶液中的溶解度又與白蛋白相似，親和素富含的色氨酸與其活性密切相關(guān)，是親和素與生物素咪唑環(huán)酮結(jié)合的基團。2021/3/1075鏈霉親和素及其活性

①鏈霉親和素（streptavidin，SA）是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為65kD。②鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，結(jié)合生物素的活性基團是肽鏈中色氨酸殘基；③與親和素一樣，一個鏈霉親和素分子也能結(jié)合4個生物素分子。④鏈霉親和素可在N端10～12和Ｃ端19-21間斷裂，形成的核心鏈霉親和素仍然保持完整的結(jié)合生物素的能力。2021/3/1076親和素（或鏈霉親和素）的標(biāo)記

幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親和素（AV）或鏈霉親合素（SA）結(jié)合。小分子