第五章分子生物學研究法(上)3

分子生物學基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)

第五章

扉頁：當你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，否則，你對事物的觀察就會受影響；當你翻開書本的時候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀”，否則，你就不可能走在別人的前面。5.4SNP的理論與應(yīng)用SNP的定義定義：單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。

是第三代遺傳標記。5.4.1SNP概述單倍型：是指位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點。SNP分類：cSNP同義cSNP非同義cSNPpSNPrSNP基因調(diào)控區(qū)SNP基因間隨機非編碼區(qū)SNP基因編碼區(qū)SNP5.4.2SNPs經(jīng)典檢測方法一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法,如:1.限制性片段長度多態(tài)性法PCR-RFLP;2.單鏈構(gòu)象多態(tài)性法PCR-SSCP;3.變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);4.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等PCR-RFLP方法

原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點，酶切片斷的長度和數(shù)量則會出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點。特點：該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點必須含有該限制內(nèi)切酶的識別位點，它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一.PCR-RFLP原理圖單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)

原理：單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，不同的二級結(jié)構(gòu)在電泳中會出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級結(jié)構(gòu)依賴于堿基的組成，單個堿基的改變也會影響其構(gòu)象，最終會導致在凝膠上遷移速度的改變。在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測SNP。特點：由于該方法簡單快速，因而被廣泛運用于未知基因突變的檢測。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置。變性梯度凝膠電泳（DGGE）原理：是利用長度相同的雙鏈DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過梯度變性膠將DNA片段分開的電泳技術(shù)。電泳開始時,DNA在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān),而一旦DNA泳動到某一點時,即到達該DNA變性濃度位置時,使得DNA雙鏈開始分開,從而大大降低了遷移速率。當遷移阻力與電場力平衡時,DNA片段在凝膠中基本停止遷移。由于不同的DNA片段的堿基組成有差異,使得其變性條件產(chǎn)生差異,從而在凝膠上形成不同的條帶。等位基因特異PCR(AS-PCR)原理：根據(jù)SNP位點設(shè)計特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3′末端與SNP位點的堿基互補(或相同),另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進行設(shè)計,因此,AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標記。因為特異引物在一種基因型中有擴增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒有擴增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產(chǎn)物的有無,從而確定基因型的SNP。

5.4.3SNPs高通量的檢測方法

另一大類檢測方法是近些年來發(fā)展起來的,高通量、自動化程度較高的檢測SNPs的方法,較為常用的有:1.DNA測序法;2.DNA芯片檢測;3.飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)檢測;4.變性高效液相色譜(DHPLC)法等等DNA測序法直接測序是最容易實施的SNP檢測方法。原理:

通過對不同個體同一基因或基因片段進行測序和序列比較,以確定所研究的堿基是否變異,其檢出率可達100%。特點：可以得到SNP的類型及其準確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù)?；蛐酒夹g(shù)(Genechips)

原理:是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的載體上，待測基因經(jīng)提取、熒光標記后，與固定好的探針進行雜交，最后根據(jù)熒光的強度和種類測出待測序列的堿基類別。

特點：基因芯片具有信息量大和自動化程度高的突出優(yōu)點。但它也存在若干問題:芯片造價高昂,所需設(shè)備貴重,不利于普及應(yīng)用。MALDI-TOF

原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過與硅芯片上的化合物共價結(jié)合后,在硅芯片上進行引物的退火,延伸反應(yīng),突變部位配對的堿基與正常配對的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。變性高效液相色譜(DHPLC)原理：目標核酸片段PCR擴增，部分加熱變性后，含有突變堿基的DNA序列由于錯配堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈。因包含錯配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對的同源配對區(qū)和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來,從而達到分離的目的。SNPs的有無最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異,依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基。特點：使用高效液相色譜檢測SNPs具有檢測效率高，便于自動化的優(yōu)點，對未知SNPs的準確率可達95%以上。但DHPLC檢測對所用試劑和環(huán)境要求較高,容易產(chǎn)生誤差,不能檢測出純合突變。

SNP及突變研究的最新工具

高分辨率熔解曲線

（HighResolutionMelting）

HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列變化的Amplicon之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進行突變檢測，比如：5.4.4SNP的應(yīng)用1.人類基因單體型圖的繪制2.SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析3.指導用藥與藥物設(shè)計Gene

SNPbybioinformatics真核生物基因組龐大，含有大量重復序列。無論是電泳分離技術(shù)還是通過雜交的方法，都難以直接分離到目的基因片段。盡管高等生物一般具有3-5萬種左右不同的基因，在單個細胞或組織的特定時間段中，僅有15-20%左右的基因得以表達。5.5基因克隆技術(shù)cDNA克隆的基本過程是通過一系列酶催作用，使總poly（A）mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體并插入到適當?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。

基因工程基本步驟

目的DNA制備；載體DNA選擇

↓

DNA體外重組技術(shù)

↓（DNA酶切實驗、連接實驗）

重組DNA的轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）試驗

↓

重組克隆的篩選與鑒定

（重組體的表型篩選，指紋圖譜法，

PCR方法，探針雜交法）

↓

目的基因表達產(chǎn)物的篩選與鑒定

（遺傳互補法，免疫化學法－Western印雜交法，微細胞法(microcellmethod)

基因工程流程示意圖5.5.1

RACE(cDNA末端快速擴增)是用于從已知cDNA片段擴增全長基因的方法，它根據(jù)已知序列設(shè)計基因片段內(nèi)部特異引物，由該片段向外側(cè)進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴增3’端的稱為3’RACE。5’RACE1.在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以已知基因片段內(nèi)部。特異性引物啟始cDNA第一條鏈的合成2.RNase混合物降解模板mRNA，純化cDNA第一條鏈。3.用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈3‘端加入連續(xù)的dCTP4.以連有oligo(dG)的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進行PCR擴增，以期得到目的片段，并可用nestPCR進行檢測。3’RACE1.在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以連有可以和polyA配對的oligo(dT)的錨定引物啟始cDNA第一條鏈的合成。2.用RNaseH降解模板mRNA。3.用通用錨定引物和基因片段內(nèi)部特異引物進行PCR擴增得到目的3‘片段，并可用nestPCR的方法繼續(xù)進行檢測和擴增。5.5.2應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因該法通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片段。因為Tester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次T減D反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復性與延伸，94℃變性這兩個參數(shù)共20個PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。RDA流程圖。5.5.3TA載體TopoTA載體InvitrogenProprietary&Confidential38DifferentwaystogeneratetheentrycloneTOPO?CloningTOPO?BPClonase?BPCloningPCRProduct+TOPO-ActivatedEntryVectorL1L2Gene+attBPCRProductB2GeneB1DonorVectorP2ccdBP1EntryCloneL2GeneL1+digestedDNAFragmentGeneB1digestedEntryVectorL2L14.Pre-madeentryclone5.Custom-madeentrycloneLigaseRestriction/LigaseCloningORFCollectionL2ORFL1MultiSiteGateway?-ExtendingtheapplicationsYourApplicationGene1Gene2Gene3Gene4YourApplicationGeneProteinLocalizationGeneGeneProteinPurificationGeneRNAiGeneCell-FreeGeneProtein

interactionGeneGeneEntryClonePCRGenesynthesisORFcollectionLibraryYourSourceGateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)大量的基因組序列被測定，要闡明這些基因的功能需要將不同的可譯框架連入載體，傳統(tǒng)的方法不能滿足大規(guī)模克隆的需要。Gateway基因大規(guī)?？寺》ǎ豪忙耸删w進行位點特異性DNA片段重組，實現(xiàn)了基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移。Gateway克隆技術(shù)主要包括：TOPO反應(yīng)和LR反應(yīng)TOPO反應(yīng)：將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體；LR反應(yīng)：被用于將目的片段從Entry載體中重組入表達載體。Entry載體上的CCCTT被拓撲異構(gòu)酶識別，切開后通過274位酪氨酸與切口處的磷酸基團形成共價鍵，加入PCR產(chǎn)物后，形成的3’突出端GTGG,攻擊PCR產(chǎn)物的互補性末端并與接頭序列CACC退火，切去GTGG后使PCR產(chǎn)物以正確方向連入Entry載體5.5.4基因的圖位克隆

（Map-basedcloning）所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。首先，通過構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記。通過對許多不同的生態(tài)型及大量限制性內(nèi)切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的RFLP標記，通過染色體步移技術(shù)將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來。圖5-25染色體步移法克隆基因示意圖5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學技術(shù)1995年，首次發(fā)表關(guān)于蛋白質(zhì)組學（proteome）概念的論文。蛋白質(zhì)組是指一個基因組所表達的全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學是指在蛋白質(zhì)組水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯與修飾、蛋白與蛋白相互作用等，并由此獲得相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展及細胞代謝等過程的整體認識5.6.1雙向電泳技術(shù)5.6.2蛋白質(zhì)印跡法5.6.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)5.6.1雙向電泳技術(shù)等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing,IFE）

利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場作用下在凝膠內(nèi)沿電場方向制造一個pH梯度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）在有去污劑十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳。依賴于蛋白質(zhì)的兩個性質(zhì)：等電點和相對分子質(zhì)量當?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處，具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處，達到分離的目的。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，SDS負電荷掩蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復合物在SDS聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子量大小。如果將等電聚焦電泳與SDS結(jié)合起來，就是分辨率更高的雙向電泳。雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出它們在分子量上的差別。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點不同的蛋白質(zhì)以及等電點相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。5.6.2蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法（Westernbloting），又稱免疫印跡法（immunoblotling）原理：據(jù)被測蛋白能與特異性抗體結(jié)合的特性和該蛋白的相對分子質(zhì)量。特點：高效、簡便、靈活等蛋白質(zhì)樣品電泳非標記抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng)熒光素酶或放射性同位素標記的第二抗體起反應(yīng)通過顯色或放射自顯影法檢測凝膠中的蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素薄膜）方法：圖5－28免疫印跡法示意圖封閉影響免疫印跡法成敗的因素：主要因素是：抗原分子中可被抗體識別的表位信息。第二個因素：蛋白原液中抗原的濃度用于檢測的二級抗體一般分為以下三種1.放射性標記的抗體2.與酶偶聯(lián)的抗體：主要包括：辣根過氧化物酶堿性磷酸酯酶3.與生物素相偶聯(lián)的抗體westernblot實驗步驟視頻WesternBlot-SNAPi.dSystem5.6.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)基質(zhì)輔助的激光解析電離－飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）質(zhì)譜基礎(chǔ)

樣品離子源質(zhì)量分析器離子檢測器固體液體蒸汽形成離子(帶電分子)電離質(zhì)量分選(過濾)檢測根據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜檢測離子基本步驟:1.樣品離子化2.根據(jù)質(zhì)量(m/z)不同分離離子3.檢測每種質(zhì)量離子的數(shù)目4.收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖質(zhì)譜的評價指標質(zhì)量范圍速度靈敏度分辨率精確度+++自由漂移區(qū)檢測器基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)樣品探針激光335nmm/z相對強度MH+MH+MH+特點：靈敏度高準確度高分辨率高質(zhì)量范圍