第三章-細(xì)胞生物學(xué)的研究方法

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化第五節(jié)模式生物與功能基因組的研究第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡二、電子顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)☆基本構(gòu)造：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機(jī)械和支架系統(tǒng)普通光學(xué)顯微鏡成像原理物鏡得到物體放大的實(shí)像;目鏡把物鏡成的像進(jìn)一步放大。顯微鏡和顯微技術(shù)幾個(gè)基本概念：放大分辨率反差能辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力與顯微鏡的自身特點(diǎn)有關(guān)，但也取決于進(jìn)行顯微觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的正確使用及良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)。被觀察物區(qū)別于背景的程度被觀察物越小，放大倍數(shù)應(yīng)越大，否則難以看清！決定光學(xué)顯微鏡的分辨率的要素

D＝0.61λ∕［N·sin(α/2)］D:分辨率λ：入射光的波長(zhǎng)N：介質(zhì)的折射率（1或1.5）α：物鏡的鏡口角（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡分辨率指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)之間的距離取決于光源波長(zhǎng)λ

，物鏡鏡口角a和介質(zhì)折射率ND=0.61λ/N×sin(a/2)空氣（N=1.0）、水（N=1.33）、香柏油（N=1.52）顯微鏡的種類及原理普通光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？為什么？如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？目鏡：10~15×；物鏡：100×；總放大倍數(shù)1000~1500×；使用油鏡，即在100×物鏡和載玻片之間滴加香柏油；普通光學(xué)顯微鏡分辨率與所用波長(zhǎng)成反比！用浸沒(méi)油取代空氣的作用?介質(zhì)折射率提高分辨率得到提高改變光折射角度增加照明亮度很多原來(lái)由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進(jìn)入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。浸沒(méi)油與玻璃的折射率相近Makingtissuesections.Howanembeddedtissueissectionedwithamicrotomeinpreparationforexaminationinthelightmicroscope.普通光鏡的觀察取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復(fù)水－染色－脫水－透明－封片－觀察步驟：觀察結(jié)果（二）熒光顯微鏡技術(shù)是光鏡水平對(duì)特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具。主要是用于檢測(cè)細(xì)胞上的特異熒光材料；與普通光學(xué)顯微鏡不同的是增加了兩套濾光片。

第一套稱為激發(fā)光濾片，裝在光源和樣品之間，只有那些能激發(fā)熒光材料發(fā)光的特定波長(zhǎng)的光才能通過(guò)。第二套稱為阻斷濾片，裝在物鏡和目鏡之間，只讓燃料所發(fā)出的熒光通過(guò)。在黑暗背景的襯托下，發(fā)出熒光的樣品很容易被觀察。Theopticalsystemofamodernfluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroic(beam-splitting)mirror(2).Inthisexamplethefiltersetfordetectionofthefluorescentmoleculefluoresceinisshown.熒光顯微鏡的光路圖Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.熒光染料分子熒光顯微鏡的應(yīng)用B：不同熒光素所需激發(fā)波長(zhǎng)與所產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)比較C：細(xì)胞有絲分裂中期的觀察。熒光顯微鏡觀察真菌的細(xì)胞核MDFA/4d/DAPIstain(400×)WT?cdc15CM由于熒光顯微鏡的暗視野為熒光信號(hào)提供了強(qiáng)反差背景，非常微弱的熒光信號(hào)亦可得以分辨。（三）激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡特點(diǎn)：排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4-1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu),主要用來(lái)研究細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）：

用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。激光掃描共焦顯微鏡的原理圖原理：激光束經(jīng)雙色鏡反射后，通過(guò)物鏡聚集到樣品某一焦點(diǎn)；從焦點(diǎn)發(fā)射的熒光經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢測(cè)出；其他部位發(fā)射的熒光不聚焦成像，不能檢測(cè)到。熒光顯微鏡（A）和激光掃描共焦顯微鏡（B）所觀察圖像的比較小鼠腎小球的厚切片F(xiàn)igure3-14.Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

一種將相位差轉(zhuǎn)變成振幅差（明暗差）的顯微鏡，可觀察不染色的活細(xì)胞。利用樣品的不同位點(diǎn)的密度差，形成肉眼可見的明暗區(qū)別。微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

一種將樣品厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別相差顯微鏡。錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）（四）其它光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡觀察真菌菌絲2dWT?cdc15CM3d兩種不同類型的光學(xué)顯微鏡所拍攝的圖像比較體外培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞的圖像A:普通顯微鏡所拍B：相差顯微鏡所拍二、電子顯微鏡（一）、電子顯微鏡的基本知識(shí)

1.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

2.電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)

3.電子顯微鏡的基本構(gòu)造（二）、主要電鏡制樣技術(shù)

1.超薄切片技術(shù)

2.負(fù)染色技術(shù)

3.冷凍蝕刻技術(shù)

4.電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)

5.掃描電鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（A）和成像原理（B）電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的區(qū)別

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差主要區(qū)別（1）光源不同光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空系統(tǒng)（4）顯示記錄系統(tǒng)超薄切片技術(shù)固定、脫水、包埋、切片、染色?；疽螅杭?xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好，不產(chǎn)生明顯的物質(zhì)凝聚、丟失或添加人工效應(yīng)等；切片厚度在500埃左右，最大不超過(guò)1000埃（1mm厚的樣品切成20000片；一個(gè)一般大小的細(xì)胞要切成300片）切片應(yīng)耐受電子束的轟擊，包埋介質(zhì)不發(fā)生變形；切片應(yīng)具有良好的反差；切片需均勻，沒(méi)有皺褶、刀痕及染色劑沉淀等缺陷。SpecimenPreparationforElectronMicroscopyThinSectioningforTEMThewaxsections:3-10um;ThePlasticultrathin-sectionsforTEM:40-50nmSectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:<100nm

電鏡超薄切片樣本制備示意圖Figure3-20.Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.超薄切片技術(shù)顯示的動(dòng)物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)家蠶細(xì)小病毒負(fù)染色電鏡照片（病毒直徑20nm）II.Scanningelectronmicroscope(SEM)

ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15－150,000X.Resolution:5nmFigure3-23.Scanningelectronmicroscopy.Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).

Figure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.掃描電鏡原理示意圖（A），掃描電鏡下可清晰地顯示原生動(dòng)物四膜蟲表面的纖毛和口器（B）三、隧道掃描顯微鏡原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來(lái)，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點(diǎn)：（1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無(wú)需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量； （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。幾種顯微鏡可觀察的樣品大?。^之間的范圍）及其分辨能力（右側(cè)箭頭所指位置）分辨率：能區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離眼睛、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的分辨率分別為：0.2mm、0.2μm和0.2nm。第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分用差速離心法分離細(xì)胞勻漿中的各種細(xì)胞組分用密度梯度離心分離細(xì)胞組分示意圖用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法為了測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)等細(xì)胞組分，通常利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合（反應(yīng)）的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對(duì)含量。A:直接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：利用偶聯(lián)熒光分子的抗體與細(xì)胞或細(xì)胞切片進(jìn)行孵育，使抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下對(duì)抗原進(jìn)行定位的技術(shù)。B:間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：即不帶熒光標(biāo)記的第一抗體與相應(yīng)抗原孵育形成復(fù)合物后，再用熒光標(biāo)記的第二抗體識(shí)別第一抗體，從而顯示抗原所在位置。

三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫膠體金電鏡原位雜交技術(shù)的基本原理與應(yīng)用（膀胱上皮細(xì)胞膜蛋白的分布：箭頭所指）四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交（insituhybridization）：通過(guò)單鏈RNA或DNA探針對(duì)細(xì)胞或組織中的基因或mRNA進(jìn)行定位的技術(shù)。

用原位雜交技術(shù)顯示Z13基因在受精后1d的斑馬魚胚胎的體節(jié)、眼和松果體中的表達(dá)（箭頭所指）五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)：一種用于核酸、蛋白質(zhì)、染色體和細(xì)胞等的定量、分離和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀的工作原理第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)：用直接從生物體獲得的細(xì)胞所進(jìn)行的培養(yǎng)的過(guò)程。

傳代培養(yǎng)：對(duì)原代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分割，重新接種進(jìn)行再培養(yǎng)的過(guò)程。細(xì)胞系：來(lái)源于動(dòng)物或植物細(xì)胞，能夠在體外培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)增殖的細(xì)胞群體。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)A：正在生長(zhǎng)分裂的HeLe（宮頸瘤）細(xì)胞B:長(zhǎng)滿單層的CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢）原代細(xì)胞植物細(xì)胞培養(yǎng)單倍體細(xì)胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)

二、細(xì)胞工程細(xì)胞融合：兩個(gè)細(xì)胞通過(guò)質(zhì)膜的接觸并相互融合形成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。融合后的細(xì)胞只有一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞質(zhì)膜。單克隆抗體：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞克隆所合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體。雜交瘤技術(shù)：由一個(gè)正常的產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與一個(gè)惡性骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜種細(xì)胞系。具有無(wú)限增殖和產(chǎn)生單克隆抗體的特性。細(xì)胞拆合：即先把細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離開來(lái)，然后把不同來(lái)源的核體和胞質(zhì)體相互融合，形成核-質(zhì)雜交細(xì)胞。單克隆抗體制備過(guò)程體外培養(yǎng)應(yīng)用顯微注射技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞核移植細(xì)胞拆合第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)二、單分子技術(shù)與細(xì)胞生命活動(dòng)的研究三、酵母雙雜交技術(shù)四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)五、放射