微生物與酶制劑工業(yè)

第十章微生物與酶制劑工業(yè)本章內(nèi)容第一節(jié)酶的生產(chǎn)方法第二節(jié)酶生物合成的基本理論第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶工藝（重點）第四節(jié)酶發(fā)酵動力學纖維素燃料乙醇“酶”好時代秸稈、樹葉，這些在很多人眼中稱之為‘廢料’的東西，其實都是寶貝。他們甚至可以成為車用燃料。而酶就像是打開生物世界的鑰匙，通過它的催化作用，能夠?qū)⒅参飶U料中的植物纖維轉(zhuǎn)化為糖，然后再經(jīng)發(fā)酵制成為乙醇。將這些乙醇添加到燃料中，能夠降低石油燃料的消耗，減少有害物質(zhì)的排放，我們把這種用非糧食作物生產(chǎn)出來的乙醇稱之為第二代燃料乙醇。第一節(jié)酶的生產(chǎn)方法一、酶的生產(chǎn)方法1、提取法

采用各種技術(shù)，直接從動、植物細胞或組織中將酶提取出來。提取法雖簡單易行，但受原材料來源的限制。2、化學合成法

是20世紀60年代中期出現(xiàn)的新技術(shù)。只能合成那些已知化學結(jié)構(gòu)的酶；成本比較高。目前仍然停留在實驗室內(nèi)合成的階段。3、微生物發(fā)酵法

是20世紀50年代以來生產(chǎn)酶的主要方法。利用微生物細胞的生命活動合成所需酶的方法稱為發(fā)酵法。酶的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)在酶生產(chǎn)的主要方法。1、微生物種類多，酶種豐富；2、微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶；3、微生物培養(yǎng)基來源廣泛，價格便宜；4、可采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程；5、可利用以基因工程為主的近代分子生物學技術(shù)選育菌種，增加酶的產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。二、應(yīng)用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點三、酶發(fā)酵生產(chǎn)的類型1、液體深層發(fā)酵：液體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌、冷卻后，接入產(chǎn)酶細胞，在一定條件下發(fā)酵。2、固體培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料，經(jīng)滅菌后，接入產(chǎn)酶菌株，在一定條件下發(fā)酵。3、固定化細胞發(fā)酵（70年代后期發(fā)展）將細胞固定在載體上后，進行發(fā)酵生產(chǎn)。第二節(jié)酶生物合成的基本理論一、酶生物合成的過程DNARNA蛋白質(zhì)（新生多肽鏈）成熟蛋白質(zhì)（酶）轉(zhuǎn)錄翻譯加工二、酶生物合成的調(diào)節(jié)

按酶生物合成的速度把細胞中合成的酶分為兩類：組成酶—恒定（速度、濃度）誘導酶—在外界環(huán)境因素誘導下合成速度急增，酶濃度成百上千倍增加酶合成的調(diào)控類型：誘導和阻遏1、酶合成的誘導作用

加進某些物質(zhì)，使酶的生物合成開始或加速的現(xiàn)象，稱為誘導作用。誘導物一般是酶催化作用的底物或其底物類似物。

例：乳糖誘導?-半乳糖苷酶的合成淀粉誘導α-淀粉酶的合成2、酶合成的阻遏（1）終產(chǎn)物阻遏

指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。（2）分解代謝物阻遏（營養(yǎng)源阻遏）是指某些物質(zhì)經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏其他酶合成的現(xiàn)象。

葡萄糖阻遏?-半乳糖苷酶的生物合成果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成色氨酸過量時會阻遏催化色氨酸合成的相關(guān)酶第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶工藝

發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑，就是給酶的生產(chǎn)菌種提供適當?shù)臓I養(yǎng)和生長環(huán)境，使生產(chǎn)菌大量增殖，同時合成所需要的酶，然后由發(fā)酵所得物料制成酶產(chǎn)品。

現(xiàn)代酶制劑的大規(guī)模生產(chǎn)以深層液體發(fā)酵法為主。無論哪種發(fā)酵法，都要做三方面的工作：（1）從原料準備培養(yǎng)基；（2）從原始菌種準備生產(chǎn)菌種；（3）發(fā)酵過程管理。一、發(fā)酵產(chǎn)酶的一般工藝流程酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程圖保藏菌種

試管斜面培養(yǎng)（活化）搖瓶擴大培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐分離純化酶培養(yǎng)基無菌空氣二、產(chǎn)酶菌種（一）產(chǎn)酶菌種的要求（1）產(chǎn)酶量高；（2）繁殖快，發(fā)酵周期短；（3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，不易退化，不易被感染；（4）能夠利用廉價原料，容易培養(yǎng)和管理；（5）最好是產(chǎn)生胞外酶的菌種,利于分離。（6）安全性可靠，非致病菌。（二）常用的產(chǎn)酶微生物大腸桿菌

谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；?、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、核酸外切酶等。1、細菌直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷?？莶菅挎邨U菌鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素?；?、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。2、放線菌黑曲霉：糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。米曲霉：氨基?；浮⒘姿岫ッ?、果膠酶等。紅曲霉：α-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶等。青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素?；浮⒗w維素酶等。木霉：纖維素酶。根霉：糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶，脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。毛霉：蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶3、霉菌啤酒酵母：丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等。假絲酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等。4、酵母

工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的微生物酶和它們的某些來源酶產(chǎn)酶微生物用途α-淀粉酶枯草芽胞桿菌地衣芽胞桿菌米曲霉淀粉液化，織物退漿，消化助劑，加酶洗滌劑葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米根霉制造葡萄糖，發(fā)酵、釀酒等工業(yè)的淀粉水解糖中性蛋白酶枯草芽胞桿菌，米曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，調(diào)味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清堿性蛋白酶地衣芽胞桿菌加酶洗滌劑植酸酶黑曲霉，畢赤酵母工程菌株飼料添加劑纖維素酶里氏木霉、黑曲霉水洗布生產(chǎn)，飼料添加劑，消化植物細胞壁半纖維素酶木霉、曲霉、根霉飼料添加劑，消化植物細胞壁，低聚木糖生產(chǎn)β-葡聚糖酶枯草芽胞桿菌，黑曲霉，Penicilliumemersonii啤酒釀造，飼料添加劑異淀粉酶產(chǎn)氣克雷伯氏菌，芽孢桿菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉乳品工業(yè)（處理牛乳和乳清）果膠酶曲霉、歐文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清，麻類纖維脫膠

工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的微生物酶和它們的某些來源轉(zhuǎn)化酶啤酒酵母、假絲酵母制造轉(zhuǎn)化糖凝乳酶米赫毛霉,大腸桿菌和真菌生產(chǎn)的重組酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗滌劑，油脂加工，生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，測定葡萄糖葡萄糖異構(gòu)酶凝結(jié)芽胞桿菌，白色鏈霉菌生產(chǎn)果葡糖漿青霉素?；讣毦?、霉菌、放線菌制造6-氨基青霉烷酸

工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的微生物酶和它們的某些來源（三）生產(chǎn)菌種的來源1、菌種保藏機構(gòu)向菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。

2、篩選由自然界采集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。（1）樣品的采集：主要是各種富含所需微生物的土壤、水、氣、枯枝爛葉、爛水果等；產(chǎn)酶菌種篩選步驟：（2）初篩：分離產(chǎn)目的酶的菌株；給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株分離出來。-淀粉酶的篩選（3）復篩：從所得菌株中篩選優(yōu)良株在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。誘變育種細胞雜交原生質(zhì)體融合育種基因工程育種（4）高產(chǎn)菌株的選育（四）產(chǎn)酶菌種的保存

保藏方法：斜面保藏法，沙土保藏法，真空冷凍干燥保藏法，低溫保藏法，石蠟油保藏法等（五）生產(chǎn)種子的制備生產(chǎn)種子：由原始保藏菌種，經(jīng)過活化，擴大培養(yǎng)，用于發(fā)酵罐接種的大量菌體。1、種子制備工藝過程（1）菌種活化

目的：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下培養(yǎng)，以恢復細胞的生命活動能力。方法：在試管斜面上培養(yǎng)1-3代。（2）擴大培養(yǎng)

目的：活化后的菌種經(jīng)過一級至數(shù)級的擴大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細胞。培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基。方法：分為實驗室培養(yǎng)和車間培養(yǎng)兩個階段。

（1）盡量減少傳代次數(shù)，以降低菌種衰退和污染的可能性；（2）培養(yǎng)基成分一般應(yīng)比發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豐富；（3）培養(yǎng)時間一般控制在微生物生長的對數(shù)生長期，及時接入下一級培養(yǎng)或發(fā)酵罐；（4）嚴格控制培養(yǎng)條件（pH、溫度、通氣量等），加強培養(yǎng)過程的實時監(jiān)測。擴大培養(yǎng)應(yīng)注意的事項：三、培養(yǎng)基

碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水等。

培養(yǎng)基是人工配制的供微生物生長、繁殖及合成酶的營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。1、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)2、營養(yǎng)物的濃度及配比合適3、物理、化學條件適宜4、經(jīng)濟節(jié)約微生物發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基舉例1、枯草桿菌BF7658α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8%

豆餅粉4%

磷酸氫二鈉0.8%

硫酸銨0.4%

氯化鈣0.2%

氯化銨0.15%

自然pH2、黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉10%

豆餅4%

麩皮1%pH4.4~5.0四、發(fā)酵條件的控制—影響產(chǎn)酶的幾個重要條件1、溫度的調(diào)節(jié)控制（2）有些微生物生長最適溫度與發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度有所不同。例：醬油曲霉生產(chǎn)蛋白酶，28℃時蛋白酶產(chǎn)量比在40℃條件下高2~4倍，在20℃條件下發(fā)酵，則蛋白酶產(chǎn)量更高，但細胞生長速率較慢。

為此，在有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，要在不同的發(fā)酵階段控制不同的溫度，即在微生物生長階段控制在生長的最適溫度范圍，而在產(chǎn)酶階段控制在產(chǎn)酶最適溫度范圍。（1）不同的微生物有不同的最適生長溫度。（3）溫度的控制方法

一般采用熱水升溫，冷水降溫。因此，在發(fā)酵罐中均設(shè)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管，夾套、噴淋管等。2、pH值的調(diào)節(jié)控制（1）不同微生物，其生長繁殖的最適pH值有所不同。（3）有些微生物可以同時產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。（2）微生物生長的最適pH值與產(chǎn)酶最適pH值往往不同。3、溶解氧的調(diào)節(jié)控制

溶解氧指溶解在培養(yǎng)基中的氧。微生物一般只能利用溶解氧。調(diào)節(jié)溶氧速率的方法（1）調(diào)節(jié)通氣量；（2）調(diào)節(jié)氧的分壓；（3）調(diào)節(jié)氣液接觸時間；（4）調(diào)節(jié)氣液接觸面積；（5）改變培養(yǎng)液性質(zhì)。5、濕度的調(diào)節(jié)控制

用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。4、泡沫形成：通氣攪拌、培養(yǎng)基中某些成分的變化、代謝產(chǎn)生的氣體。危害：阻礙CO2的排除，影響氧的溶解；引起染菌。消泡方法：機械消泡、化學消泡。五、提高酶產(chǎn)量的措施A添加誘導物對于誘導酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。1)通過條件控制提高酶產(chǎn)量B控制阻遏物的濃度1.產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用。控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應(yīng)當控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。C添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。D添加產(chǎn)酶促進劑

產(chǎn)酶促進劑是指可以促進產(chǎn)酶、但是作用機理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的產(chǎn)量。2)通過基因突變提高酶產(chǎn)量突變：是指生物的遺傳性狀發(fā)生變異，以致影響了生物的正常遺傳，可遺傳的基因突變發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因上，往往導致酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變：基因突變引起酶產(chǎn)量提高的方式：

1.誘導型組成型

2.阻遏型去阻遏型3）通過體內(nèi)基因重組提高酶的產(chǎn)量體內(nèi)基因重組包括少數(shù)或者個別基因的重組，主要通過接合、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化等方法進行；也包括整個染色體的重組，主要的途徑是原生質(zhì)體融合4）通過體外基因重組提高酶的產(chǎn)量第四節(jié)酶發(fā)酵動力學

研究發(fā)酵過程中細胞生長速度,產(chǎn)物生成速度及環(huán)境因素對這些速度的影響。酶發(fā)酵動力學研究意義:了解酶生物合成模式；發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制；提高酶產(chǎn)量。一、微生物生長曲線

（Microbialgrowthcurve）遲緩期對數(shù)生長期穩(wěn)定生長期衰亡期時間細胞數(shù)量的對數(shù)二、酶的生物合成模式（1）同步合成型（2）中期合成型（3）延續(xù)合成型（4）滯后合成型酶的生物合成模式可發(fā)分為4種類型：1、同步合成型酶的生物合成與細胞生長同步進行，又稱生長偶聯(lián)型。特點：（1）發(fā)酵開始，細胞生長，酶也開始合成，說明不受分解代謝物和終產(chǎn)物阻遏。（2）生長至穩(wěn)定期后，酶濃度不再增長。2、中期合成型酶的合成在細胞生長一段時間以后才開始，而進入穩(wěn)定生長期后，酶的合成也終止。特點：（1）該類酶的合成受分解代謝物阻遏。（2）該酶對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定。3、延續(xù)合成型酶的合成伴隨著細胞生長而開始，但在細胞進入穩(wěn)定期后，酶還可以延續(xù)合成較長的一段時間。特點：（1）該類酶不受分解代謝產(chǎn)物阻遏和終產(chǎn)物阻遏。（2）該酶對應(yīng)的mRNA是相當穩(wěn)定的。4、滯后合成型只有當細胞生長進入穩(wěn)定期后，酶才開始合成。又稱非生長偶聯(lián)型。特點：（1）該類酶受分解代謝物阻遏作用的影響，阻遏解除后，酶才大量合成。（2）該酶對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。

選擇：在酶的工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高酶產(chǎn)率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式是延續(xù)合成型。

改造非理想模式：在細胞選育上下功夫，并適當調(diào)節(jié)工藝條件：（1）同步合成型：適當降低發(fā)酵溫度，盡量提高酶所對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性。（2）中期合成型：要從解除阻遏和提高mRNA的穩(wěn)定性兩方面進行努力。（3）滯后合成型在發(fā)酵過程中要盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。選擇與改造三、細胞生長動力學細胞生長動力學主要研究細胞生長速度及外界因素對其影響的規(guī)律。在發(fā)酵過程優(yōu)化及發(fā)酵過程控制等方面具有重要的應(yīng)用價值。Monod認為，在培養(yǎng)過程中，細胞生長速率與細胞濃度成正比：Rx=dXdt=μXRx—生長速率，單位時間內(nèi)細胞濃度的增加值，mg/mL·min，g/L·hX—細胞濃度，mg/mL，g/Lμ—比生長速率，生長速率與細胞濃度之比（單位細胞在單位時間內(nèi)濃度增加值），h-1若培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)時，μ為此限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)：微生物生長動力學模型（后人稱Monod方程）：μ

=μmax·SKs+SS—限制性基質(zhì)濃度，mol/L，g/Lμmax—最大比生長速率，限制性基質(zhì)濃度過量時的比生長速率Ks—Monod常數(shù)，μ=1/2μmax時，Ks=S限制性基質(zhì)：指對發(fā)酵起決定性作用的基質(zhì)成分，通常是碳源物質(zhì)。只考慮限制性基質(zhì)，可簡化數(shù)學分析。Monod方程是基本的細胞生長動力學方程;從不同情況出發(fā)對其進行修飾.

連續(xù)全混流反應(yīng)器發(fā)酵過程中,穩(wěn)態(tài)時游離細胞連續(xù)發(fā)酵的生長動力學方程:D=0時,分批發(fā)酵;D<μ

時,細胞濃度增加;D=μ

時,細胞濃度恒定;D