化學(xué)發(fā)光免疫分析教學(xué)課件

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑第二節(jié)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）（chemiluminescenceenzymeimmunoasssay）

第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(CLIA)（chemiluminescenceimmunoassay）

第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(ECLI)(electrochemiluminescenceimmunoassay)2021/4/171

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：集靈敏的化學(xué)發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測(cè)定于一體的檢測(cè)技術(shù)。概念

特點(diǎn)：特異性高、敏感性高、分離簡(jiǎn)便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動(dòng)化。2021/4/172化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型

按發(fā)光劑不同分為

1.發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）

chemiluminescenceenzymeimmunoasssay

2.化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay

3.電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay

按分離方法不同分

1.微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定

2.磁顆粒化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定2021/4/173第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長波長的可見光。2.生物發(fā)光:反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用

ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。3.化學(xué)發(fā)光:在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。化學(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過程。2021/4/174

熒光素酶ATP；O2；Mg2+氧化螢火蟲熒光素螢火蟲熒光素生物發(fā)光返回光+AMP+O2+CO2+2021/4/175化學(xué)發(fā)光

機(jī)制：某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。二、化學(xué)發(fā)光劑

化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑2021/4/176①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；

②與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；

③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力；

④應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，特別是免疫活性?；瘜W(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件返回2021/4/1771.酶促反應(yīng)的發(fā)光底物

是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。

CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾、對(duì)-羥基苯乙酸

AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物）特點(diǎn)：可作標(biāo)記物、也可作過氧化物酶的底物1.1魯米諾H2O2/OH—HRP+N2+H2O

+光2021/4/178對(duì)-羥基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。1.2HPAH2O2HRP+熒光氧化二聚體2021/4/179AMPPDAMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的

AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā)出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15～60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。光AP

/OH—HPO42—1.3AMPPD2021/4/17109、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:33:54PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/34-MUP4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，可用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。熒光AP1.44-MUP4-MU360nm激發(fā)光H3PO4+2021/4/17122.直接化學(xué)發(fā)光劑特點(diǎn)：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì)。反應(yīng)迅速、背景低、信比高，發(fā)光量與AE濃度呈線性關(guān)系。常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2+光2021/4/17133.電化學(xué)發(fā)光劑

是指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。特點(diǎn)：①反應(yīng)在電極進(jìn)行；

②電子供體為：三丙胺（TPA）

③化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕返回三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖2021/4/1714第二節(jié)發(fā)光酶免疫測(cè)定（CLEIA）一、原理屬于酶免疫測(cè)定的一種。只是最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定。二、技術(shù)類型

根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為：

1.熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)

2.化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)

根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分

1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法

3.固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法：2021/4/1715熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖

洗滌棄上清

是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。2021/4/1716化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖

洗滌棄上清

是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量。2021/4/1717電化學(xué)發(fā)光原理圖

這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)

返回激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定基態(tài)電極2021/4/17181.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將已包被了抗體的乳膠微粒和待測(cè)標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時(shí)間后,再加入AP標(biāo)記抗體，溫育,形成固相包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物技術(shù)要點(diǎn)2.分離技術(shù)將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩沖液洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標(biāo)抗體-抗原-膠乳微?？贵w復(fù)合物則被保留在纖維膜上。3.酶促發(fā)光反應(yīng)

加入4-MUP，酶標(biāo)抗體上AP將

4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由電腦計(jì)算出所測(cè)物質(zhì)的含量2021/4/17191.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過磁場(chǎng)將結(jié)合酶標(biāo)記物IC和游離酶標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù)。分離技術(shù)2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體,然后用纖維膜柱子進(jìn)行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后,將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離.2021/4/1720第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)（CLIA）一、原理用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體,與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反應(yīng)，通過磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來，然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)進(jìn)行定量或定性檢測(cè)。二、技術(shù)類型

1.分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)

2.免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)

3.不同只是相應(yīng)標(biāo)記物是吖啶酯而不是酶2021/4/17211.抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將包被McAb的磁顆粒和待測(cè)標(biāo)本加入到反應(yīng)管中，標(biāo)本中待測(cè)Ag與磁珠上Ab結(jié)合，再加上AE標(biāo)記Ab，經(jīng)過溫育，形成磁珠Ab-Ag-AE標(biāo)記Ab復(fù)合物。技術(shù)要點(diǎn)2.分離技術(shù)在電磁場(chǎng)中進(jìn)行2-3次洗滌后，很快地將未結(jié)合的多余Ag和標(biāo)記Ab洗去。3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)經(jīng)洗滌的磁珠中，加入H2O2和

pH糾正液NaOH，這時(shí)AE不需要催化劑即分解并發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測(cè)物含量成正比，按標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器可計(jì)算出被測(cè)物含量。2021/4/17221.AE其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速而無催化劑。方法評(píng)價(jià)2.AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度，靈敏度可達(dá)10-15g/ml。3.AE標(biāo)記試劑有效期長，可達(dá)一年。4.固相分離劑為極為幼細(xì)的磁粉，除增大包被面積，加快反應(yīng)外，亦同時(shí)使清洗及分離更簡(jiǎn)易、快捷。2021/4/1723五、臨床應(yīng)用1.甲狀腺激素2.生殖激素3.腎上腺/垂體激素4.貧血因子5.腫瘤標(biāo)記物6.感染性疾病7.糖尿病8.心血管系統(tǒng)9.病毒標(biāo)記物10.骨代謝11.過敏性疾病12.治療藥物監(jiān)測(cè)返回2021/4/17249、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:33:54PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023