核酸的提取及相關(guān)

核酸的提取及相關(guān)技術(shù)質(zhì)粒DNA的提取、分離和純化基因組DNA的提取總RNA的提取、分離和純化mRNA的分離和純化核酸電泳技術(shù)限制性內(nèi)切酶I.質(zhì)粒DNA的提取、分離和純化一、質(zhì)粒的基本性質(zhì)

質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,簡(jiǎn)稱cccDNA）

，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，但質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄需要宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)。此外，質(zhì)粒還具有編碼某些酶的基因，如對(duì)抗生素的抗性等。

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有二種：緊密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子；后者在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，一般在20個(gè)以上。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，加適當(dāng)氯霉素可使松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)由原來(lái)的20多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000個(gè)。

質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）

利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在，當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)入同一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞過(guò)程中相互競(jìng)爭(zhēng)，只有一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì)。這樣，過(guò)幾代后，占小數(shù)的質(zhì)粒將丟失，在細(xì)胞后代中只有二種質(zhì)粒中的一種。這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）。但利用不同復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)?？稍谕凰拗骷?xì)胞中共同存在。二、質(zhì)粒DNA的制備基本原理(堿法）

從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA.①采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，SDS和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。②處理后細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。③當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線形染色體DNA變性，而cccDNA的二條鏈不會(huì)相互分開。④當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。⑤通過(guò)離心可獲得質(zhì)粒DNA。三、試劑LB液體培養(yǎng)基:

蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeastextract）5g,NaCl10g,用NaOH調(diào)至。高壓下蒸汽滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基：每升液體培養(yǎng)基加12g瓊脂粉，高壓下蒸汽滅菌20分鐘。氨芐青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20

℃下保存?zhèn)溆?。溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTrisCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0).高壓蒸汽滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4oC冰箱。溶液II：0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋)，1%SDS.溶液III:5mol/LKAC60ml,冰醋酸11.5ml,水28.5ml.RNaseA母液：將RNaseA酶粉溶于10mmol/LTrisCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl,終濃度為10mg/ml。100℃加熱15分鐘，冷卻后分裝。飽和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羥基喹啉，并用等體積的0.5mol/LTrisCl(pH8.0)和0.1mol/LTrisCl(pH8.0)緩沖液反復(fù)抽提，使pH達(dá)到7.6以上。氯仿：按氯仿/異戊醇=24：1混合。酚/氯仿：將上述飽和酚和氯仿按1：1混合。TE緩沖液：10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).高壓蒸氣滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4℃冰箱。四、操作步驟1．細(xì)菌的培養(yǎng)和收集：將含有質(zhì)粒pBS的DH5菌株接種在LB固體培養(yǎng)基（含50g/mlAmp）中，37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基（含50g/mlAmp）中，37℃培養(yǎng)約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。2．

質(zhì)粒DNA的少量快速提取---堿裂解法

1).

取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mlependorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2).

棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)秒鐘，使液體流盡。

3).

菌體沉淀重懸浮于100l溶液I中（激烈震蕩，充分混勻），室溫下放置5-10分鐘。

4).

加入新配制的溶液II200l，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和顛倒ependorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬(wàn)不要震蕩）中，冰浴中放置5分鐘。

5).

加入150l預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和顛倒

ependorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物，冰浴中放置5-10分鐘。4℃下

12000g離心5-10分鐘,取上清。6).將上清液移入干凈ependorf管中，加入等體積的酚/氯仿(1:1)，震蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。7).將上清液移入干凈ependorf管中，加入等體積的氯仿，震蕩混勻，4℃下12000g離心5分鐘。8).

將水相移入干凈ependorf管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，震蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘。然后在4℃下12000g離心10分鐘。9).

棄上清液，將管口敞開并倒置于衛(wèi)生紙上，使液體流盡。加入1ml70%乙醇洗滌沉淀。4℃下12000g離心5-10分鐘。10).

吸去上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體流盡，室溫干燥或真空干燥10分鐘.11).將沉淀溶于20lTE緩沖液（pH8.0,含20g/mlRNaseA）中，儲(chǔ)于-20℃

C冰箱.

附:

日常型質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒

（硅膜吸附）原理：帶負(fù)電荷的DNA和帶正電的二氧化硅粒子有很高的親和力。陽(yáng)離子Na發(fā)揮橋梁作用，吸附核酸磷酸鹽骨架上帶負(fù)電荷的氧，在高鹽的酸性條件下，Na+

打破水中的氫和二氧化硅上帶負(fù)電荷的氧離子間的氫鍵，DNA與二氧化硅緊密結(jié)合，先洗滌除去其他雜質(zhì)，再用低離子強(qiáng)度的TE緩沖液或蒸餾水洗脫結(jié)合的DNA分子。該試劑盒沿用傳統(tǒng)的SDS堿裂解法，結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA的目的。適合于從4mlLB細(xì)菌培養(yǎng)物中提取5～20ug純凈的質(zhì)粒DNA，用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。操作步驟

第一次使用時(shí)，將試劑盒攜帶的RNaseAl全部加入到S1溶液中，混合均勻，4℃保存。1．取3ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液(若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少)，12000rpm離心20s，棄盡上清；2．用0.25ml已加入RNaseAl的S1溶液懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊；3．加0.25mlS2溶液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過(guò)5min；4．加入0.5ml4℃預(yù)冷的S3溶液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻，直至形成緊實(shí)的凝集塊，室溫靜置2min。最高速度(12000rpm)離心5min；操作步驟(續(xù))5．吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心lmin。如制備管中有液體殘留，適當(dāng)提高離心速度，再離心1min，棄濾液；6．將制備管置回離心管，加0.5mlWl溶液，3600rpm離心30s，棄濾液；7．將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s；以同樣的方法再用0.7mlW2溶液洗滌一次。棄濾液；8．將制備管移入離心管中，12000rpm離心1min；9．將制備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置lmin。12000rpm離心lmin洗脫DNA。質(zhì)粒DNA電源圖磁珠法提取DNA原理1994年T．L．Hawkins等發(fā)現(xiàn)羧基高分子表面在一定濃度PEG／NaCl條件下具有吸附核酸的能力，而在水或TE溶液中核酸又可以解吸附。因此，在磁珠表面連接可特異地與DNA發(fā)生作用的功能基團(tuán)，使其具有可逆吸附DNA的特性。通常采用帶有氨基、巰基、環(huán)氧基等基團(tuán)的活化試劑對(duì)磁珠表面包覆的高分子進(jìn)行化學(xué)修飾。高鹽離子濃度下多聚核苷酸與羧基修飾的磁珠表面可發(fā)生非特異性吸附，而蛋白、單糖、多糖和脂類等細(xì)胞成分不被吸附的原理，這樣就建立了一種以磁性微珠為載體的DNA純化方法。相對(duì)微米或亞微米級(jí)載體，納米磁性粒子具有尺寸小、偶聯(lián)容量大、懸浮穩(wěn)定性高及超順磁性等優(yōu)點(diǎn)，便于各種反應(yīng)高效快速進(jìn)行。

該核酸提取法對(duì)DNA結(jié)構(gòu)沒(méi)有損傷，生物相容性高，DNA可直接洗脫應(yīng)用，純度及純化效率等方面都較高。II、基因組DNA的提取一、概述

染色體DNA通常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)和Southern雜交等，同時(shí)在目前廣受人們關(guān)注的生物基因組學(xué)研究中是最重要的研究目標(biāo)。1、基因組文庫(kù)的構(gòu)建：當(dāng)用于構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)，所得的染色體DNA的片段長(zhǎng)度應(yīng)盡可能的長(zhǎng)（至少應(yīng)大于需克隆片段的4倍）。當(dāng)用Cosmid構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，片段長(zhǎng)度應(yīng)大于200kb;用噬菌體構(gòu)建文庫(kù)時(shí)應(yīng)大于80kb。但在制備過(guò)程中，有機(jī)溶劑的抽提、震蕩、反復(fù)抽提和乙醇沉淀等步驟都會(huì)造成DNA斷裂。我們應(yīng)盡可能采用溫和的方法和手段。2、Southern雜交：用于Southern雜交的染色體DNA片段長(zhǎng)度要求可適當(dāng)降低。3、PCR\AFLP\RFLP等：DNA片段長(zhǎng)度要求可適當(dāng)降低。一、概述

不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同；同種生物的不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)，必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立的相應(yīng)提取方法，以獲得可用的DNA大分子。不同的植物材料提取的方法有差異，主要在提取緩沖液的成分上，如李、蘋果的植物的染色體DNA提取所用的提取緩沖液為：18.6g葡萄糖、6.9g二乙基二硫代碳酸鈉（Sarkosyl）、6.0gPVP、240ul巰基乙醇、加水至300ml二、植物基因組DNA提取

(水稻和其它禾本科植物)1、試劑

A.提取緩沖液：100mmol/LTris·Cl（pH8.0）、

20mmol/LEDTA、500mmol/LNaCl、1.5%SDS。

B.氯仿/戊醇/乙醇溶液:80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

C.異丙醇

D.TE:10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).

高壓蒸氣滅菌15分鐘,儲(chǔ)存于4℃冰箱。

E.RNaseA：10mg/mlF.3mol/LNaAC2、實(shí)驗(yàn)步驟在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液，60℃水浴預(yù)熱。水稻幼苗或葉子5-10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的含提取緩沖液的離心管中，劇烈搖動(dòng)混勻，60℃水浴保溫30-60分鐘（時(shí)間長(zhǎng)，DNA產(chǎn)量高），不時(shí)搖動(dòng)。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻（需帶手套，防止損傷皮膚），室溫下靜置5-10分鐘，使水相和有機(jī)相分層（必要時(shí)可重新混勻）。室溫下5000rpm離心5分鐘。仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。轉(zhuǎn)入含1mlTE

的1.5mleppendorf管中，DNA很快溶解于TE。如DNA不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。2、實(shí)驗(yàn)步驟(續(xù)）H.

將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。I.加入5ulRNaseA（10ug/ul），37℃10分鐘，除去RNA（RNA對(duì)DNA的操作分析一般無(wú)影響，可省略該步驟）。J.加入1/10體積的3mol/LNaAC及2x體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20分鐘左右，使DNA形成絮狀沉淀。K.用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。L.將DNA重新溶解于1mlTE中，-20℃貯存。M.取2ulDNA樣品在0.7%Agarose膠上電泳，檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)可取15ul稀釋20倍，測(cè)定OD260/OD280，檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。3、DNA純度與濃度測(cè)定A、DNA純度：DNA的OD260/OD280一般為1.8左右。

OD260/OD2801.8：說(shuō)明較純；

OD260/OD2801.8：說(shuō)明可能有RNA污染；

OD260/OD2801.8：說(shuō)明可能有蛋白質(zhì)污染。B、DNA濃度：當(dāng)OD260為1時(shí)，dsDNA含量為50ug/ml,ssDNA或RNA含量為40g/ml；單鏈寡核苷酸為20ug/ml.[dsDNA]（μg/ml）=50×OD260×稀釋倍數(shù)附:動(dòng)/植物基因組DNA小量純化試劑盒1、基本原理：該試劑盒采用公司自身研制的相分離技術(shù)和DNA制備膜選擇性吸附DNA

的原理從1-10mg新鮮動(dòng)物組織或2-20mg新鮮植物組織中提取至多20ug純凈的染色體DNA.

2、實(shí)驗(yàn)步驟

樣品收集：100mg新鮮植物葉片，剪刀成小塊，放入研缽中，加入液氮，使植物組織冷凍完全后，快速、用力研磨至粉末狀。研磨時(shí)應(yīng)間斷加入液氮防止組織融化。研磨充分后將研缽放入65℃水浴至樣品粉末剛開始融化。加入700ulG-A溶液和1.2ulRNaseA1貯存液，用力研磨30秒。轉(zhuǎn)移650ul研磨好的勻漿至2ml離心管中，如體積不到650ul,加bufferG-A溶液至650ul,65℃下保溫15min。加400ulG-B溶液和1mlDV溶液(4℃預(yù)冷），用力混勻，12000g離心2min.去上相液體，保留間相和下相溶液。加入1mlDV溶液(4℃預(yù)冷），用力混勻，12000g離心2min.去上相液體，將下相溶液轉(zhuǎn)移至微量濾器(置于2ml離心管中）。12000g離心30秒。2、實(shí)驗(yàn)步驟棄上相，在過(guò)濾液中加入400ulDV溶液,混合均勻。將制備管置于2ml離心管中，加入步驟G的樣品。12000g離心30秒。棄濾液，將制備管置于原2ml離心管中,加入500ulWl溶液，12000g離心30秒。棄濾液，將制備管置于原2ml離心管中,加入700ulW2溶液，12000g離心30秒。棄濾液，將制備管置于原2ml離心管中,加入500ulW2溶液，12000g離心1min。將制備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加100-200μl水或洗脫液，室溫靜置lmin。最高速度離心lmin洗脫DNA。三、細(xì)菌基因組DNA提取1、試劑10%SDS蛋白酶K(20mg/ml)氯仿：異戊醇（24：1）;苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）70%乙醇TE,5mol/LNaCl.RNaseA：10mg/mlCTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，緩慢加入10gCTAB,加水至100ml.(NaCl:Mr.58;0.8Mol/L)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)

CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里。

在高離子強(qiáng)度的溶液里，CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)多聚糖(除酸性多聚糖)形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。因此CTAB可以用于從大量產(chǎn)生黏多糖的有機(jī)體如植物以及某些革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌的某些株)中制備純化DNA。

CTAB在制備基因組DNA的基本沉淀程序：這種去污劑加入調(diào)節(jié)至高離子強(qiáng)度(>0.7mol/LNaCl)的細(xì)菌或細(xì)胞裂解液中。經(jīng)過(guò)連續(xù)的酚和氯仿抽提去除CTAB／黏多糖／蛋白質(zhì)復(fù)合物，用異丙醇／無(wú)水乙醇沉淀上清即可獲得基因組DNA。CTAB結(jié)構(gòu)式2、實(shí)驗(yàn)步驟：5ml細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)夜，12000rpm離心3分鐘，去上清液。加567ulTE溶液懸浮沉淀，并加30ul10%SDS,3ul蛋白酶K(20mg/ml),混勻，37℃水浴保溫1小時(shí)。加100ul的5mol/LNaCl,混勻。加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴保溫10min.用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇抽提，12000rpm離心3分鐘。仔細(xì)移取上清液至另一離心管中，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置10min,即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。用勾狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán)，在70%乙醇中漂洗后在干凈吸水紙上吸干，室溫下干燥后轉(zhuǎn)入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20℃。取2ulDNA樣品在0.7%Agarose膠上電泳，檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)取15ul稀釋20倍，測(cè)定OD260/OD280，檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。附注如需降解RNA,則在步驟G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37℃保溫30分鐘，除去RNA（RNA對(duì)DNA的操作、分析一般無(wú)影響，可省略該步驟）。用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇抽提，5000rpm離心10分鐘。上清液至另一離心管中，加入1/10體積的3mol/LNaAC及2x體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20分鐘左右，使DNA形成絮狀沉淀。用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。將DNA重新溶解于1mlTE中，-20℃貯存。附:細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟：樣品收集：1ml細(xì)菌培養(yǎng)液5000rpm離心3分鐘，用0.8ml細(xì)菌原生質(zhì)體制備緩沖液懸浮沉淀，加20ul溶菌酶貯存液，冰上放置10min.加0.3ml的0.25MEDTA,pH8.0,混合均勻，冰上放置5min。加0.3ml洗脫液，37℃保溫5min.5000rpm離心5min.去上清，加0.1mlS-G溶液，徹底懸浮沉淀，冰浴5min.加0.45ml50℃預(yù)熱的G-A溶液，用1ml槍頭快速吸注10次；若太粘稠，則在45℃下保溫5min,再用1ml槍頭快速吸注10次。冰浴5min.加0.15mlG-C溶液，混勻，12000rpm離心1min.將樣品加于微量濾器（置于2ml離心管中），12000rpm離心1min.實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）吸取步驟E中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心1min。如制備管中有液體殘留，適當(dāng)提高離心速度，再離心1min，棄濾液；將制備管置回離心管，加0.5mlWl溶液，3600rpm離心30s，棄濾液；將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s；以同樣的方法再用0.7mlW2溶液洗滌一次。棄濾液；將制備管置于離心管中，12000rpm離心1min.將制備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置1min。最高速度離心1min洗脫DNA。細(xì)菌基因組DNA電源圖真核細(xì)胞基因組DNA電源圖III、總RNA的制備一、概述

中心法則:DNAmRNA蛋白質(zhì)

真核生物mRNA的特點(diǎn):真核生物的基因中有許多內(nèi)含子,需要通過(guò)RNA的拼接加工,才能成為成熟的mRNA.因此真核生物中提取的mRNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)而克隆基因已成為分子生物學(xué)最重要的方法之一.

通常一個(gè)典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5ugRNA,但其中大部分為rRNA（28S,18S及5S）和各種低分子量的RNA(tRNA,小核RNA等),只有1-5%為mRNA。這些mRNA的大小和序列不一,

但其3’端有一個(gè)poly(A)的結(jié)構(gòu)，它編碼了所有由該細(xì)胞合成的多肽。實(shí)驗(yàn)器皿處理

mRNA的分子結(jié)構(gòu)容易受到RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定而且廣泛存在，因此，在提取過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格防止RNA酶的污染并設(shè)法抑制其活性，這是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。人的皮膚、手指、試劑、容器等均可被污染，因此全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時(shí)以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。RNA酶抑制劑A.焦碳酸二乙酯（DEPC）:

強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。但DEPC能與胺與巰基反應(yīng)，因而含Tris溶液和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制后、然后高壓滅菌。DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物！B.異硫氰酸胍（Guanidiniumisothiocyanate）:

為目前一種最有效的RNA酶抑制劑。它不但具有敗壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、核酸從核蛋白質(zhì)中解離，同時(shí)也使RNA酶失活。因此在制備RNA時(shí)，緩沖液中常含有異硫氰酸胍。C.其它：釩氧核苷酸復(fù)合物（Vanadyl-ribonuclosidecomplex）

RNA酶蛋白抑制制（RNasin）

SDS,尿素等二、試驗(yàn)方法

細(xì)胞內(nèi)總RNA制備方法很多，如異硫氰酸胍熱苯酚法、酚/SDS法等。許多公司有現(xiàn)成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。

酚/SDS法制備總RNA1基本原理：

第一步用酚和SDS破碎細(xì)胞和去除蛋白質(zhì)，第二步用LiCl選擇沉淀RNA以去除DNA和其它不純物。2、試劑勻漿緩沖液：0.18mol/LTris,0.09mol/LLiCl,4.5mmol/LEDTA,1%SDS,pH8.2）TLE：0.2mol/LTris,0.1mol/LLiCl,5mmol/LEDTA,pH8.2經(jīng)平衡的酚LiCl3mol/LNaAC無(wú)水乙醇3、實(shí)驗(yàn)步驟植物組織在液氮中磨成粉末，轉(zhuǎn)入含150ml勻漿緩沖液和50ml經(jīng)TLE平衡的酚的500ml燒杯中.勻漿2min，加50ml氯仿，溫和混勻后，50℃放置20min。4℃下10000rpm離心20分鐘.水相部分加50ml經(jīng)TLE平衡的酚,混勻后加50ml氯仿,混勻4℃下10000rpm離心15分鐘,水相部分用加經(jīng)TLE平衡的酚抽提直至無(wú)界面（一般3次）。水相部分氯仿抽提一次3、實(shí)驗(yàn)步驟(續(xù))水相部分加LiCl至2mol/L,4℃下沉淀過(guò)夜。4℃下10000rpm離心20分鐘，用2mol/LLiCl沖洗沉淀用5ml水溶解，加LiCl至2mol/L，4℃下沉淀2小時(shí)以上。4℃下10000rpm離心20分鐘，用2mol/LLiCl沖洗沉淀用2ml水溶解，加200ul3mol/LNaAC和5.5ml無(wú)水乙醇，-20℃下沉淀過(guò)夜4℃下10000rpm離心15分鐘，用1ml水溶解。異硫氰酸胍/酚法制備總RNA1.基本原理異硫氰酸胍(GIT)與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT與十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，同蛋白質(zhì)一起變性被離心下來(lái)，RNA則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄及構(gòu)建cDNA文庫(kù)。與氯化銫方法比較，雖然純度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但產(chǎn)量高完整性好，鹽易去除。

2.試劑異硫氰酸胍溶液：4mol/L異硫氰酸胍（GIT），25mmol/L檸檬酸鈉（pH7.0）,0.5%十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl）,0.1Mβ-巰基乙醇（用時(shí)再加0.36mL/50mL體系）.2mol/LNaAc（pH4.0）:用醋酸配，加少量水調(diào)pH。水飽和酚（pH3.5）氯仿/異戊醇（24：1）異丙醇(－20℃存放)DEPC-H2O（0.1%，V/V）

3、實(shí)驗(yàn)步驟取2g左右植物組織放入研缽中，反復(fù)加入液氮充分研磨至粉末狀。加4-5mL異硫氰酸胍溶液。轉(zhuǎn)移到小離心管中，每管0.5mL。置于冰上，順序加入：50μl2mol/LNaAc,混勻，0.5mL水飽和酚，170μl氯仿/異戊醇，混勻。置冰上15min。4℃,12000g離心20-30min。轉(zhuǎn)移上清到另一管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12000g離心20min回收RNA。3、實(shí)驗(yàn)步驟(續(xù))用70％乙醇洗一次，4℃，12000g離心5min。吸去乙醇，空氣中吹干RNA沉淀。用150μl異硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。加等體積異丙醇-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12000g離心20min回收RNA。用70％乙醇洗兩次后，溶于適量的DEPC-H2O中。部分分裝后進(jìn)行純度及完整性的檢測(cè)。其余加2.5倍體積乙醇沉淀于-80℃冰箱中存放。紫外分光光度分析純度和含量，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析完整性。Trizol法制備總RNA

1.試劑Trizol試劑（含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等）75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。

2、實(shí)驗(yàn)步驟將組織在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mLTrizol液，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。研磨液室溫放置5min，然后以每1mLTrizol液加入0.2mL的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。12000g離心10min，取上層水相于一新的離心管，按每mLTrizol液加0.5mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min。棄去上清液，按每mLTrizol液加入至少1mL的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5min。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10min，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃助溶10min。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇中于-70℃保存。附:總RNA純化試劑盒1)．樣品收集：稱取200mg新鮮植物葉片，水沖凈后用紙巾拭干，剪成碎片，立即浸入液氮，待冷凍完全后邊加液氮邊碾磨(防止樣品融化)，直至組織被碾磨成粉末狀。2）.樣品勻漿：在粉末狀植物組織中加入少量液氮，再加500ulR-A溶液，迅速碾磨至R-A溶液融化。將組織勻漿轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，如有較多組織勻漿殘留在研缽中，加少量R-A溶液，適當(dāng)勻漿后收集合并到1.5ml離心管.冰浴5min。4℃

，在12000rpm下離心5min.吸取400ul上清轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，測(cè)量勻漿體積(體積不足400ul時(shí)要加R-A溶液補(bǔ)足).實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）3)．加150ulR-E溶液，蓋緊樣品管，立即用力上下?lián)u晃混合均勻。4).加450u1的4℃預(yù)冷的R-C溶液，蓋緊樣品管，立即用力上下?lián)u晃混合均勻，冰浴5min；4℃下，12000rpm離心5min。注意:RNA和少量游離基因組DNA位于下相，蛋白質(zhì)與基因組DNA復(fù)合物形成相間沉淀，殘留的碎片沉淀于離心管底，脂質(zhì)位于藍(lán)色上相。5)．棄藍(lán)色上相，取800ul下相轉(zhuǎn)移至另一離心管中(注意:勿吸取界面和管底沉淀)。加560ul的R-D溶液，蓋緊樣品管，用力上下?lián)u晃混合均勻，冰浴5min。6).4℃下，12000rpm離心10min將RNA沉淀于管底；注意:游離的基因組DNA位于下相，殘留的蛋白質(zhì)變性析出形成相間沉淀，RNA沉淀于離心管底。7)．倒置離心管,丟棄液相及界面沉淀。簡(jiǎn)短離心，仔細(xì)吸走殘余液體。實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）

經(jīng)此步驟純化的總RNA純度已滿足諸如NorthernB1ot、RNA保護(hù)測(cè)定、體外翻譯等多種RNA分析，而無(wú)需作進(jìn)一步純化(接步驟10）。僅當(dāng)從富含RNA酶的細(xì)胞或組織中提取總RNA，或純化用于RT-PCR分析的RNA樣品，或懷疑RNA樣品中仍含有少量基因組DNA污染時(shí)，才進(jìn)行進(jìn)一步純化（接步驟8）。

8).加100ulbufferR-A溶液和100ulRNAse-freewater，充分溶解沉淀，混合均。9).加160ul異丙醇，混合均勻，4℃

，12000rpm離心2min。10).棄上清，加500ul4℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，倒置離心管去液相，短暫離心。仔細(xì)吸去殘液，空氣中將乙醇揮發(fā)除去。11).加100ulbufferTE充分溶解RNA沉淀,40C，12000rpm離心10min，；；12).將上清轉(zhuǎn)移到RNase-free的離心管中，置-80℃/-20℃保存待用。IV、mRNA提取一、概述制備mRNA原理

分離的總RNA可利用mRNA3’端含有poly(A)的特點(diǎn)，用oligo(dT)纖維素柱分離，當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經(jīng)過(guò)兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、試劑2X上樣緩沖液：40mmol/LTris.Cl,pH7.6;1.0Mol/LNaCl;2mmol/LEDTA,pH8.0;0.2%(m/V)十二烷基肌氨酸鈉或SDS.洗脫緩沖液:

10mmol/LTris.Cl,pH7.6;1mmol/LEDTA,pH8.0;0.05%SDS.三、操作步驟用1ml0.1mol/LNaOH懸浮500mgoligo(dT)纖維素.將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，以3個(gè)柱體積的滅菌水沖洗柱床。用1X上樣緩沖液沖洗柱床，知道流出液的pH值小于8.0。將提取的總RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2X上樣緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有RNA溶液進(jìn)入柱床后，加入1倍柱床體積的1X上樣緩沖液。測(cè)定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時(shí)，加入2~3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。測(cè)定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。三、操作步驟(續(xù))加入1/10體積的3mol/LNaAC(pH5.2)、2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃放置30分鐘。4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃中）。附:RapidmRNAPurificationKit(AmrescoInc.)用rapidmRNAbindingbuffer

懸浮活化的oligo(dT)cellulose取100ul(最多25ug,1/5樣品),在75℃下保溫2min.懸浮活化的oligo(dT)cellulose加100ul的樣品與20uloligo(dT)cellulose混合,冰上放置5min,每一分鐘混勻一次.離心10秒鐘(不要太長(zhǎng)!)去上清,加200ulRapidmRNAwashbuffer,混勻.在沉淀前,離心10秒鐘(不要太長(zhǎng)!)重復(fù)步驟E.去上清,加無(wú)RNase的水20ul.混勻后在75℃下保溫30秒鐘在沉淀前,離心10秒鐘(不要太長(zhǎng)!),轉(zhuǎn)上清液到一個(gè)新的離心管中.在沉淀中加20ul無(wú)RNase的水20ul.混勻后在75℃下保溫30秒鐘.在沉淀前,離心10秒鐘(不要太長(zhǎng)!)合并步驟H和步驟I得到的上清液.保存于-80℃冰箱.V、瓊脂糖凝膠電泳(I)、DNA凝膠電泳

一、概述

瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。

聚丙烯酰胺凝膠電泳主要分離小片段DNA(5-500bp),其分辨力極高，甚至可分開相差1bp的DNA片段。

瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)實(shí)驗(yàn)，一般用瓊脂糖水平凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。

瓊脂糖凝膠電泳儀聚丙烯酰胺凝膠電泳儀二、瓊脂糖凝膠電泳特性1．DNA分子大?。壕€性DNA分子在一定瓊脂糖濃度內(nèi)的遷移率與DNA分子量的對(duì)數(shù)成反比。2．瓊脂糖濃度：小于0.5kb的DNA片段所需的凝膠濃度為1.2-1.5%;分離大于10kb的DNA片段所需的凝膠濃度為0.3-0.7%;DNA片段大小在兩者之間的所需的凝膠濃度為0.8-1.0%。

分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖（%）分離DNA片段的有效范圍（kb)0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-3

在0.5XTBE緩沖液中，溴酚蘭相當(dāng)于300bpDNA,二甲苯氰FF相當(dāng)于4000bpDNA.二、瓊脂糖凝膠電泳特性3、DNA分子構(gòu)象：對(duì)相同分子量的質(zhì)粒DNA的三種構(gòu)象，超螺旋DNA移動(dòng)最快，而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。4．電源電壓：在低電壓時(shí)，線性DNA片段的移動(dòng)速率與所加電壓成正比，但電壓增高，不同分子量的DNA片段的移動(dòng)速率將以不同幅度增加；片段越大，升高的幅度也越大。因此電壓增高，瓊脂糖有效分離范圍將縮小。一般所加電壓不得超過(guò)5V/cm.5．染料：溴化乙啶（EB），它可嵌入堆積的堿基對(duì)之間，在紫外燈下發(fā)熒光，檢測(cè)DNA的下限可達(dá)1-10ng。注意：EB是強(qiáng)誘變劑！6、離子強(qiáng)度：在沒(méi)有離子強(qiáng)度時(shí)，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度下，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。常見的電泳緩沖液為0.5xTBE及0.5xTAE,尤其前者更為常見。三、試劑：1、5TBE緩沖液：Tris.54g,硼酸27.5g,加入20ml

的0.5mol/LEDTA(pH8.0),定溶至1000ml.2、6上樣緩沖液：0.25%溴酚蘭,40%(w/v)蔗糖水溶液。3、溴化乙啶（EB）溶液母液：將EB配制成10mg/L，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲(chǔ)于溫室即可。4、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：

DNA/EcoRI/HindIII:

DNA/EcoRI:21.2,7.4,5.8,5.6,4.9和2.5kb。

DNA/HindIII:23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0,0.56和0.12kb.四、實(shí)驗(yàn)步驟1、稀釋緩沖液的制備：用蒸餾水將5TBE緩沖液配制成0.5TBE稀釋緩沖液.2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml三角燒瓶中，進(jìn)入50ml的0.5TBE稀釋緩沖液，放入微波爐或電爐加熱至瓊脂糖全部熔化，取出混勻。3、膠板的制備：將二端封閉的電泳槽置于水平支持物上，插上樣品梳子。在冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入EB溶液至終濃度為0.5g/ml,即10mg/ml的母液加2.5ul，混勻。小心地倒入電泳槽中至一定高度。待膠液完全凝固后拔出梳子。然后向槽內(nèi)加0.5TBE稀釋緩沖液至液面剛好沒(méi)過(guò)膠板表面。四、實(shí)驗(yàn)步驟4、加樣：取2-5l樣品加1l的6上樣緩沖液，用移液槍混勻（在Parafilm膜上操作），小心加到樣品槽中。同時(shí)加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。5、電泳：從負(fù)極到正極，60-80V,電流40mA以上。當(dāng)溴酚蘭條帶移動(dòng)至距凝膠前沿約2cm

時(shí)，停止電泳。6、觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下，觀察DNA電泳帶并估計(jì)其分子量大小。同時(shí)可用加紅色濾光片和近攝鏡片的相機(jī)拍照（光圈

5.6下暴光10-120秒）。(II)、RNA凝膠電泳一、概述

RNA分子有很多二級(jí)結(jié)構(gòu)，需經(jīng)變性劑處理，可以破壞RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后，用瓊脂糖凝膠電泳可分級(jí)分離不同大小的mRNA分子。常用的RNA瓊脂糖凝膠電泳方法有三種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞瓊變性電泳。二、RNA甲醛變性電泳1、材料:5XMOPS電泳緩沖液：20.9gMOPS(0.1mol/L),pH7.0;8.3ml3mol/LNaAC(40mmol/L);10.0ml0.5mol/LEDTA(5mmol/L)pH8.0,用水定容至1L.以上藥品和水均需用DEPC處理。10x甲醛上樣緩沖液：1mmol/LEDTA,pH8.0;0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯藍(lán)，50%甘油).37%甲醛（pH大于4.0，12.3mol/L）;甲酰胺;10mg/ml溴化乙錠.以上藥品和水均需用DEPC處理。2、實(shí)驗(yàn)步驟膠的制備：1.5g瓊脂糖加115ml水，加熱融化。冷卻至60℃時(shí)加30ml的5XMOPS電泳緩沖液(終濃度為1X);加5ml甲醛（瓊脂糖終濃度為1%）。制膠。樣品制備：

RNA(最多30ug)5.5ul5XMOPS電泳緩沖液2.0ul

甲醛3.5ul

甲酰胺10ul

在65℃下處理15min,然后置冰上。加樣品前，先用5v/cm電壓電泳5分鐘。制備好的樣品短暫離心后加10X上樣緩沖液2ul，混勻。上樣。2、實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）在1XMOPS電泳緩沖液中電泳2-3小時(shí)。在電泳1-2小時(shí)后，可混合正負(fù)極緩沖液，再繼續(xù)電泳。染色：將電泳好的膠板轉(zhuǎn)移至含0.5ug/L溴化乙錠的0.1mmol/LNH4AC溶液中染色30-40min.（溴化乙錠也可以在電泳前加于樣品中）注意：RNA大于1kb,用1%瓊脂糖；RNA小于1kb,用1.4%瓊脂糖。28SRNA分子量為6333；18SRNA分子量為2366.三、RNA羥甲基汞變性電泳1、試劑：瓊脂糖

羥基甲汞1ｘ羥甲基汞瓊脂糖凝膠電泳緩沖液（50mmol/L硼酸，5mmol/LNa2B4O7·H2O，10mmol/LNaSO4，pH8.1）2ｘ羥甲基汞凝膠上樣緩沖液（1mol/L羥甲基汞25ul，4ｘ羥甲基汞凝膠電泳緩沖液500ul，甘油200ul，溴酚藍(lán)2ug，H2O275ul）10mg/ml溴化乙錠10mol/L乙酸銨２、實(shí)驗(yàn)步驟將1%（RNA>1kb）或1.4%(RNA<1kb)的瓊脂糖溶于1x羥甲基汞瓊脂糖凝膠電泳緩沖液中，待溶液冷卻至55℃時(shí)加入羥甲基汞至終濃度為5mmol/L.將