第二周PCR檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用

PCR檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)什么是PCR技術(shù)？PCR(polymerasechainreaction),即聚合酶鏈反應(yīng)。它是體外模擬DNA復(fù)制的過(guò)程，以單鏈DNA為模板，以人工設(shè)計(jì)的寡核苷酸為引物，利用穩(wěn)定的聚合酶，摻入單核苷酸來(lái)特異地?cái)U(kuò)增DNA片段的技術(shù)。什么是PCR技術(shù)？反應(yīng)特點(diǎn)：特異性強(qiáng)；靈敏度高；簡(jiǎn)便、快速；對(duì)標(biāo)本的純度要求低DNA復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)述請(qǐng)課前準(zhǔn)備的同學(xué)進(jìn)行講解。PCR反應(yīng)原理PCR檢測(cè)分三個(gè)步驟：1是PCR擴(kuò)增模板的制備，也就是病原微生物基因

組提取2是PCR擴(kuò)增，即目的基因特異擴(kuò)增過(guò)程（最重要的步驟）3是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測(cè)基因片

段重點(diǎn)步驟：PCR擴(kuò)增期（觀看動(dòng)畫(huà)）PCR擴(kuò)增期包括變性－退火－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟：模板DNA的變性：加熱至94-96℃，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA離解成為單鏈；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：溫度降至50-65℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

72℃

重復(fù)變性－退火－延伸三個(gè)過(guò)程，目的基因被擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。每個(gè)循環(huán)需2-4min，整個(gè)PCR反應(yīng)需要2-3h。問(wèn)題思考：聚合酶在催化引物延伸的反應(yīng)中在下一循環(huán)的加熱變性中會(huì)失活，導(dǎo)致循環(huán)都要加一次酶？怎么解決？

1988年初，Keohanog通過(guò)對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。而后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高，叫做TaqDNA聚合酶。PCR的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)觀看操作視頻檢測(cè)過(guò)程：設(shè)計(jì)引物---擴(kuò)增---檢測(cè)PCR的檢測(cè)過(guò)程PCR擴(kuò)增體系主要包括：引物 PCR反應(yīng)介導(dǎo)物DNA模板

被擴(kuò)增目的物耐熱DNA聚合酶 PCR反應(yīng)催化劑dNTPs 反應(yīng)底物緩沖液

提供反應(yīng)環(huán)境鎂離子

耐熱DNA聚合酶活性依賴(lài)離子PCR產(chǎn)物的檢測(cè)1、凝膠電泳：EB（溴化乙錠）可鑲嵌在DNA片段中，并在一定波長(zhǎng)的紫外線下發(fā)射出橘紅色的可見(jiàn)光。在凝膠介質(zhì)中不同大小的PCR片段在一定電壓下的遷移率不同，從而在凝膠中呈現(xiàn)出不同的亮線。缺點(diǎn)：只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無(wú)法對(duì)起始模版準(zhǔn)確定量；必須在擴(kuò)增反映結(jié)束后借助電泳方法分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)事；無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)；EB有毒Marker是人為的把一系列已知大小的DNA（或已知質(zhì)量的蛋白，當(dāng)然PCR中用的是DNAmarker不是蛋白marker）混合在一起，在電泳的時(shí)候?qū)φ沼?。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)2、熒光PCR：反應(yīng)體系中在PCR過(guò)程中利用熒光染料在光刺激的情況下釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需PCR后電泳處理，儀器在線實(shí)時(shí)檢測(cè)，避免人為判斷，利用自動(dòng)化和聯(lián)網(wǎng)管理。觀看熒光PCR檢測(cè)視頻PCR分類(lèi)1、多重PCR技術(shù)（P170）常規(guī)一對(duì)引物擴(kuò)增，只產(chǎn)生一個(gè)特異的DNA片段。若有十分龐大的基因序列需要檢測(cè)，超過(guò)了PCR擴(kuò)增DNA片段的長(zhǎng)度，則采用常規(guī)PCR就需要分段進(jìn)行多次擴(kuò)增，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。常用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)。PCR分類(lèi)2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（P171）視頻在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。PCR檢測(cè)所需要的儀器設(shè)備（1）、PCR實(shí)驗(yàn)室

PCR只需幾個(gè)DNA分子作模板就可大量擴(kuò)增，應(yīng)注意防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽(yáng)性原因之一。實(shí)驗(yàn)室布局應(yīng)重點(diǎn)考慮避免這種污染。因此用于PCR檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室要進(jìn)行功能區(qū)域劃分，從對(duì)環(huán)境要求的嚴(yán)格程度和功能上可將PCR整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程劃分為四個(gè)區(qū)域：1.配液區(qū)（準(zhǔn)備區(qū)）2.模板提取區(qū)3.PCR擴(kuò)增區(qū)4.電泳區(qū)（二）實(shí)驗(yàn)器材必須使用PCR專(zhuān)用吸頭試劑盒的運(yùn)輸和貯存PCR試劑盒在適當(dāng)?shù)馁A存溫度下的有效期一般為6個(gè)月核酸擴(kuò)增部分的試劑一般要貯存于-20℃產(chǎn)物檢測(cè)部分試劑則貯存于2～8℃。電泳槽、電泳儀的圖片凝膠成像系統(tǒng)的圖片觀看視頻，回憶PCR實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)步驟1是PCR擴(kuò)增模板的制備，也就是病原微生物基因組提取2是PCR擴(kuò)增，即目的基因特異擴(kuò)增過(guò)程3是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測(cè)基因片段PCR檢驗(yàn)技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用一、在食品致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用（P173）檢測(cè)沙門(mén)氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等。二、在食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)用（補(bǔ)充）抗蟲(chóng)害、抗病毒、抗雜草的轉(zhuǎn)基因玉米、黃豆、油菜、土豆、西葫蘆等。李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)（P173）對(duì)牛奶等食品均有不同程度的污染,是食品中的主要病原菌。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在周期長(zhǎng)、操作繁瑣等不足之處。在食品致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用（P173）PCR法：1）提取總DNA；2）根據(jù)LM的保守序列設(shè)計(jì)引物特異地PCR擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)其它菌不產(chǎn)生反應(yīng)，顯示了較強(qiáng)的特異性；

檢測(cè)的敏感性非常高；檢測(cè)只需要5～6h,較之傳統(tǒng)方法快得多。通過(guò)對(duì)TaqDNA聚合酶和引物濃度等條件的優(yōu)化，建立簡(jiǎn)便實(shí)用的快速檢測(cè)牛奶中LM菌的試劑盒，具有良好的應(yīng)用前景。在食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因食品（geneticallymodifiedfoods,GMF)是由細(xì)胞DNA中經(jīng)非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，并獲得某種良好性狀的動(dòng)物