化學發(fā)光免疫分析教學課件

化學發(fā)光免疫技術(shù)第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）（chemiluminescenceenzymeimmunoasssay）

第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術(shù)(CLIA)（chemiluminescenceimmunoassay）

第四節(jié)電化學發(fā)光免疫測定技術(shù)(ECLI)(electrochemiluminescenceimmunoassay)2021/4/171

化學發(fā)光免疫技術(shù)：集靈敏的化學發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測定于一體的檢測技術(shù)。概念

特點：特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化。2021/4/172化學發(fā)光免疫技術(shù)的類型

按發(fā)光劑不同分為

1.發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）

chemiluminescenceenzymeimmunoasssay

2.化學發(fā)光免疫測定技術(shù)(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學發(fā)光免疫測定技術(shù)(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay

按分離方法不同分

1.微粒子化學發(fā)光免疫測定

2.磁顆?；瘜W發(fā)光免疫測定2021/4/173第一節(jié)發(fā)光與化學發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。2.生物發(fā)光:反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用

ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。3.化學發(fā)光:在常溫下由化學反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射?；瘜W發(fā)光是一個多步驟的過程。2021/4/174

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光+AMP+O2+CO2+2021/4/175化學發(fā)光

機制：某些化合物可以利用化學反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。二、化學發(fā)光劑

化學發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學發(fā)光劑2021/4/176①能參與化學發(fā)光反應(yīng)；

②與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；

③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動力；

④應(yīng)不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。化學發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件返回2021/4/1771.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。

CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸

AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光2021/4/178對-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計測量。1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體2021/4/179AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩(wěn)定的

AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強度達到高峰，15～60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定。光AP

/OH—HPO42—1.3AMPPD2021/4/17109、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:33:54PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/34-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，可用熒光光度計進行測量。熒光AP1.44-MUP4-MU360nm激發(fā)光H3PO4+2021/4/17122.直接化學發(fā)光劑特點：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)。反應(yīng)迅速、背景低、信比高，發(fā)光量與AE濃度呈線性關(guān)系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光2021/4/17133.電化學發(fā)光劑

是指通過在電極表面進行電化學反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。特點：①反應(yīng)在電極進行；

②電子供體為：三丙胺（TPA）

③化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕返回三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖2021/4/1714第二節(jié)發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。二、技術(shù)類型

根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為：

1.熒光酶免疫測定技術(shù)

2.化學發(fā)光酶免疫測定技術(shù)

根據(jù)免疫學反應(yīng)模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法

3.固相抗原競爭法：2021/4/1715熒光酶免疫測定技術(shù)反應(yīng)原理圖

洗滌棄上清

是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。2021/4/1716化學發(fā)光酶免疫測定技術(shù)反應(yīng)原理圖

洗滌棄上清

是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過光強度的測定而直接進行定量。2021/4/1717電化學發(fā)光原理圖

這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進行產(chǎn)生許多光子，使光信號增強

返回激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定基態(tài)電極2021/4/17181.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將已包被了抗體的乳膠微粒和待測標本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時間后,再加入AP標記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物技術(shù)要點2.分離技術(shù)將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標抗體-抗原-膠乳微粒抗體復(fù)合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發(fā)光反應(yīng)

加入4-MUP，酶標抗體上AP將

4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大，根據(jù)標準曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量2021/4/17191.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應(yīng)后,最終通過磁場將結(jié)合酶標記物IC和游離酶標記物進行分離的技術(shù)。分離技術(shù)2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進行酶標記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后,將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離.2021/4/1720第三節(jié)化學發(fā)光免疫測定技術(shù)（CLIA）一、原理用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體,與待測標本中相應(yīng)Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反應(yīng)，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，然后加入發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應(yīng)，通過對發(fā)光強度的檢測進行定量或定性檢測。二、技術(shù)類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)

2.免疫學反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測定技術(shù)

3.不同只是相應(yīng)標記物是吖啶酯而不是酶2021/4/17211.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將包被McAb的磁顆粒和待測標本加入到反應(yīng)管中，標本中待測Ag與磁珠上Ab結(jié)合，再加上AE標記Ab，經(jīng)過溫育，形成磁珠Ab-Ag-AE標記Ab復(fù)合物。技術(shù)要點2.分離技術(shù)在電磁場中進行2-3次洗滌后，很快地將未結(jié)合的多余Ag和標記Ab洗去。3.化學發(fā)光反應(yīng)經(jīng)洗滌的磁珠中，加入H2O2和

pH糾正液NaOH，這時AE不需要催化劑即分解并發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測物含量成正比，按標準曲線，儀器可計算出被測物含量。2021/4/17221.AE其低背景噪音、化學反應(yīng)簡單、快速而無催化劑。方法評價2.AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達10-15g/ml。3.AE標記試劑有效期長，可達一年。4.固相分離劑為極為幼細的磁粉，除增大包被面積，加快反應(yīng)外，亦同時使清洗及分離更簡易、快捷。2021/4/1723五、臨床應(yīng)用1.甲狀腺激素2.生殖激素3.腎上腺/垂體激素4.貧血因子5.腫瘤標記物6.感染性疾病7.糖尿病8.心血管系統(tǒng)9.病毒標記物10.骨代謝11.過敏性疾病12.治療藥物監(jiān)測返回2021/4/17249、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:33:54PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023