核酸分離與純化

1核酸是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的主要研究對象，許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的第一步都要進(jìn)行核酸的提取，如PCR、基因測序及分子克隆等.提取核酸的種類:真核細(xì)胞基因組DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA及mRNA第1頁/共32頁2

提取的核酸樣品的完整性和純度直接關(guān)系到最后實(shí)驗(yàn)的結(jié)果鑒定技術(shù):

分光光度技術(shù):樣品定量、純度鑒定凝膠電泳技術(shù):樣品定量、純度鑒定分子量測定、分離核酸片段第2頁/共32頁3第一節(jié)核酸分離與純化的基本過程一、材料與方法

1.材料：血液、尿液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞

2.方法：保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性原則排除其他分子的污染，保證樣品的純度第3頁/共32頁4二、技術(shù)路線

1.核酸的釋放

破碎細(xì)胞，釋放核酸

方法：機(jī)械法破壞線性DNA

非機(jī)械法

2.核酸的分離與純化大分子污染物污染物非需要的核酸分子對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有影響的溶液和試劑

第4頁/共32頁5

3.核酸的濃縮、沉淀與洗滌濃縮:

沉淀：有機(jī)溶劑沉淀法原理：

洗滌：用70％～75％乙醇去除沉淀中的鹽第5頁/共32頁6

4、鑒定與保存

1.）核酸的鑒定濃度、純度、完整性

①濃度鑒定

a紫外分光光度法260nm

在標(biāo)準(zhǔn)條件下，1個(gè)吸光度單位相當(dāng)于

50g/ml的雙鏈DNA38g/ml的單鏈DNA或RNA33g/ml的單鏈寡聚核苷酸

b熒光光度法

熒光染料：溴化乙錠

發(fā)出橙紅色熒光

第6頁/共32頁7

②純度鑒定

a紫外分光光度法：測A260／A280的比值判斷是否有蛋白質(zhì)污染

（為什么）

A260／A280比值為1.8，純DNAA260／A280比值為2.0,純RNAb熒光光度法：用溴化乙錠為染料示蹤核酸電泳結(jié)果判斷純度第7頁/共32頁8

③完整性鑒定：用溴化乙錠為染料示蹤核酸電泳結(jié)果判斷完整性。

2）核酸的保存

①

DNA的保存

pH影響DNA穩(wěn)定性pH7.0~8.0EDTA減少二價(jià)金屬離子氯仿防止細(xì)菌污染溫度低溫-70℃保存數(shù)年

4℃保存第8頁/共32頁9

②

RNA的保存

a0.3mol／L的醋酸鈉或雙蒸水，-70℃～-80℃。若加入RNA酶抑制劑可延長保存時(shí)間。

b將RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，-20℃可長期保存。

小量分裝保存第9頁/共32頁10第二節(jié)基因組DNA的分離與純化一、分離與純化的方法

1.酚抽提法:EDTA裂解緩沖液SDS裂解細(xì)胞蛋白酶KRNA酶

pH8.0的Tris飽和酚抽提醋酸銨、無水乙醇沉淀70％乙醇洗滌DNA

第10頁/共32頁11第11頁/共32頁122.DNA樣品的進(jìn)一步純化方法:透析、層析、電泳、選擇性沉淀聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳第12頁/共32頁13二、DNA片段的回收

(一)原則與要求

1.提高DNA片段的回收率

2.除去回收DNA樣品中的污染

(二)回收方法：

1.DEAE纖維素膜插片電泳法瓊脂糖凝膠

2.電泳洗脫法

3.壓碎與浸泡法聚丙烯酰胺凝膠第13頁/共32頁14第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化一、提取與純化基本過程：細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌裂解提取質(zhì)粒

1.提取方法：堿裂解法煮沸裂解法

SDS裂解法

2.純化方法：氯化銫-溴化乙錠等密度梯度超速離心法（CsCI-EB法）聚乙二醇沉淀法第14頁/共32頁15

裂解細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)、染色體變性釋放質(zhì)粒DNA調(diào)pH中性質(zhì)粒DNA恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)沉淀（質(zhì)粒DNA溶于上清液中）取上清液無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA70％乙醇洗滌質(zhì)粒DNApH12.0~12.6高濃度鹽第15頁/共32頁16第16頁/共32頁17二、質(zhì)粒DNA的回收提取純化的質(zhì)粒DNA凝膠電泳回收第17頁/共32頁18第四節(jié)RNA的分離與純化rRNA80~85%tRNA15~20%總RNAmRNA1~5%

mRNA一、RNA制備的條件與環(huán)境

RNase

注意：1.細(xì)胞外RNase的污染

2.

抑制細(xì)胞內(nèi)RNase

第18頁/共32頁19措施：1.潔凈的實(shí)驗(yàn)室

2.戴手套與口罩

3.一次性的實(shí)驗(yàn)材料和新包裝的試劑

4.玻璃器皿用DEPC處理

5.冰浴條件下進(jìn)行操作第19頁/共32頁20二、總RNA的分離與純化（異）硫氰酸胍-酚氯仿一步法硫氰酸胍+β-巰基乙醇裂解細(xì)胞酚／氯仿抽提裂解溶液異丙醇沉淀75％乙醇洗滌RNApH4.0第20頁/共32頁21三、mRNA的分離與純化

細(xì)胞內(nèi)mRNA特點(diǎn)：含量少種類多分子大小不一

mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：多聚腺苷酸尾（polyA）方法：oligo(dT)-纖維素柱層析法

oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法第21頁/共32頁22第22頁/共32頁23第五節(jié)DNA測序

主要方法:

雙脫氧末端終止法

Maxam-Gilbert化學(xué)降解法

DNA自動(dòng)化測序第23頁/共32頁24一、雙脫氧末端終止法原理：模板：單鏈DNA（待測序的DNA）酶：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

引物：5｀端標(biāo)記的寡核苷酸鏈底物：dNTP(AGCT)

ddNTP(AGCT)第24頁/共32頁25

反應(yīng)體系：四組獨(dú)立的反應(yīng)體系每組均含有dNTP(AGCT)

ddNTP(一種)

操作：

1.獲得標(biāo)記片段組

2.電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

3.顯影

4.讀序第25頁/共32頁26第26頁/共32頁27第27頁/共32頁28二、Maxam-Gilbert化學(xué)降解法

待測DNA標(biāo)記四組獨(dú)立反應(yīng)體系針對某一種堿基進(jìn)行切割第2