流式細胞術(shù)課件

流式細胞儀介紹

Tohelpallpeoplelivehealthylives流式細胞術(shù)－歷史回顧1973年BD推出世界第一臺流式細胞儀 FACSI（FluorescenceActivatedCellSorter）1980年中國的第一臺流式細胞儀FACSII生物學、免疫學、遺傳學、藥理學、腫瘤學、血液學、臨床檢驗等領(lǐng)域FACS流式細胞儀市場占有率：全球75%，中國70%，F(xiàn)ACSAria

市場占有率達到90％。流式細胞術(shù)定義：在流動的狀態(tài)中檢測單個細胞或顆粒的多項理化及功能性指標的一種分析技術(shù)特點：特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析檢測的樣本種類多樣：前提－單細胞懸液外周血，骨髓，細胞穿刺液，洗脫液，腹水，實體組織（腫瘤、腺體、淋巴結(jié)），培養(yǎng)細胞流式分選：以流動狀態(tài)的單個細胞的各項特性進行細胞分離流式檢測原理通過激光激發(fā)高速流動的單個細胞所攜帶的各種熒光素和熒光染料，并檢測由此產(chǎn)生的散射光和熒光的發(fā)射光，通過各種光信號的強弱來反應細胞的各種特征。流式細胞儀的分類臺式機型臨床型：FACSCalibur，F(xiàn)ACSCanto，F(xiàn)ACSCount科研型:LSRⅡ，F(xiàn)ACSAria，F(xiàn)ACSArray非臺式機型:FACSVantageSE，F(xiàn)ACSDiVa流式細胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)：將待測樣本按一定的速度一個個通過檢測區(qū)光學系統(tǒng)：產(chǎn)生并收集散射光和熒光信號電子系統(tǒng)：光學信號處理和顯示液流系統(tǒng)－樣本流細胞或微粒的懸浮液通過50－300um的小孔引入鞘液，使得細胞或微粒單個單個流經(jīng)檢測區(qū)FALSSensor90LSSensorLaser樣本細胞的大小

0.5-40微米液流系統(tǒng)－鞘液當液流系統(tǒng)符合雷諾茲公式時，樣品流能保持在液流的中心區(qū)流動而不和鞘液混合，即形成層流雷諾茲公式（Reynoldsnumber）當Re<2300,液流可以一直保持層流當

Re>2300,將會發(fā)生湍流流體動力學的聚焦效應（HydrodynamicFocusing）：大量的鞘液流包裹少量的樣本流，并對樣本流在中軸位置具有聚焦的作用液流系統(tǒng)－壓力系統(tǒng)液流系統(tǒng)－壓力系統(tǒng)光學系統(tǒng)－光源光束需和細胞或微粒在檢測區(qū)正交特定的熒光染料需要特定波長的激發(fā)光源兩類激發(fā)光源：激光器：易聚焦成高能量的分布的光斑，弧光燈：光束散交，能量低，位置和功率閃爍，光學系統(tǒng)－散射光信號前向角散射光（FSC):和細胞或待測顆粒的大小和表面積有關(guān)可以用來區(qū)分死/活細胞側(cè)向角散射光（SSC):和細胞結(jié)構(gòu)復雜性和顆粒性有關(guān)可以用來區(qū)分粒/非粒細胞光學系統(tǒng)－散射光信號散射光可以用來區(qū)分不同細胞群體的最基本的形態(tài)差異

- 常常用散點圖“DotPlots”來顯示

- 圖上的每一個點代表一個細胞的相應信息DotPlot(lysedwholeblood)光學系統(tǒng)--熒光信號細胞標記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長的激發(fā)光來激發(fā)熒光強度是和細胞上標記上的熒光染料的量正相關(guān)熒光在90°角的方向上檢測熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來接收特定檢測是通過光學濾片和透鏡來控制的熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)FL1=FITC+x%PEFL2=PE+y%FITC熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2(0–30%)(0–1%)如何進行補償？1、選擇補償管用的細胞，一定要含有補償用的抗體陽性和陰性的細胞群，陽性群體的熒光并盡可能強。2、染色同型對照，調(diào)節(jié)電壓盡可能高，一定要能看到完整的陰性細胞群，大一點的沒有太大關(guān)系。3、選擇細胞群中自發(fā)熒光相同的細胞群進行分析（例如外周血可選擇淋巴細胞）。光學系統(tǒng)－光學濾片長通濾光片只容許某一波長之上的光通過短通濾光片容許某一波長之下的光通過帶通濾光片容許某一波長的上下一個極小范圍內(nèi)的光通，帶寬可以特定化二向色性當濾光片和光源成45度角的方向放置，原本被通過的光照樣通過，而原本會被封鎖的光將會沿著90度角的方向被反射出去LONG(700nm)550LongPass650ShortPassSHORT(500nm)PassThroughFilters600/100BandPassTransmitted<650nm>550nm550-650nm(600±50)WavelengthsBlocked>650nm<550nm<550nm&>650nmShortPassLongPassBandPassLONG(700nm)550LongPass650ShortPassSHORT(500nm)Dichroic

FiltersTransmitted<650nm>550nmDiflected90°>650nm<550nm單激光光學平臺光電二極管檢測區(qū)高感度PMTs氬離子激光器光學系統(tǒng)－熒光監(jiān)測器兩種常見的熒光監(jiān)測器光電二級管:用于強信號的探測(如,前向散射光探測器)光電倍增管(PMT):比光電二極管更敏感但太強的光會對其造成破壞有最適的波長檢測范圍電子系統(tǒng)－數(shù)據(jù)的采集和處理對探測器檢測到的信號加以處理前置放大在從遠處的探測器傳到中央電子系統(tǒng)前對信號進行放大放大調(diào)節(jié)信號的強度線性的或?qū)?shù)的放大計算脈沖信號的積分，高度或?qū)挾葧r間調(diào)整多參數(shù)檢測時所必須的數(shù)模轉(zhuǎn)換流式細胞儀的分選功能對細胞或其他微粒的懸液中我們所感興趣的部分用具有分選功能的流式細胞儀將之分選出來兩種分選方式機械式：FACSCalibur帶電式：FACSAria流式細胞儀的分選功能對細胞或其他微粒的懸液中我們所感興趣的部分用具有分選功能的流式細胞儀將之分選出來兩種分選方式機械式：FACSCalibur檢測點后裝有一機械裝置捕獲所需要的細胞一旦檢測到所需要的細胞捕獲裝置就會移動到核心樣本流處細胞被捕獲轉(zhuǎn)移到收集容器中然后捕獲裝置又離開核心樣本流回復到原始位置帶電式：FACSAria回顧液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)細胞周期及倍體分析倍體分析原理細胞增殖周期：分為G0、G1、S、G2、M期。G0/G1期細胞為二倍體細胞，其DNA含量用2N表示，G2/M期為四倍體細胞，其DNA含量用4N表示，S期細胞DNA含量介于此兩者之間。利用熒光染料如PI（Propidiumiodide）與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，結(jié)合量多少可反映細胞內(nèi)DNA含量。FCM分析一個群體細胞峰DNA倍體與細胞周期時，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1,S,G2/M期三個細胞峰。G0/G1和G2/M細胞峰DNA的含量成正態(tài)分布，S期細胞峰則是一個加寬的正態(tài)分布。細胞周期示意圖及DNA含量直方圖細胞周期示意圖及DNA含量直方圖熒光信號的面積一般對DNA倍體測量時采用面積（如FL2-A），這是因為熒光脈沖的面積比熒光脈沖的高度更能準確反映DNA的含量，當形狀差異較大，而DNA含量相等的二個細胞，得到的熒光脈沖高度是不等的，經(jīng)過對熒光信號積分后，所得到的信號值就相等。寬度FL2-WFL2-W常用來區(qū)分雙聯(lián)體細胞，由于DNA樣本極容易聚集，當兩個G1期細胞粘連在一起時，其測量到的DNA熒光信號（FL2-A）與G2期細胞相等，這樣得到的測量數(shù)據(jù)G2期細胞比例會增高，影響測量準確性幾個概念DNA指數(shù)(DI)：通過比較G0/G1期細胞峰位置的變化顯示，為

測量樣本G0/G1期DNA熒光通道數(shù)與正常人淋巴細胞G0/G1期DNA熒光通道數(shù)比值。CV值：變異系數(shù)，由于儀器及實驗樣本的影響，測定過程中存在的漂移現(xiàn)象，其包括兩部分，即反應儀器精密度的CV值及實驗樣本的CV值。細胞凋亡的流式檢測凋亡與壞死凋亡---細胞主動參與自身死亡的過程。凋亡程序有一些特殊形態(tài)學特征，包括質(zhì)膜的改變，如細胞膜不對稱性和細胞附著消失，胞漿和細胞核固縮，核內(nèi)DNA裂解。到了晚期，凋亡細胞斷裂成“凋亡小體”，并很快被巨噬細胞清除，而不會引起周圍細胞的炎癥損傷壞死---通常是由細胞損傷或細胞毒物作用引起，在形態(tài)學和細胞生物特性上，與凋亡有著本質(zhì)的區(qū)別。壞死細胞的早期變化是細胞和線粒體腫脹，繼而細胞膜破壞。不同于凋亡的是，壞死的細胞胞質(zhì)內(nèi)容物（多為蛋白水解酶）釋放，會引起周圍組織的炎癥反應細胞凋亡檢測方法

細胞凋亡檢測的常用手段主要分為形態(tài)學檢查、分子生物學方法、免疫電泳法和細胞學檢查。其中，用流式細胞術(shù)研究細胞凋亡在技術(shù)和應用領(lǐng)域方面應用日益廣泛。由于可以對凋亡的多種特征進行快速、靈敏、特異的定性分析和定量分析，流式細胞術(shù)已經(jīng)成為凋亡分析的重要檢測手段。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡細胞形態(tài)的變化細胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻導致的細胞膜不對稱性消失線粒體膜電位的改變蛋白水解酶——Caspase酶的活化核酸內(nèi)切酶活化導致的DNA斷裂凋亡峰的檢測細胞散射光變化在細胞凋亡的初始階段，細胞膜發(fā)生皺縮，導致FSC減小，而SSC增加或者維持不變凋亡峰檢測：在凋亡細胞中，利用流式檢測PI染色后的DNA，可以發(fā)現(xiàn)一個亞群，稱為A0細胞，該細胞DNA染色減少。研究者認為DNA染色減少的原因是因為細胞內(nèi)DNA的程序性減少，源于DNA片斷化，而導致小分子量的DNA漏出照成的。凋亡峰檢測PI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cellsProtocols用70%的乙醇固定細胞1ml細胞懸液(1-5X106)均勻,快速混合于10ml預冷的70%乙醇中,置于4℃冰箱中≥2小時從細胞中萃取出小分子量DNA離心收集細胞,徹底去除乙醇,加入50ulDNA萃取緩沖液置于37℃水浴30分鐘離心細胞加入1mlPI/RNAse染液,室溫避光孵育30分鐘流式檢測磷脂酰絲氨酸的翻轉(zhuǎn)細胞發(fā)生凋亡時會有一系列的形態(tài)學特征性改變，其中，質(zhì)膜的改變是早期凋亡的特征之一。細胞發(fā)生凋亡時，胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露于細胞外表面。AnnexinV是一個35-36kD的Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它與磷脂酰絲