工業(yè)微生物的菌種選育與保藏

工業(yè)微生物的菌種選育與保藏第一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)菌種的分離簡介

一、菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。第二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日二、分離思路

新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。第三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟第四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。田園土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主。富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。第五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日從自然界篩選第六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。第七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日（二）增殖培養(yǎng)

為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。第八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日（三）培養(yǎng)分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這—步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。劃線分離法稀釋分離法第九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日（四）篩選

這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。第十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日（五）毒性試驗

自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)培養(yǎng)分離

從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時調(diào)整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應(yīng)。第十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日一、成功的分離培養(yǎng)方法(1)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程；(2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)；(3)將生態(tài)學(xué)方法運用到分離和篩選過程。第十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日二、培養(yǎng)分離中要解決的問題1、“分離什么和從哪里分離出?”

2、必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測方法。第十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點1．羅列出所要分離的微生物類群；2．根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：3．將若干樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等；4．羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢及溫度等；第十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

5．列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠；

6．根據(jù)上述1-5項中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件；

7．用標(biāo)準(zhǔn)方法作對照來評價生態(tài)學(xué)分離方法；

8．根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法；

9．運用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。第十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日四、自然界中細(xì)菌的分離第十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

(一)采樣和采集方法為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。第十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日采樣的注意事項1、采樣時應(yīng)盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的；第十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日5、采好的樣應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長第二十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日1．土樣采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5～15cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根際土樣時，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。第二十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日2．植物體采集方法

在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與根際土樣一起保存。第二十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

3．水樣采集方法用于細(xì)菌檢測的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測，或者4℃下貯存。第二十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基

的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會影響實驗中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。第二十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日3、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50μg／m1，以抑制真菌的生長。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l－2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。第二十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離

分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無需進(jìn)行富集。但對某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng)。第二十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日富集方法運用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來。第二十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。植物體上細(xì)菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。水中細(xì)菌的分離：水樣通過0.22μm無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印分離法。第二十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日水中細(xì)菌分離的簡易富集技術(shù)

在無菌的、用棉團塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上；在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖。培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長。另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌、中溫菌和嗜高溫菌。第二十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日次代培養(yǎng)及純化步驟1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進(jìn)行分類。2、用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組。4、將認(rèn)為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進(jìn)行篩選。第三十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日五、放線菌的分離(一)采樣及采集方法應(yīng)盡可能實行無菌操作。所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性。樣本采集完后，應(yīng)及時處理或在4℃下貯存，貯存試樣處應(yīng)與劃線，篩選平板分開，貯存時間不宜過長。第三十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

(二)生態(tài)學(xué)參數(shù)

放線菌分離培養(yǎng)過程中所需考慮的生態(tài)參數(shù)有溫度、pH、離子強度、氧化還原電勢和底物濃度。第三十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日（三）培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。第三十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。第三十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。第三十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日六、真菌分離1、利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷涉生長。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時，真菌子實體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時應(yīng)加以考慮。第三十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日4、選擇性富集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標(biāo)微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長及菌落形成。第三十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日真菌的分離方法土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。子實體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。第三十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日七、生產(chǎn)選種

是在長年累月的生產(chǎn)實踐中，在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下，突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大，這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞，在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件，并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢，這種優(yōu)勢的發(fā)展，促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露。進(jìn)行類似新種篩選分離，達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的。第三十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種：是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。第四十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日工業(yè)菌種育種的方法誘變基因轉(zhuǎn)移基因重組第四十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日育種過程包括下列3個步驟：

(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。第四十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日選擇育種方法時綜合考慮的因素

(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)；

(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認(rèn)識的明了程度；

(3)經(jīng)濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。第四十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日工業(yè)菌種改良方法(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。

(2)增加前體物的濃度。

(3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。第四十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。(5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。第四十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

提高特定基因的表達(dá)水平(1)引入強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號，可通過在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號，提高基因效力等。(2)誘導(dǎo)解除基因表達(dá)抑制的突變。第四十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

改進(jìn)菌種的生長效率提高菌株對底物的利用率方法：

a.通過確定并改變代謝中的耗能部分;b.由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來實現(xiàn)。

c.賦予菌種對多種底物，特別是價廉而豐富的底物的利用能力，由此可降低操作費用。第四十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第四節(jié)誘變育種以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。第四十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法第四十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

一、誘變劑和誘變處理

物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險性。第五十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。

第五十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射±行工作時，設(shè)備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當(dāng)心。第五十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日誘變劑的選擇1．堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。第五十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日3．吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4．紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。第五十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選第五十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(一)出發(fā)菌株的選擇1．自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達(dá)到好的效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4．出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。第五十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。

6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細(xì)胞，就要選對數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。第五十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

(二)處理菌懸液的制備這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。第五十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(三)誘變處理

根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。第五十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

(四)中間培養(yǎng)

由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。第六十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

方法：讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細(xì)胞繁殖幾代，以得到純的變異細(xì)胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。第六十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(五)分離和篩選篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.

例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。第六十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。第六十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。第六十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第五節(jié)營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。第六十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。第六十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日營養(yǎng)缺陷型的用途

營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。第六十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜第六十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日一、誘變方法物理誘變化學(xué)誘變第六十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。第七十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

三、檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。具體方法：影印法、點種法、夾層法第七十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日1．將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。3．將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。

(一)影印法第七十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日4．將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5．二平皿相同方位進(jìn)行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。第七十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

(二)點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結(jié)果明確，但工作量大。第七十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

(三)夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。第七十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定

驗證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長譜測定。第七十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日生長譜測定的方法將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5～6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)?！獋€平皿測一個菌。第七十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在5～6個平皿上可測20株菌以上。第七十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第六節(jié)基因育種基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過細(xì)胞間的相互作用，使一個細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個細(xì)胞的方法。第七十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第七節(jié)原生質(zhì)體育種

原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。第八十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑

(1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。(2)對已知微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾。(3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

(4)通過原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。(5)DNA重組技術(shù)。第八節(jié)篩選新的代謝產(chǎn)物

第八十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物的程序

第八十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日突變型菌株的篩選

一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選第八十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo)

篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)；篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質(zhì)；研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑；尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物；篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒、長效的化學(xué)藥物等。

第八十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法

(一)直接方法為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途，在體外試驗測得活性后，可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體，觀察被測樣品的療效。這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動物體內(nèi)治療試驗。第八十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第八十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(二)間接方法篩選醫(yī)用抗生素，可用細(xì)茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質(zhì)。在預(yù)篩選時，多用瓊脂平扳擴散抑菌法。通過預(yù)篩選，直接測定最初分離物的生物活性，能加速篩選過程。

第八十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日

五、檢測系統(tǒng)

篩選過程的成功依賴于排除那些已知的或并非需要的代謝產(chǎn)物的檢驗方法，這樣才能識別出人們需要的化合物。第八十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日性能簽別

性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作。鑒別可分為兩方面：

①對微生物方面進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功能答試驗觀察，并確定微生物產(chǎn)生菌的類群；②從化學(xué)的早期鑒別來鑒別微生物的代謝產(chǎn)物?；瘜W(xué)的早期鑒別一般對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗茵譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗，井獲得各種圖譜，與已知圖譜進(jìn)行比較鑒別。

第八十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日如果認(rèn)為是有實用前途的代謝產(chǎn)物，則要進(jìn)一步大量培養(yǎng)，并進(jìn)行動物試驗、毒性考查、藥物代謝等實驗，并進(jìn)行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作，以備投入生產(chǎn)。如果是新的代謝產(chǎn)物．一般要進(jìn)一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，井在此基礎(chǔ)上進(jìn)行合成法的研究或進(jìn)行化學(xué)改造，研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系，并對作用機制、生物合成過程作進(jìn)一步的研究。第九十頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日第十節(jié)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。第九十一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1)

經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2)

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。第九十二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)冷凍干燥或真空干燥保藏；

(2)超低溫或在液氮中冷凍保藏；

(3)

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?/p>

(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。第九十三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日2.1

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20℃以下，同時應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。第九十四頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日冷凍保藏種類

一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術(shù)

第九十五頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。第九十六頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。第九十七頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。一般方法：1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。第九十八頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日三、液氮冷凍保藏技術(shù)

(一)冷凍保護劑

在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

第九十九頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，

第一百頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。第一百零一頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(通常為-30℃)；(4)補加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點時盡可能快地發(fā)生相變；第一百零二頁，共一百一十三頁，2022年，8月28日(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。第一百零三頁，共一百一十三頁，2022年，8月28