中華鱘外周血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯微觀察,漁業(yè)論文

中華鱘外周血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的顯微觀察,漁業(yè)論文血細(xì)胞是魚類機(jī)體免疫的重要組成部分，對維持魚類機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用，其部分參數(shù)可反映魚類的健康狀況[1].國內(nèi)外有很多關(guān)于魚類血細(xì)胞形態(tài)構(gòu)造的研究[2~9].中華鱘〔Acipensersinensis〕從屬鱘形目〔Acipenseriformes〕鱘科〔Acipenseridae〕鱘屬〔Aci-penser〕，主要分布在長江流域，是典型的溯河洄游魚類。由于過度捕撈、葛洲壩等水利工程建設(shè)、江上作業(yè)和水域污染等原因，中華鱘野生種群數(shù)量急劇下降，1988年中華鱘被列為國家一級(jí)保衛(wèi)動(dòng)物[10].當(dāng)前有關(guān)中華鱘的研究報(bào)道主要集中在人工繁衍、行為學(xué)、生理生化等方面的研究[11~13],但是專門對中華鱘外周血細(xì)胞形態(tài)構(gòu)造的研究比擬少。本研究對中華鱘血細(xì)胞的顯微構(gòu)造進(jìn)行觀察，旨在為中華鱘血液學(xué)、疾病診斷的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料與方式方法1.1試驗(yàn)材料選取4尾養(yǎng)殖中華鱘進(jìn)行血液樣品采集。實(shí)驗(yàn)魚健康狀況良好，均為雌性，體長162~182cm,體重20.7~36.7kg.1.2試驗(yàn)方式方法1.2.1采血方式方法用帆布擔(dān)架撈取實(shí)驗(yàn)魚后，腹部朝上，鰓部供水。擦去臀鰭后的水分，用5mL一次性注射器自尾鰭基部下方的尾靜脈抽取靜脈血2mL,迅速將血液注入附有EDTA-K2的抗凝管中，顛倒180度5~8次混勻后，放入4℃冷藏箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室待測。1.2.2紅細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)按林浩然[14]的方式方法進(jìn)行。1.2.3白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和各類血細(xì)胞大小測量抗凝血在干凈載玻片上涂片，晾干，用瑞氏-吉姆薩染液聯(lián)合染色。在Leica顯微鏡油鏡下進(jìn)行血細(xì)胞觀察、測量細(xì)胞大小，用南京倍寧醫(yī)學(xué)病理成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照。每尾實(shí)驗(yàn)魚制作2張血涂片，每張涂片上計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞，對1600個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。在測量細(xì)胞大小時(shí)，除數(shù)量極少的嗜酸性粒細(xì)胞外，其余各種血細(xì)胞大小取50次測量平均值。1.3數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，結(jié)果均以平均值標(biāo)準(zhǔn)差〔MeanSD〕表示；照片用Photo-shop7.0進(jìn)行處理，同比例縮放圖像和標(biāo)尺。2結(jié)果與分析2.1中華鱘外周血細(xì)胞的顯微形態(tài)構(gòu)造通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，中華鱘血涂片中紅細(xì)胞的數(shù)量最多，白細(xì)胞數(shù)量較少且單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)聚集分散在紅細(xì)胞之間。白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、血栓細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，未觀察到嗜堿性粒細(xì)胞。2.1.1紅細(xì)胞〔erythrocyte〕紅細(xì)胞呈橢圓或卵圓形，外表光滑；細(xì)胞核形狀與細(xì)胞形狀類似，位于細(xì)胞，少數(shù)略偏位，細(xì)胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)疏松，被染成紫紅色，無核仁，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色。部分血涂片染色經(jīng)過中環(huán)境偏堿性，細(xì)胞呈灰藍(lán)色。除此之外，還觀察到紅細(xì)胞裂解后構(gòu)成的核影,被染成粉紅色〔圖1〔a〕〕。2.1.2淋巴細(xì)胞〔lymphocyte〕淋巴細(xì)胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，占據(jù)多半細(xì)胞空間。細(xì)胞質(zhì)較少，有的呈一薄層包裹細(xì)胞核，有的向外伸出構(gòu)成明顯的偽足突起〔圖1〔b〕〕，有的不可見，細(xì)胞近似裸核〔圖1〔b〕〕。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密呈塊狀，被染成深紫色，細(xì)胞質(zhì)被染成淺藍(lán)色。2.1.3血栓細(xì)胞〔thrombocyte〕血栓細(xì)胞呈長桿形〔圖1〔c〕、〔d〕、〔e〕〕、圓形〔圖1〔c〕〕或橢圓形，外表光滑。細(xì)胞核呈長桿形、橢圓形或腎形等，位于細(xì)胞，少數(shù)偏位，細(xì)胞質(zhì)較少，僅一薄層包裹細(xì)胞核；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密，被染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)染色較淡，呈粉紅色，血栓細(xì)胞在血涂片中常見到單個(gè)或數(shù)個(gè)聚集在一起出現(xiàn)〔圖1〔d〕〕。2.1.4單核細(xì)胞〔monocyte〕單核細(xì)胞呈橢圓形、圓形或不規(guī)則形。細(xì)胞核形狀多種多樣，包括圓形、橢圓形、腎形或馬蹄形等，常偏于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)較豐富；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)疏松，被染成紫紅色，無核仁，細(xì)胞質(zhì)被染成灰藍(lán)色，染色不均勻且含有空泡〔圖1〔e〕、〔f〕〕。在顯微鏡下，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有時(shí)難以區(qū)分，前者染色質(zhì)疏松不勻，細(xì)胞質(zhì)染色灰藍(lán)色，朦朧模糊，而后者染色質(zhì)致密呈塊，染色質(zhì)淺藍(lán)色，清楚明晰透明〔圖1〔f〕〕。2.1.5嗜中性粒細(xì)胞〔neutrophil〕嗜中性粒細(xì)胞呈圓形、卵圓形〔圖1〔g〕〕或不規(guī)則形〔圖1〔h〕〕等，細(xì)胞核為腎形、馬蹄形或分葉形等，常偏于細(xì)胞一側(cè)與細(xì)胞膜相切，細(xì)胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)疏松，被染成紫紅色，無核仁，細(xì)胞質(zhì)染色較淺，呈淡粉紅色，有的甚至是無色。2.1.6嗜酸性粒細(xì)胞〔eosinophil〕嗜酸性粒細(xì)胞呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核為腎形或分葉形等，常偏于細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)豐富。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密，被染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)中充滿了均勻飽滿的嗜酸性顆粒，被染成橘紅色。在血涂片中偶然見到，數(shù)量極少。2.2白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和各類血細(xì)胞大小測定==中華鱘白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和各類血細(xì)胞大小測定結(jié)果見表1.從表1中能夠看出，在細(xì)胞數(shù)量上，中華鱘白細(xì)胞中以血栓細(xì)胞數(shù)量最多，占白細(xì)胞總數(shù)48.56%;其次是淋巴細(xì)胞，占白細(xì)胞總數(shù)32.44%;嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分別占10.25%和8.38%;嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量最少，僅占白細(xì)胞總數(shù)0.37%,極為少見。在細(xì)胞大小上，中華鱘白細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞的體積最大，其細(xì)胞大小為〔20.291.62〕m〔16.072.89〕細(xì)胞核大小為〔16.321.54〕m〔12.342.27〕淋巴細(xì)胞的體積最小，其細(xì)胞大小為〔9.742.65〕m〔7.200.97〕細(xì)胞核大小為〔8.341.24〕m〔6.830.74〕m.紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為〔4.820.15〕1011個(gè)/L.【1】3討論3.1中華鱘血細(xì)胞組成中華鱘外周血中紅細(xì)胞數(shù)量占大多數(shù)，白細(xì)胞數(shù)量較少。林光華等[15]以為淡水養(yǎng)殖魚類血液白細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，但在中華鱘白細(xì)胞中，血栓細(xì)胞數(shù)量最多，這與美國紅魚〔Sciaenopsocel-latus〕[16]、淡水石斑〔Cichlasomamanaguense〕[17]、軍曹魚〔Rachycentroncanadum〕[2]、長鰭裸頰鯛〔Lethrinuserythropterus〕[5]、切尾擬鲿〔Pseudobagrustruncatus〕[4]、小點(diǎn)貓鯊〔Scyliorhinuscanicu-la〕[8]、澳洲黑鯛〔Acanthopagrusaustralis〕[7]等一樣。嗜酸性粒細(xì)胞最少，這與稀有白甲魚〔Onych-ostomarara〕[6]、淡水石斑[17]、切尾擬鲿[4]等情況類似。粒細(xì)胞中，嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞均存在，但并未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞，這與稀有白甲魚[6]、淡水石斑[17]、華鯪〔Sinilabeorendahli〕[18]、切尾擬鲿[4]等結(jié)果一致；但美國紅魚[16]、犬牙韁蝦虎魚〔Amoyacaninus〕[3]、斑點(diǎn)叉尾鮰〔Ietaluruspune-taus〕[19]、長鰭裸頰鯛[5]的外周血液中均發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞。Watson等[20]以為嗜堿性粒細(xì)胞在制片經(jīng)過中極易解體，很難觀察到。林光華等[21]則發(fā)現(xiàn)草魚〔Ctenopharyngodonidellus〕嗜堿性粒細(xì)胞只在幼齡魚魚種出現(xiàn)，在成年魚外周血液中沒有。周玉等[22]指出魚類白細(xì)胞分類存在種間差異。本研究中未發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞，可能是實(shí)驗(yàn)經(jīng)過中導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞解體，可以能是由于實(shí)驗(yàn)魚不是幼魚，或者中華鱘血液中沒有嗜堿性粒細(xì)胞，詳細(xì)原因需進(jìn)一步研究。3.2中華鱘與其他鱘魚的血細(xì)胞特征比擬中華鱘的外周血液中發(fā)現(xiàn)了嗜酸性粒細(xì)胞，并未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞，這與達(dá)氏鰉〔Husodauri-cus〕[23]、高首鱘〔Acipensertransmontanus〕[19]研究結(jié)果一致；但是在史氏鱘〔Acipenserschrenckii〕[24]研究中，發(fā)現(xiàn)其血細(xì)胞中有嗜堿性粒細(xì)胞，沒有嗜酸性粒細(xì)胞。中華鱘血細(xì)胞中，嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞體積較大，淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞較小，與達(dá)氏鰉研究結(jié)果一致，但是中華鱘外周血細(xì)胞數(shù)量少于達(dá)氏鰉，中華鱘血細(xì)胞體積大于達(dá)氏鰉，這可能跟2種鱘魚的年齡、生活環(huán)境等有關(guān)。本研究在白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)時(shí)將血栓細(xì)胞歸為白細(xì)胞，而在達(dá)氏鰉[23]、史氏鱘[24]的研究中并未將血栓細(xì)胞歸為白細(xì)胞；作者在光鏡下發(fā)現(xiàn)中華鱘淋巴細(xì)胞大小、著色及形態(tài)特征均無明顯差異，將其歸為一類細(xì)胞；章龍珍等[24]也沒有對史氏鱘的淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類，但是周玉等[23]通過電鏡對淋巴細(xì)胞內(nèi)的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核孔和核周隙的觀察，將達(dá)氏鰉的淋巴細(xì)胞分為大小2類。因而，中華鱘和達(dá)氏鰉、史氏鱘的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果不便比擬。魚類白細(xì)胞分類仍然有很大爭議。在軍曹魚[2]、犬牙韁蝦虎魚[3]、切尾擬鲿[4]等魚類研究中，血栓細(xì)胞都?xì)w為白細(xì)胞一類；而林光華等[15]將鰱〔Hypophthalmichthysmolitrix〕、鳙〔Aristichthysnobi-lis〕的血栓細(xì)胞劃分到白細(xì)胞系以外。除血栓細(xì)胞的歸屬，淋巴細(xì)胞的分類也不一樣。很多學(xué)者[3~5]將淋巴細(xì)胞分成大小2類；Barber等[25]以為淋巴細(xì)胞體積是連續(xù)變化的，不能用大、小來界定；Ellis[26]也以為不同大小的淋巴細(xì)胞可能是同一種細(xì)胞的不同功能狀態(tài)。作者認(rèn)同周玉等的觀點(diǎn)，對于魚類白細(xì)胞的分類應(yīng)采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，便于學(xué)術(shù)溝通。3.3中華鱘血細(xì)胞特征與其生態(tài)適應(yīng)性紅細(xì)胞是魚體內(nèi)運(yùn)輸氧氣的主要媒介。林浩然[27]指出魚類運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)弱與其紅細(xì)胞數(shù)量和大小有關(guān)；楊嚴(yán)鷗等[28]也以為紅細(xì)胞數(shù)量由大到小的順序與魚類運(yùn)動(dòng)水平由高到底的順序是一致的。中華鱘紅細(xì)胞與常見的白鰱、鳙、草魚、鯉魚〔Cyprinuscarpio〕等鯉科魚類紅細(xì)胞相比，數(shù)量要少，體積要大，講明中華鱘游泳能力比上述鯉科魚類要弱；這與蔡露[29]在研究4種鱘科魚類游泳能力時(shí)得出的結(jié)果一致。中華鱘的紅細(xì)胞特征可能是其適宜在水流速度較慢的水底生活，以一些行動(dòng)延遲緩慢的底棲動(dòng)物為食的原因。魚類血栓細(xì)胞具有凝血功能，淋巴細(xì)胞是魚類機(jī)體免疫的重要組成部分。中華鱘的白細(xì)胞是以血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主體的系統(tǒng)，兩者占白細(xì)胞總數(shù)的81%;這可以能與中華鱘是大型溯河洄游性魚類，在礫石底質(zhì)的江段產(chǎn)卵有關(guān)。遠(yuǎn)距離運(yùn)動(dòng)和產(chǎn)卵經(jīng)過中容易受傷，白細(xì)胞以血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主體的系統(tǒng)，能夠使得中華鱘在受傷后快速凝血，并將侵入體內(nèi)的病原殺死，構(gòu)成免疫保衛(wèi)。[以下為參考文獻(xiàn)][1]趙維信.魚類生理學(xué)[M].北京：高等教育出版社，1999.[2]陳剛，周暉，張建東，等.軍曹魚血液指標(biāo)及血細(xì)胞發(fā)生的觀察[J].水生生物學(xué)報(bào)，2005,29〔5〕:564~570.[3]葉寧，羅杰，曹