分子生物學 轉錄及其調控

第三章轉錄及其調控遺傳信息由DNA轉換到RNA的過程。蛋白質生物合成的第一步，合成mRNA以及非編碼RNA（tRNA、rRNA等）轉錄(transcription)多核苷酸鏈的合成都是以5’→3’的方向.轉錄特點：（1）對于一個基因組來說，轉錄只發(fā)生在一部分基

因，而且每個基因的轉錄都受到相對獨立的控制（2）轉錄是不對稱的(3）轉錄時不需要引物，而且RNA鏈的合成是連續(xù)的。一、所需因素第一節(jié)原核生物轉錄1.轉錄模板DNA模板：指導RNA合成的一股DNA鏈稱為模板鏈（templatestrand），與之相對的另一股鏈為編碼鏈（codingstrand）.2.RNA聚合酶（RNApolymerase）RNA聚合酶有以下特點：（1）無需引物的存在能獨自起始新RNA鏈

的合成（2）沒有校對能力；（3）催化的底物是核糖核苷三磷酸。大腸桿菌只有一種RNA聚合酶，負責所有rRNA、mRNA和tRNA的合成。該酶具有全能性，基本上不需要其他蛋白因子的參與，即可獨立的進行。功能：（1）識別DNA雙鏈上的啟動子（2）通過閱讀啟動子序列，確定轉錄方向和模板鏈（3）解開DNA部分雙螺旋，產生約17bp的單鏈DNA模板（4）選擇正確的核糖核苷三磷酸（rNTP）底物并催化形成磷

酸二酯鍵，使合成的RNA鏈不斷延伸。（5）最后當它達到終止子時，識別轉錄終止信號，停止轉錄。大腸桿菌RNA聚合酶結構：5種亞基組成：兩個α亞基、1個β亞基、1個β′亞基

和1個δ亞基。轉錄的起始階段：

δ亞基和核心酶（α2ββ′）組裝成全酶共同起作用。δ亞基無催化活性，但它能識別啟動子并將封閉的啟動子復合物轉換成開放狀態(tài)。一旦轉錄起始，δ亞基就從全酶上脫離下來。核心酶與模板DNA結合的親和力弱，特異性差，這有利于它在模板鏈上移動，促進轉錄延伸。σ因子負責識別啟動子的保守序列，不同的σ因子識別不同的啟動子。許多細菌能產生多種可取代的σ因子，以識別不同的啟動子。σ因子大腸桿菌只有一種RNA聚合酶，負責所有rRNA、mRNA和tRNA的合成。并且該酶具有全能性，基本上不需要其他蛋白因子的參與，即可獨立的進行轉錄的起始、延伸和終止。一些抗生素，如利鏈菌素，可以抑制原核生物的RNA聚合酶，使得原核生物的基因無法轉錄成mRNA，從而達到殺死細菌等原核生物的效果。1.轉錄起始1）全酶與模板的DNA接觸，生成非專一的，不穩(wěn)定的復合物在模板上移動。2.起始識別：全酶與-35序列結合，產生封閉的酶-啟動子二元復合物。3.全酶緊密地結合在-10序列處，DNA模板局部變性，形成開放的啟動子二元復合物。（RNA聚合酶與啟動子結合后造成約10bp的DNA解鏈）4.合成短多聚核苷酸（<10nt),三元復合物形成。（酶-啟動子-NTP）5.σ因子從全酶中解離下來，聚合酶轉變?yōu)檠娱L構型。酶分子與啟動子特異性結合性的結合力下降，延伸階段開始。二、原核生物轉錄的起始延伸轉錄延長三、轉錄的終止終止序列和釋放因子終止子：提供終止信號的序列。

分為兩類：

不依賴ρ因子而實現(xiàn)終止作用。

依賴ρ因子才能實現(xiàn)終止作用。ρ因子---蛋白質輔助因子不依賴ρ因子終止作用：

在轉錄終止點之前有一段回文序列，回文序列的兩個重復部分之間由幾個堿基對的不重復階段隔開依賴于ρ因子終止作用ρ因子是55KDa蛋白，其活性形式為六聚體1）促進轉錄終止活性2）NTPase活性，需要RNA鏈。轉錄單元是一段被轉錄成單鏈RNA的DNA序列，它起始于啟動子，結束于終止子。一個轉錄單元可能包含不止一個基因。一、所需因素轉錄起始需要啟動子，RNA聚合酶和轉錄因子參與。1.轉錄起始前的上游區(qū)具有啟動子核心序列。不同物種、不同細胞或不同的基因轉錄起始點上游有不同的DNA序列，統(tǒng)稱為順式作用元件（cis-actingelement).順式作用元件包括啟動子、啟動子上游元件等近端調控元件和增強子等遠隔序列。第二節(jié)真核生物轉錄起始點上游多數(shù)有共同的TATA序列，稱為TATA盒。（啟動子核心序列）啟動子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在轉錄起始點約-40~-100nt的位置，常見的是GC盒和CAAT盒。增強子-能夠結合特異基因調節(jié)蛋白，促進鄰近或遠隔特定基因表達的DNA序列。結構基因順式作用元件2.真核生物有三種DNA依賴RNA聚合酶

真核生物轉錄起始十分復雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助。能直接、間接辨認和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋白質，已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種。統(tǒng)稱為反式作用因子（trans-actingfactors)反式作用因子中，直接或間接結合RNA聚合酶的稱為轉錄因子（transcriptionalfactors,TF).3.轉錄因子真核生物RNA聚合酶不與DNA分子直接結合，而需依靠眾多的轉錄因子，形成轉錄起始復合物（pre-initiationcomplex,PIC).第一類為普遍轉錄因子它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉錄起始復合物，轉錄才能在正確的位置開始。TFⅡD,TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它們在轉錄起始復合物組裝的不同階段起作用。第二類轉錄因子為組織細胞特異性轉錄因子，這此TF是在特異的組織細胞或是受到一些類固醇激素，生長因子或其它刺激后，開始表達某些特異蛋白質分子時，才需要的一類轉錄因子。根據(jù)轉錄因子的作用特點可分為二類轉錄起始內部啟動子的起始各階段，涉及三個起始因子1.原核生物聚合酶僅有一種，有多個亞基。真核生物有三種DNA依賴性RNA聚合酶，有兩個不同的大亞基和十幾個不同的小亞基。2.原核生物RNA聚合酶可直接結合DNA模板，而真核生物RNA聚合酶與輔助因子結合后才結合模板。3.轉錄起始：原核生物RNA聚合酶要結合到DNA模板上，DNA雙鏈局部打開，使其中一條鏈作為轉錄模板。真核生物轉錄起始前的上游區(qū)段具有啟動子核心序列，RNA聚合酶不能直接結合模板，RNA聚合酶II啟動轉錄時需要轉錄因子才能形成轉錄復合物。原核生物與真核生物轉錄起始調控差異當合成一段含有60-70個核苷酸的RNA時，TFIIＥ和TFIIH釋放，RNA聚合酶II進入轉錄延長期。終止無特定的終止子序列可在無輔助因子參與下終止一串A殘基終止轉錄mRNA:識別末端加尾信號RNA轉錄后加工和修飾絕大多數(shù)原核生物轉錄和翻譯是同時進行的，隨著mRNA開始在DNA上合成，核蛋白體即附著在mRNA上并以其為模板進行蛋白質的合成，因此原核細胞的mRNA并無特殊的轉錄后加工過程，相反，真核生物轉錄和翻譯在時間和空間上是分天的，剛轉錄出來的mRNA是分子很大的前體，即核內不均一RNA。hnRNA分子中大約只有10%的部分轉變成成熟的mRNA，其余部分將在轉錄后的加工過程中被降解掉。三、真核生物RNA成熟真核生物轉錄生成的mRNA為單順反子，即一個mRNA分子只為一種蛋白質分子編碼。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對5’端和3’端的修飾以及對中間部分進行剪接。（一）真核生物mRNA加工修飾1．在5’端加帽成熟的真核生物mRNA，其結構的5’端都有一個m7G-PPNmN結構，該結構被稱為甲基鳥苷的帽子。2．在3’端加尾

大多數(shù)的真核mRNA都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大約為200bp。

多聚（A)屠巴不是由DNA編碼的，而是轉錄后在核內加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識別，mRNA的游離3’-OH端，并加上約200個A殘基。在大多數(shù)真核基因的3’一端有一個AATAA序列，這個序列是mRNA3’-端加polyA尾的信號?？亢怂崦冈诖诵盘栂掠?0-15堿基外切斷磷酸二酯鍵，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200個A堿基。3.mRNA前體（hnRNA）的剪接（splicing)真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個蛋白質分子的核苷酸序列被多個插入片斷所隔開，一個真核生物結構基因中內含子的數(shù)量，往往與這個基因的大小有關，例如胰島素是一個很小的蛋白質，它結構基因只有兩個內含子，而有些很大的蛋白質，它的結構基因中可以有幾十個內含子。經過復雜的過程后，切去內含子，將有編碼意義的核苷酸片段（Extron，外顯子）連接起來

內含子與外顯子接界處的高度守恒序列,為準確和有效的剪接過程所必需。內含子5′末端與外顯子接界序列為CAAG/GTAGAGT,而3′末端與外顯子接界序列為(TC)_πN(CT)AG/G。內含子序列內的各種缺失,并不影響剪接的準確和效率,這似乎說明,內含子的其他部份并不為剪接所要求。mRNA的剪接是基于對間接位點識別的基礎上，由被稱為剪接體的核酸蛋白復合物完成剪接體包含5種SnRNP和超過200種蛋白質因子。hnRNA的剪接過程不論拼接過程如何，拼接必須極為精確，否則會導致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質可能喪失其正常的功能。我國南方廣大地區(qū)是β-地中海貧血的高發(fā)區(qū)，這是由于β-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。實驗表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的點突變改變了正常拼接部位的堿基順序，結果造成錯誤部位的拼接。加工成熟的mRNA雖能翻譯，但產物不是正常的β-珠蛋白，結果引起血紅蛋白級結構和功能的改變。（二）rRNA轉錄后加工原核生物rRNA轉錄后加工，包括以下幾方面：①rRNA前體被大腸桿菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定鏈長的rRNA分子；②rRNA在修飾酶催化下進行堿基修飾；③rRNA與蛋白質結合形成核糖體的大、小亞基真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動物的初級轉錄產物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s，真核生物5sRNA前體獨立于其他三種rRNA的基因轉錄。真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA，需要經過拼接反應。例如，四膜蟲的rRNA前體的拼接是一種無酶催化的自動拼接過程。四膜蟲基因組內，26srRNA編碼的區(qū)域內有413bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從rRNA前體中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性辦法，都不能破壞拼接活性，但反應中Mg2+和鳥嘌呤核苷酸是必在的。這種有酶催化活性的RNA分子命名為Ribozyme。用32P-GTP進行追蹤實驗表明，起始過程是GTP在插入順序5’端發(fā)生親核反應，同時GMP與5’端切點的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開。第二步是5’切點的外元3’-OH與3’切點的外元5’-P共價連接，獲得成熟的rRNA，被切除部分最后環(huán)化，形成一個環(huán)狀結構，同時從5’端去掉一個15核苷酸碎片。剩余部分連接成399核苷酸的環(huán)狀產物，再經過幾步，最后切下一個19個核苷酸的線性內含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由內含子本身的催化性質決定的。不只是溝通核酸和蛋白質的橋梁，可能是功能比DNA更廣泛的信息分子。（三）tRNA轉錄后的加工修飾原核生物和真核生物剛轉錄生成的tRNA前體一般無生物活性，需要進行①剪切和拼接②堿基修飾③3’-OH連接-ACC結構①tRNA前體在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大腸桿菌RNaseP可特異剪切tRNA前體的5’旁順序，因此，該酶被稱為tRNA5’成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前體的剪切尚需要一個3’-核酸內切酶，這可將tRNA前體3’端的一段核苷酸序列切下來。RNaseD是tRNA3’端成熟酶。近年來的研究表明大腸桿菌RNaseP是一種非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白質組成，最近發(fā)現(xiàn)RNAaseP分子中的RNA部分在某些條件下，可以單獨地催化tRNA前體的加工成熟，這個發(fā)現(xiàn)和四膜蟲tRNA能自我拼接被認為是近十年來生化領域內最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)之一。說明RNA分子確具有酶的催化活性。經過剪切后的tRNA分子還要在拼接酶作用下，將成熟tRNA分子所需的片段拼起來。在核苷酸轉移酶作用下，3’--末端除去個別堿基后，換上tRNA分子統(tǒng)一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂結構。tRNA3’-末端-CCA序列的添加成熟的tRNA分子中有許多的稀有堿基，因此tRNA在甲基轉移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。有些尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶。尿嘧啶核苷轉變不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脫氨基為成為次黃嘌呤核苷酸（Ⅰ）tRNA的堿基修飾RNA編輯（RNAediting)RNA編輯是指在mRNA水平上改變遺傳信息的過程.具體說來，指基因轉錄產生的mRNA分子中，由于核苷酸的缺失，插入或置換，基因轉錄物的序列不與基因編碼序列互補，使翻譯生成的蛋白質的氨基酸組成，不同于基因序列中的編碼信息現(xiàn)象。RNA編輯是通過比較成熟的mRNA與相應基因的編碼信息時發(fā)現(xiàn)的，成熟的mRNA序列中有幾種意想不到的變化，包括尿嘧啶（U）突變?yōu)榘奏ぃ–）、胞嘧啶突變?yōu)槟蜞奏?、尿嘧啶的插入或缺失、多個鳥嘌呤（G）或胞嘧啶的插入等。最典型的例子是錐蟲(Trypanosome)動質體(kinetoplastid)的線粒體基因mRNA的編輯,涉及上百個尿嘧啶的缺失和插入。由于RNA編輯是基因轉錄后在mRNA中插入、缺失或核苷酸的替換而改變DNA模板來源的遺傳信息，翻譯出多種氨基酸序列不同的蛋白質，RNA編輯的結果不僅擴大了遺傳信息，而且使生物更好地適應生存環(huán)境。有些基因的主要轉錄產物必須經過編輯才能有效地起始翻譯，或產生正確的可讀框(ORF)。例：組織靶標RNA所改變的堿基結果肝，腸肌肉睪丸，腫瘤等腫瘤腦載脂蛋白B半乳糖苷酶Wilms腫瘤基因-1神經纖維瘤基因-1谷氨酸受體蛋白C→UU→AU→CC→UA→I谷氨酰胺密碼子→終止子苯丙氨酸密碼子→酪氨酸亮氨酸密碼子→脯氨酸精氨酸密碼子→終止子多個谷氨酸密碼子→精氨酸RNA編輯機制核苷的插入或刪除編輯堿基替換編輯單堿基突變（apoB)RNA的編輯類型RNA編輯影響了基因的表達，生成不同的氨基酸和新的開放讀碼框。RNA編輯同基因的選擇剪接或可變剪接(alternativesplicing)一樣，使得一個基因序列有可能產生幾種不同的蛋白質，這可能是生物在長期進化過程中形成的、更經濟有效地擴展原有遺傳信息的機制。一、原核生物轉錄調控(ControlofProkaryoticGeneExepression)原核生物在對外環(huán)境突然變化的反應中，是通過誘導或阻遏合成一些相應的蛋白質來調整與外環(huán)境之間的關系。由于原核生物的轉錄與翻譯的過程是偶聯(lián)的，而且這種過程所經歷的時間很短，只需數(shù)分鐘，同時由于大多數(shù)原核生物的mRNA在幾分鐘內就受到酶的影響而降解，因此就消除了外環(huán)境突然變化后所造成的不必要的蛋白質的合成。與真核生物相比，原核生物基因表達的一個特點是快速。主要在轉錄起始水平調控第三節(jié)轉錄調控σ因子對轉錄的調節(jié)

操縱子對轉錄的調節(jié)（一）調控特點：

（二）調控機制Lac操縱子（負調控）Trp操縱子參與乳糖分解的一個基因群，由乳糖系統(tǒng)的阻遏物和操縱基因受負的控制，而同時又同步地受支配。細菌相關功能的結構基因常連在一起，形成一個基因簇。它們編碼同一個代謝途徑中的不同的酶。一個基因簇受到同一的調控，這一個完整的調節(jié)系統(tǒng)包括結構基因和控制這些基因表達的元件，形成了一個共同的調節(jié)單位，這種調節(jié)單位就稱為操縱子（opron）。操縱子的活性是由調節(jié)基因控制的，調節(jié)基因的產物可以和操縱子上的順式作用控制元件相互作用。乳糖操縱子

例1大腸桿菌乳糖酶誘導合成阻遏蛋白操縱基因結構基因半乳糖苷酶半乳糖苷轉乙酰酶半乳糖苷透性酶操縱基因——基因合成的開關調節(jié)基因關——阻遏蛋白阻擋操縱基因，結構基因不表達誘導物（乳糖）開——誘導物阻止阻遏蛋白功能發(fā)揮。mRNA酶蛋白乳糖操縱子調控的機制

lacZ編碼β-半乳糖苷酶，此酶由500kd的四聚體構成，它可以切斷乳糖的半乳糖苷鍵，而產生半乳糖和葡萄糖

lacY編碼β一半乳糖苷透性酶，這種酶是一種分子量為30kDd膜結合蛋白，它構成轉運系統(tǒng)，將半乳糖苷運入到細胞中。

lacA編碼β-半乳糖苷乙酰轉移酶，其功能只將乙酰-輔酶A上的乙?；D移到β-半乳糖苷上。

無論是lacZ發(fā)生突變還是lacY發(fā)生突變卻可以產生lac-型表型，這種lac—表型的細胞不能利用乳糖。lacZ-突變體中半乳糖苷酶失去活性，直接阻止了乳糖的代謝。lacY-突變體不能從膜上吸取乳糖。

lacZ、Y、A基因的轉錄是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白所控制。lacI一般和結構基因相毗連，但它本身具有自己的啟動子和終止子，成為獨立的轉錄單位。lac基因簇是受到負調節(jié)（negativeregulation）。它們的轉錄可被調節(jié)蛋白所關閉。

lacI的產物稱為lac阻遏物（lacrepressor），其功能是和lacZ、Y、A基因簇5′端的操縱基因（lacO）,操縱基因位于啟動子(lacP)和結構基因（lacZYA）之間。當阻遏物結合在操縱基因上時就阻礙了啟動子上的轉錄起始。lacO從mRNA轉錄起始點的上游-5處延伸到轉錄單位+21處。阻遏蛋白的負性調節(jié)：在缺乏誘導物（乳糖）時，這些基因不能轉錄，因為阻遏蛋白是活性狀態(tài)結合在操縱基因上。lac阻遏物（lacrepressor）由lacI產生，其功能是和lacZ、Y、A基因簇5′端的操縱基因（lacO）,操縱基因位于啟動子(lacP)和結構基因（lacZYA）之間。乳糖操縱子的調控機理有乳糖時在此系統(tǒng)中的誘導物并非乳糖本身,而是乳糖的同素異形體,稱為異乳糖(allolactose)。乳糖進入E.coli細胞,被轉化成異乳糖。異乳糖與阻遏蛋白結合后,它們即從操縱基因上解離下來,lac操縱子基因即開始表達。β半乳糖苷酶的濃度可以增加1000倍之多。一個誘導物分子結合在阻遏蛋白的特異部位上,引起阻遏蛋白構象的改變,結果使阻遏蛋白從操縱基因上解離下來。有乳糖時，乳糖受β-半乳糖苷酶的催化轉變?yōu)閯e乳糖，與R結合使R構象變化，R四聚體解聚而與O解離。特殊底物的存在導致了酶的合成，此現(xiàn)象稱為誘導（induction）。這種類型的調控廣泛存在于細菌中，在較低等的真核生物（如酶母）也有這種情況。當E.coli生長在缺乏β一半乳糖苷的條件下是不需要β-半乳糖苷酶的，因此細胞中含量很低，大約每個細胞不高于5個分子，當加入底物后細菌中十分迅速地合成了這種酶，僅在2-3分鐘之內酶就可以產生并很快增長到5000個分子/每個細胞。如在酶的濃度將達到細胞總蛋白的5-10%。如在培養(yǎng)基中除去底物，那么酶的合成也就迅速停止，恢復到原來的狀態(tài)。阻遏蛋白的活性受到小分子誘導的控制

負反饋：細胞質中有了β—半乳糖苷酶后，便催化分解乳糖為半乳糖和葡萄糖。乳糖被分解后，又造成了阻遏蛋白與操縱基因結合，使結構基因關閉。一些乳糖類似物不能被β-半乳糖苷酶分解，卻也能與R特異性結合而使其構象改變，誘導1ac操縱子的開放。如異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)是很強的非代謝性誘導劑；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）也是一種人工合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解產生蘭色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal被廣泛應用在分子生物學和基因工程工作中。CAP-分解（代謝）物基因結合蛋白CAP的正性調節(jié)作用1ac操縱子的強誘導既要有乳糖又要無葡萄糖。乳糖操縱子屬于可誘導操縱子(inducibleoperon)，在缺乏誘導物時，這類操縱子只有本底水平的表達，約為誘導時表達水平的0.1%左右，lac操縱子的表達水平在誘導和阻遏之間的差別在103倍。這也與阻遏蛋白的量有關，若阻遏蛋白少于10個/細胞，就不可能建立起嚴密的阻遏。

色氨酸操縱子(tryptophaneoperon)代表了一種衰減調控模式。Trp是構成蛋白質的組分，當有足夠的Trp時，操縱子自動關閉。細菌直接利用外界的Trp。缺乏Trp時，Trp操縱子被打開，5個結構基因表達，產生3個酶催化分支酸合成為Trp。色氨酸操縱子(trpoperon)1.負調控合成Trp所需要酶類的5個基因E、D、C、B、A頭尾相接串連排列組成結構基因群；受其上游的啟動子P和操縱子O的調控。調控基因trpR的位置遠離P-O-結構基因群，在其自身的啟動子作用下，以組成性方式低水平表達調控蛋白R’。R’并無活性，當提供足夠的Trp時，Trp與R’結合使其構象改變而成為活性形式R，R可與O特異性結合，阻遏結構基因的轉錄，R的阻遏能力僅為lacI產物的1/1000。調控機理當Trp達到一定濃度，但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產生Trp合成酶類的量已經明顯