SNP的理論與應用

定量PCRTaqman探針上個世紀90年代原美國PerkinElmer(PE)公司開發(fā)出了Taqman熒光探針定量技術，將定量PCR帶入了更廣闊的應用空間。Taqman探針法的出現(xiàn)是定量PCR技術的重要里程碑，之后在此基礎上發(fā)展出了雜交探針法，以及熒光引物法，是對探針法的不斷改進和簡化。如果希望全面掌握定量PCR技術的研究人員就不能錯過這些定量檢測技術。

要提到熒光探針或者熒光引物，有一個基礎概念需要首先明確，那就是熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)：一對合適的熒光物質可以構成一個能量供體(donor)和能量受體(acceptor)對,其中供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，當它們在空間上相互接近到一定距離(1—10nm)時，激發(fā)供體而產生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā)射的熒光強度衰減，受體熒光分子的熒光強度增強。能量傳遞的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等有關。定量PCR所涉及的熒光探針和熒光引物的檢測都這個FRET原理相關。實時熒光中另一個很重要的概念，即Ct值。C代表循環(huán)。T代表閾值。Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環(huán)數反應的前個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省設置是個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的倍。研究表明，每個模板的值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可做出標準曲線因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數一：水解探針法

[TaqMan技術]原理：除了一對特異性引物，TaqMan探針法增加一條和模版互補的基因特異性探針（通常20—30bp），探針上5'端和3'端分別標記了一個報告熒光基團（供體）和一個淬滅熒光基團（受體），在反應初始（探針完整）時系統(tǒng)激發(fā)供體而產生的熒光信號被臨近的淬滅基團吸收，所以此時檢測不到供體熒光信號；而當PCR過程中TaqDNA聚合酶擴增到探針結合模版的位點時，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探針5'端的報告基團——游離的報告基團遠離淬滅基團，打破能量的傳遞，激發(fā)報告基團產生的熒光信號就可以被熒光檢測系統(tǒng)檢測到。這樣每擴增一條DNA鏈，就對應有一個游離的熒光分子（報告基團）形成，保證了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，因此對熒光信號進行檢測就可以實時監(jiān)控PCR的過程，準確定量PCR的起始拷貝數>。但是實際上探針較長使得兩端基團距離較遠，會導致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團也會產生不同波長的熒光，都會使得本底偏高[MGB技術]原理：針對Taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，2000年美國ABI公司推出了一種新TaqMan探針——MGB探針（minorgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，3'端采用了非熒光性的淬滅基因——淬滅基團吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。此外，MGB探針的3'端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交,升高探針Tm值,使較短的探針同樣能達到較高的Tm值——而短探針的熒光報告基團和淬滅基團的距離更近,淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高：一個15bp的MGB探針的信噪比大于6,優(yōu)于理想狀態(tài)下的25bp的普通Taqman探針（信噪比約為1.5）。允許采用更短的探針也簡化了探針的設計和成本。有實驗證明MGB探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變(因為堿基錯配對較短探針的雜交穩(wěn)定性影響更大)。水解探針之所以稱之為水解，主要是因為它利用的是Taq酶的水解作用，使得探針上的熒光報告基團遠離淬滅基團而發(fā)光信號，游離的報告基團數目對應PCR新擴增產物，此方法檢測的是積累熒光。優(yōu)點：1.靈敏，特異性高：具有模版序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎上進一步提高的定量PCR的專一性；每擴增一個特異產物只釋放一個分子的熒光染料，儀器檢測的是特異擴增的結果，非特異產物對檢測信號沒有影響，有效提高檢測的專一性。2.有多種不同波長的熒光基團對可供選擇，使得Taqman探針法可以實現(xiàn)在同一管內檢測多重PCR，降低成本也提高效率和準確性3.避免了熒光染料對PCR反應的影響

缺點：探針設計有一定難度，需要驗證效果，探針的合成和雙熒光標記成本高。此外，也有人認為，Taqman法利用了Taq酶的外切活性，而由于各家公司出產的Taq酶對于其外切酶活性并沒有做出嚴格的活性標定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影響，酶活性差異也給定量帶來了不確定性。至少，生物通定量PCR技術系列前面介紹的Stratagene2100萬美元專利之爭的FullvelocityDNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqman探針法了！

應用：Taqman技術廣泛應用在人類傳染病診斷和病原定量上，在動物疾病病原體基因的檢測、畜禽產品的檢驗檢疫、生物制品的鑒定以及在疫苗效力測定上等方面都有成功的許多例子。注意：1)探針長度應在15-45bp（最佳20-30bp)左右，以保證結合的特異性。2)GC堿基含量在40%-60%，避免單核苷酸序列的重復。3)避免與引物發(fā)生雜交或重疊。4)探針與模板結合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結合的穩(wěn)定程度,因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度，探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結果有影響。另外，在儀器的選擇上也要注意，盡量選擇具有4色或以上的熒光檢測通道的儀器，已保證你的機器的適用性和試劑選擇的靈活性。畢竟技術是在快速發(fā)展的。二、雜交探針法[FRET技術]原理：羅氏專利的FRET探針又稱為雙雜交探針，或者LightCycle探針。FRET探針由兩條和模版互補、且相鄰的特異探針組成（距離1—5bp），上游探針的3`端標記供體熒光基團，相鄰下游探針的5`端標記Red640受體熒光基團。當復性時，兩探針同時結合在模板上，供體基團和Red640受體基團緊密相鄰（距離1—5bp），激發(fā)供體產生的熒光能量被Red640基團吸收，使得檢測探頭可以檢測到Red640發(fā)出波長為640的熒光。當變性時，兩探針游離，兩基團距離遠，不能檢測到640波長的熒光。FRET探針檢測的信號是退火時的實時信號，每次檢測信號始終嚴格對應模版的數量，非累積信號，可以用于做Tm曲線和SNP檢測。常用的受體熒光基團除了LC-Red640還有LC-Red705。兩個單標記探針的長短不影響信號的傳遞，而探針間的距離通常為1-5bp（雖然越短越好，還是要留點空間避免相互之間的反應）。我們前面提到，Taqman水解探針法中，一但報告基團水解離開淬滅基團，就一直游離于反應體系中可被檢測，所以檢測的是累積熒光，是不可逆的。雜交探針不同，是復性時兩條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產生檢測信號，到升溫變性探針遠離模版就沒有信號，所以檢測的是實時信號，是可逆的，所以可以進行熔解曲線的分析，還可以用于進行突變分析，SNP基因分型以及產物鑒別。比如一旦探針位置上出現(xiàn)有點突變，通過熔解曲線就可以很快分析出來，這也是Taqman法無法做到的。另外，由于采用2條模版特異的探針，雜交探針法的專一性無疑更高于其他方法，不受非特異產物的影響。

Fret探針法由于需要合成2條探針，探針的末端要封閉以避免反應，所以合成的成本會比較高，也比較麻煩。但實際上，F(xiàn)ret探針的設計其實比Taqman探針容易，因為Taqman探針要求一定的長度以保證探針的特異性和結合模版的能力，但是長度會導致兩末端的熒光基團距離遠而使得熒光共振能量傳遞的效率降低，淬滅不徹底。Fret探針就不受這個限制。不管怎么說，多數人還是習慣認為單探針比合成2條探針要簡單。

在水解和雜交探針技術之間產生另外一種技術：分子信標（分子信標產生時間是1996年）[分子信標技術］原理：分子信標（Molecularbeacon，MB）是一種呈發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。熒光基團被激發(fā)后產生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標的莖環(huán)結構中，環(huán)一般為15-30bp（有人認為18-20個bp較好）長，并與目標序列互補，莖一般5-7bp長（GC含量較高），相互配對形成莖的結構。熒光基團標記在探針的一端，而淬滅劑則標記在另一端。在復性溫度下，因為模板不存在時形成莖環(huán)結構，當加熱變性會互補配對的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發(fā)時，淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。應用：應用于基因定量分析和突變體識別、疾病基因檢測與診斷、單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)分析等生物醫(yī)學基礎和臨床研究中。

優(yōu)點：本底低，特異靈敏

缺點：①雜交時探針不能完全與模板結合，因此穩(wěn)定性較差。②探針合成時標記較復雜延伸技術：建立在分子信標技術基礎上的探針技術有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等，其中Sunrise技術，這一方法的特點是所有的擴增產物均能標記上熒光分子，因此熒光信號響應快，但無法區(qū)分特異和非特異擴增是其致命的不足。Amplisensor技術是一種復合探針技術，一個探針上連接一種熒光物，另一探針連接一淬滅物。兩探針長度不同，其中淬滅物標記探針5’端多出7個堿基（GCGTCCC）。PCR擴增前需將熒光物標記探針與一個半套式PCR引物連接，PCR引物的5’末端應有一段與長探針互補的序列，以便連接酶將該引物與短探針連接。擴增時該探針－引物復合物作為半套式引物摻入到模板，從而釋放出淬滅探針部分，破壞了FRET，而產生熒光

Scorpion技術（蝎形引物）則是通過在分子信標的3’端設計連接臂連接一段引物，延伸反應時不能夠延伸至分子信標，這樣非特異擴增產物便無熒光信號。包含發(fā)夾結構的PCR產物在退火時形成分子內雜交，發(fā)夾結構被破壞，兩個基團之間發(fā)生熒光共振能量轉移，從而發(fā)出熒光。這種方法可以解決非特異的問題，同時靈敏度高，反應快，已應用于k-ras及BRAC2基因的突變分析了，但這種方法不能保證雜交時探針與模板完全匹配，而且合成復雜。

這種技術雖然也是積累熒光（因為結合上模板以后不會掉下來），但是不同于Taqman水解探針，分子信標可以進行溶解曲線分析，這也就是說分子信標可以進行包括突變檢測，SNP檢測等在內的定量PCR延伸應用。但是這種技術正如上面提到的探針設計復雜，穩(wěn)定性差——而這一點對于溶解曲線的影響頗大，因此在應用上也需要審慎考慮。第三代、熒光引物[Amplifluor技術]原理：激發(fā)的熒光進行分子能量轉移到受體成分導致熒光發(fā)射的淬滅。目標特異性Amplifluor引物包含一個5’內部互補序列，標記有熒光發(fā)色團（fluorescerin）和一個能量受體：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。發(fā)夾結構的3’端序列是目標特異性引物區(qū)。未結合的Amplifluor引物由于內部熒光發(fā)色團和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號。

在第一個循環(huán)中，Amplifluor引物1與特異CDNA的第一條鏈退火并被Taq酶延伸。在第二個循環(huán)中Amplifluor引物1延伸產物作為引物2（反義鏈引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產生熒光信號。隨后的擴增循環(huán)中產生的熒光信號的增強與擴增產物量的增加成比例。

[LUM技術]原理：LUM(lightuponextention)引物技術是Invitrogen公司的一項專利，是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術。使用類似分子信標的發(fā)夾結構設計引物，使引物同時起到熒光探針的作用。引物對中的一個引物3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結構，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對，發(fā)夾結構打開，產生熒光信號。使用LUX引物，不需要專門設計探針，即省了成本又給實驗設計提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性，因此他的特異性要弱于探針技術，但非特異性擴增或引物二聚體沒有影響，所以其特異性要強于SYBRGREEN。

看完這些方法，相信新近接觸定量PCR的人就已經覺得眼花繚亂了，其實雖然以上這些檢測技術有許多，但是實際上在商品成熟應用上并不是有這么多豐富的選擇，具體的優(yōu)良產品篩選請見：定量PCR經典之選——Taqman探針科研定量PCR首選——雜交探針定量檢測精靈——熒光引物中國的PCR——達安SNP的理論與應用單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）：主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。理論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個或4個等位多態(tài)性，但實際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的。這種變異可能是轉換（CT，在其互補鏈上則為GA），也可能是顛換（CA，GT，CG，AT）。轉換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。Wang等的研究也證明了這一點。轉換的幾率之所以高，可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內的SNP（codingSNP,cSNP）比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5.但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：同義cSNP（synonymouscSNP）：即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；非同義cSNP（non-synonymouscSNP）：指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。先形成的SNP在人群中常有更高的頻率，后形成的SNP所占的比率較低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不盡相同，但大約有85%應是共通的。SNP自身的特性決定了它更適合于對復雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識別等方面的研究：1、SNP數量多，分布廣泛。據估計，人類基因組中每1000個核苷酸就有一個SNP，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs.SNP遍布于整個人類基因組中，根據SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs（Coding-regionSNPs，cSNPs）、基因周邊SNPs（PerigenicSNPs，pSNPs）以及基因間SNPs（IntergenicSNPs，iSNPs）等三類。2、SNP適于快速、規(guī)?；Y查。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標記，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發(fā)展自動化技術篩選或檢測SNPs.3、SNP等位基因頻率的容易估計。采用混和樣本估算等位基因的頻率是種高效快速的策略。該策略的原理是：首先選擇參考樣本制作標準曲線，然后將待測的混和樣本與標準曲線進行比較，根據所得信號的比例確定混和樣本中各種等位基因的頻率。4、易于基因分型。SNPs的二態(tài)性，也有利于對其進行基因分型。對SNP進行基因分型包括三方面的內容：（1）鑒別基因型所采用的化學反應，常用的技術手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應、側翼探針切割反應以及基于這些方法的變通技術；（2）完成這些化學反應所采用的模式，包括液相反應、固相支持物上進行的反應以及二者皆有的反應。（3）化學反應結束后，需要應用生物技術系統(tǒng)檢測反應結果。SNP檢測技術snp現(xiàn)有檢測技術有主要的3大類別1、測序主要發(fā)現(xiàn)新的snp位點和比較集中的snp位點，如hla區(qū)域，但成本較高，工作量大，不適合大樣本做疾病關聯(lián)分析。2、taqman探針結果比較可靠，國外文章也大量應用，不過對于國內成本偏高，同類還有snpshot技術，abi和貝克曼都相應試劑盒。成本和成功率都比taqman要低。3、snp芯片國外大規(guī)模篩查疾病關聯(lián)分析常用，illumina和affy都有不同密度的成熟產品，單位點成本很低，但點較多，樣本多時也會很高花費，但結果準確，適合復雜疾病，有實力的項目組一般大型機器點在384-群基因組可以訂制，但成本會高；illumina開發(fā)了一臺小的芯片，極其適合1-384，可以訂制，成本在2-5元/人點，但還沒有很成熟的流程，具體效果和成功率要進一步看。剩下的就是傳統(tǒng)方法如酶切，pcr-sscp等，也有雜志接受，但一般需要測序驗證。缺點是工作量太大，結果不準確，不是所有位點都可以做，但成本很低。突變數據庫HumanGeneMutationDatabase(HGMD)http://www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html

TheGenomeDatabase(GD)SNP數據庫DatabaseofSingleNuleotidePolymorphisms(dbSNP)/SNP/

HumanGenomeVariationDatabase(HGVbase)http://hgvbase.cgb.ki.se/TheSnpConsortium，LTD.（TSC）/

為什么說SNP的變異沒有STR(shorttandemrepeat)大?一般來說SNP是雙等位基因的，就是說一個位點，人群中大部分人是A堿基，那么還有一部分人是T堿基，一般不會是C或者G了，這是一般的規(guī)律，沒有什么好解釋的。舉個例子，一個人是正常人,他的某一條染色體一段序列是：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，反向肯定是一串T了，是吧？另一條染色體也是這個樣子的，因為有父母兩條染色體的。當然這是大部分人的情況。另外一小部分人，1%左右吧，這是統(tǒng)計數字，呵呵，一條是AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，反向也是一串T，另一條染色體就會出現(xiàn)這種情況AAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，在第五個堿基有一個SNP那么這條染色體的反向我就不說了，這種人是一種雜合子，還有一部分人是純合子，現(xiàn)在應該知道了吧？就是兩條染色體都是在第五個堿基是G，那么這個SNP是雙等位基因的，就是除了A就是G了。而STR是shorttandemrepeat,短串聯(lián)重復，一般是CA重復，重復次數很多的。在一個人的染色體上可以有多種重復。假設A個體，來自父親的染色體重復了10次，來自母親的那條重復了11次，B個體來自父親的染色體重復了8次，來自母親的那條重復了14次，那么這樣說這個STR已經有四種等位基因型了，當然還有更多的。所以說，變異沒有STR那么大。

SNP功能研究進展

SNP的研究在當前仍然可以用入火如荼形容，一方面是各大數據庫可以方便檢索到幾乎任何一個基因的SNP分布及其頻率，另一方面SNP的功能研究有非常大的研究空間和前景，這應歸于許多SNP的流行病關聯(lián)研究重復性差，因此只有在功能上對其闡述才能解決根本問題。當前SNP功能研究主要有以下幾方面：1、報告基因轉染技術：這一技術主要用于研究啟動子SNP對于mRNA轉錄效率，是通過觀察轉錄結局來判斷SNP是否具有功能。2、EMSA技術：通過在體外合成含SNP位點的寡核苷酸與轉錄因子特異性結合，觀察結合的強度和效率,但是該技術由于只人工合成較短長度的寡核苷酸，沒有考慮SNP周圍遺傳背景環(huán)境的影響,因此在重復性和說服力上不強。3、ChiP技術：該技術通過超聲將染色體碎片化,再將碎片化的核酸與轉錄因子的結合，最后通過PCR技術觀察判斷結合的效率和強度，該技術克服了EMSA的一些缺點,當前做的文獻較多。Cell上的一篇文章絕對是SNP功能的經典文章，值得一看:Cell,Vol119,591-602,24November2004ASingleNucleotidePolymorphismintheMDM2PromoterAttenuatesthep53TumorSuppressorPathwayandAcceleratesTumorFormationinHumans,GarethL.Bond,WenweiHu,ElisabethE.Bond,etal定量PCRTaqman探針的應用Taqman探針雖然只發(fā)展了短短的幾十年，但是無論在技術上還是在應用上都有了長足的發(fā)展，尤其是配合著細胞生物學，病理學等方面的發(fā)展，應用領域有了很大的延伸。Taqman定量應用可以分為幾個層次，第一個層次自然就是應用到臨床檢測，微生物檢測和食品檢測等方面，第二個層次是分子生物學層面的，包括對各種基因的表達進行定量或者半定量的分析（同一基因在不同組織中的表達差異，同一基因在不同藥物處理后的表達差異，轉基因食品的檢測等），第三個層次是包括突變分析，等位基因分析，DNA甲基化檢測等在內的遺傳學檢測和單核苷酸多態(tài)性分析。第一個層次：實際檢測應用

這個層面主要是一些微生物檢測，食品檢測，環(huán)境監(jiān)測以及一些醫(yī)學臨床應用（病源體檢測，基因病診斷，傳染病檢測，微小殘留病變檢測等），在這些方面定量PCR與傳統(tǒng)的方法具有相似的靈敏度，但是耗時少，需要的勞動力也少，而且它們既可以從活著的也可以從死的病原菌中檢測和定量核酸，而傳統(tǒng)的微生物方法只能檢測活的病原菌。這些主要應用到的就是定量PCR在核酸濃度上的簡單定量，由于之前要想在分子操作過程中知道核酸的濃度，主要應用的方法是瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計，但是這兩種方法前者靠主觀判斷，造成的偏差較大；后者很易受樣品中雜質的影響。因此定量PCR由于其靈敏度高、特異性強、無污染性和準確性等特點當然成為了首選。第二個層次：分子生物學應用檢測應用和分子生物學應用都是利用了定量PCR對基因表達的檢測，只不過前者是在臨床實際應用上，而后者則是側重于科學研究。在分子生物學上定量PCR的應用相當廣泛，包括基因轉錄檢測（即同一基因在不同組織中的表達差異），轉基因生物檢測，腫瘤耐藥基因表達等在內的高通量基因表達檢測（雖然Taqman相對于SYBRGreen熒光染料，沒有那么靈活，但是在陸續(xù)各生物技術公司推出一些相應試劑盒，也保證了Taqman在高通量方面的應用）。之前的高通量篩選基因表達差異的技術是cDNA芯片和差異顯示，但這兩種技術的缺點是只能定性而非完整意義上的定量分析。定量PCR技術的出現(xiàn)無疑為這種檢測提供了極大的方便，利用定量PCR檢測產物并進行熔解曲線分析的方法，已經對cDNA芯片和差異顯示技術的結果進行了確認，而且得到了更加完整和精確的結果。第三個層次：遺傳學，SNP分析以及深入應用

點突變分析和等位基因分析：用不同的熒光報告基團標記的Taqman探針分別與野生型和突變基因雜交。探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關。如果一種染料的熒光信號明顯強于另一種則說明它是一個純合子，如果兩種熒光信號都增加則表明是一個雜合子。實時定量PCR的數據被標在xy坐標軸上來區(qū)分特異的基因型。利用這種方法，能在不到兩個小時內很快對96個樣本進行基因分型。這一方法最先由Sevall在文章“Rapidallelicdiscriminationfromreal-timeDNAamplification”中提及。為了檢測突變體，可以設計兩種不同顏色的探針：一個探針設計來檢測野生型，可以標記FAM，另一個標記JOE的探針來檢測突變體。通常兩個探針的差別只有1個bp，由于兩個探針相差極小，因此一般推薦使用嚴格的反應條件。通過分析數據，兩個通道的結果會呈現(xiàn)在一個屏幕中，沒有標記物的曲線是CH1結果，有循環(huán)數的是CH2，最多可以有四個探針(兩個突變體)可以被分析，在編輯好基因型名稱，將域值調整到0以上后，結果就會在圖下方的表格中顯示出來。DNA甲基化分析：CG島內胞嘧啶的甲基化形成5’-甲基胞嘧啶被認為和許多人類疾病特別是癌癥有關。Laird等人利用一種被稱作Methylight的技術。Methylight是一種基于Taqman探針的甲基化特異定量PCR技術。在擴增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。特異的引物和Taqman探針被用來區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA。和其它實時PCR方法一樣，Methylight無需電泳，因而提高了反應的靈敏性和通量。這種方法的靈敏性在食道癌病人血液中癌細胞異常甲基