核磁共振新技術(shù)

核磁共振新技術(shù)及其應(yīng)用

核磁共振概述核磁共振新技術(shù)及應(yīng)用概述

核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段，由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品，并具有迅速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而得以迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，已經(jīng)從物理學(xué)滲透到化學(xué)、生物、地質(zhì)、醫(yī)療以及材料等學(xué)科，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大作用。核磁共振是1946年由美國斯坦福大學(xué)布洛赫(F.Bloch)和哈佛大學(xué)珀賽爾(E.M.Purcell)各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的，兩人因此獲得1952年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。50多年來，核磁共振已形成為一門有完整理論的新學(xué)科。12位因?qū)舜殴舱竦慕艹鲐暙I(xiàn)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)科學(xué)家

1944年I.Rabi1952年F.Block1952年E.M.Purcell1955年W.E.Lamb1955年P(guān).Kusch1964年C.H.Townes1966年A.Kastler1977年J.H.VanVleck1981年

N.Bloembergen1983年H.Taube1989年N.F.Ramsey1991年R.R.Ernst核磁共振原理

半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生一小磁場(chǎng)。當(dāng)加一外磁場(chǎng)，這些原子核的能級(jí)將分裂，既塞曼效應(yīng)。在外磁場(chǎng)B0中塞曼分裂圖：共振條件：

=0=0

實(shí)現(xiàn)核磁共振的兩種方法a．掃場(chǎng)法:改變0b．掃頻法:改變核磁共振新技術(shù)

核磁雙共振

二維核磁共振

NMR成像技術(shù)極化轉(zhuǎn)移技術(shù)魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)

高效液相色譜與核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）核磁雙共振

雙核自旋系統(tǒng)檢測(cè)器2擾動(dòng)1脈沖雙共振是同時(shí)用兩種頻率的射頻場(chǎng)作用在兩種核組成的系統(tǒng)上，第一射頻場(chǎng)B1使某種核共振，第二射頻場(chǎng)B2使另外一種核共振，這樣兩個(gè)原子核同時(shí)發(fā)生共振。

第二射頻場(chǎng)為干擾場(chǎng)，通常用一個(gè)強(qiáng)射頻場(chǎng)干擾圖譜中某條譜線，另一個(gè)射頻場(chǎng)觀察其他譜線的強(qiáng)度、形狀和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化，從而確定各條譜線之間的關(guān)系，區(qū)分相互重疊的譜線。二維核磁共振及多維核磁共振

二維核磁共振使NMR技術(shù)產(chǎn)生了一次革命性的變化，它將擠在一維譜中的譜線在二維空間展開（二維譜）,從而較清晰地提供了更多的信息。

NMR成像技術(shù)投影重建成像方法Fourier成像方法弛豫時(shí)間成像方法逐點(diǎn)掃描方法線掃描方法切片掃描方法高分率成像和快速成像法極化轉(zhuǎn)移技術(shù)靈敏核

非靈敏核檢測(cè)（非靈敏核）J脈沖序列1脈沖序列2

極化轉(zhuǎn)移(PT)是一種非常實(shí)技術(shù)，它用二種特殊的脈沖序列分別作用于非靈敏核和靈敏核兩種不同的自旋體系上。通過兩體系間極化強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移，從而提高非靈敏核的觀測(cè)靈敏度，基本的技巧是從高靈敏度的富核處“借”到了極化強(qiáng)度。在NMR測(cè)定中，為取得高質(zhì)量的譜圖，要求磁場(chǎng)均勻，樣品的填充因子高，磁化率均勻，前兩個(gè)因素可以通過硬件研制不斷改善，而磁化率均勻與否則與樣品性質(zhì)、數(shù)量及周圍環(huán)境直接相關(guān)，這樣，當(dāng)樣品量有限時(shí),就必須考慮磁化率的均勻性。

1982年，魔角旋轉(zhuǎn)（MAS）開始用于高分辨工作，此后，將MAS用于小體積微量樣品引起了興趣，實(shí)驗(yàn)表明運(yùn)用MAS可以消除固體及非均相溶液中磁化率不同而造成的譜線加寬。樣品應(yīng)以相當(dāng)或大于1.8kHz轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)，可使邊帶得到有效抑制，根據(jù)這些結(jié)果，成功地設(shè)計(jì)了新型的超微量探頭。

超微量探頭的發(fā)展概況

魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)

在固體中自旋之間的耦合較強(qiáng)，共振譜較寬，掩蓋了其他精細(xì)的譜線結(jié)構(gòu)，耦合能大小與核的相對(duì)位置在磁場(chǎng)中的取向有關(guān)，其因子是(3cos2β-1)，如果有一種方法使β=θ=54.440（魔角），則3cosβ-1=0，相互作用減小，達(dá)到了窄化譜線的目的。魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)就是通過樣品的旋轉(zhuǎn)來達(dá)到減小相互作用的，當(dāng)樣品高速旋轉(zhuǎn)時(shí)β與θ的差別就會(huì)平均掉。

90年代中，一種與常規(guī)高分辨液相探頭設(shè)計(jì)完全不同的超微量探頭（目前稱之為NanoNMRProbe，下同）問世了，這種探頭與常規(guī)固體高分辨探頭也不盡相同，后者為高功率，高速魔角旋轉(zhuǎn)用于消除化學(xué)位移各向異性和使偶極偶合平均化，對(duì)于磁化率的不連續(xù)性是不考慮的。另外，常規(guī)MAS探頭對(duì)線寬要求僅為5Hz（甚至50Hz），而1H微量探頭因?yàn)?H核本身總的譜寬窄，要求線寬＜0.5Hz（CDCl3在丙酮-d6）中，特殊設(shè)計(jì)的NanoNMRprobe，其成功之處在于將體積很小的樣品（＜40μL），能100%地保持在檢測(cè)線圈內(nèi)，并確保填充因子高，和均勻的磁化率，以得到最高靈敏度，構(gòu)成探頭的物料也必須使磁化率的不連續(xù)性達(dá)到最小，才能達(dá)到最小的線寬。NanoNMRProbe超微量探頭的結(jié)構(gòu)原理

NanoNMRProbe內(nèi)腔長28mm，魔角（54.7°），轉(zhuǎn)速在1.5~2.0kHz之間，為保持長期穩(wěn)定性，帶有2H鎖線圈，并有變溫功能，探頭種類有直接檢測(cè)用的1H和13C{1H}和間接檢測(cè)用的1H{13C}探頭，樣品體積最大為40μL，可取得線形好，靈敏度高和分辨率最佳的譜圖，若樣品量很少，溶劑量可相應(yīng)減少，保持樣品有一定濃度，溶劑雜質(zhì)及偽峰不會(huì)增加，還可提高動(dòng)態(tài)范圍，只要氘代試劑的量能保證場(chǎng)一頻聯(lián)鎖，即使樣品溶液體積未充滿整個(gè)樣品管（40μl），也不會(huì)使勻場(chǎng)變壞，或使譜線變寬，確保取得高質(zhì)量的譜圖。NanoNMRProbe的應(yīng)用1、超微量樣品的測(cè)定樣品量不同的薄荷醇,分別為為40μg，4μg和400ng，溶于CD2C12中,采樣次數(shù)分別為4次,400次和32240次.2、Nano探頭在組合化學(xué)中的應(yīng)用組合化學(xué)是近二十年發(fā)展起來的一種快速合成與篩選大量化合物的新方法，其在發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化藥物先導(dǎo)化合物的過程中發(fā)揮了重要作用。組合化學(xué)包括了組合合成、群集篩選和對(duì)感興趣化合物結(jié)構(gòu)解析的三大步驟。因而有“平行”合成技術(shù)、“混-分”合成技術(shù)、編碼-解碼技術(shù)、“一珠一化合物”技術(shù)、“位置掃描”技術(shù)、天然寡聚物的生物組合合成及篩選技術(shù)、“動(dòng)態(tài)化學(xué)庫”技術(shù)、“多樣性”導(dǎo)向的組合合成技術(shù)、“Microarray”技術(shù)、組合配基裝配、“非天然”天然組合化學(xué)庫合成技術(shù)等等。在多種合成方法中，“一珠一化合物”技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)庫的空間可分離性，亦即化學(xué)庫中所有的化合物同時(shí)并存且相互獨(dú)立，因而，這種樹脂珠-化學(xué)庫的方式可直接用于固相篩選法。利用該技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)迅速合成并篩選的化合物可以達(dá)到幾千萬這樣的天文數(shù)字，大大加快了發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)化合物的步伐。但是在產(chǎn)物分析中，由于樹脂引起磁場(chǎng)的不均勻，常規(guī)的NMR技術(shù)受到了限制。較早的做法是將反應(yīng)的中間體或最終產(chǎn)物從樹脂上切落下來，再利用常規(guī)方法進(jìn)行分析和鑒定。這種方法費(fèi)時(shí)，費(fèi)樣，而且經(jīng)常破壞化合物的結(jié)構(gòu)，得出錯(cuò)誤的信息。九十年代初發(fā)展的高分辨魔角核磁共振技術(shù)(Highresolutionmagicanglespinning(HR/MAS)NMR)可以克服樹脂引起的磁場(chǎng)不均勻性,得到最高靈敏度和最小線寬的NMR譜圖。該技術(shù)不破壞樣品，可靈敏、直接地提供偶聯(lián)在樹脂上化合物的結(jié)構(gòu)信息。

頂部譜圖用常規(guī)5mm液體高分辨探頭91．1mg干樹脂，掃描一次中部譜圖：用常規(guī)5rnm固體CP／MAS探頭，樹脂樣品為20.2mg．轉(zhuǎn)速為3.8kHz，掃描8次底部譜圖：用Nano探頭，樹脂用量僅為5.4mg，魔角轉(zhuǎn)速為2kHz，掃描8次目前，廣泛用于監(jiān)測(cè)固相合成反應(yīng)；指導(dǎo)反應(yīng)條件的優(yōu)化;鑒定固載在單一樹脂珠上化合物的結(jié)構(gòu)；以及分析樹脂上固載化合物的構(gòu)象等等。高分辨魔角核磁共振是組合化學(xué)中有用的分析工具，可以跟蹤固相有機(jī)合成反應(yīng)，快速直接地提供連在樹脂上的化合物的結(jié)構(gòu)信息，指導(dǎo)反應(yīng)條件的優(yōu)化，它能直接簡便地定量反應(yīng)的產(chǎn)率，而這種分析方法恰恰在常規(guī)NMR中很難實(shí)現(xiàn)。高效液相色譜與核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）1、LC-NMR技術(shù)發(fā)展概況①NMR譜儀的靈敏度較低；

②系統(tǒng)無法應(yīng)付較大的動(dòng)力學(xué)范圍；③流動(dòng)檢測(cè)池和探頭沒有商品化以及溶劑峰壓制效果不理想。

2、LC-NMR聯(lián)用技術(shù)的軟硬件及原理1）計(jì)算機(jī)軟件支持

2）LC-NMR聯(lián)用的相關(guān)硬件

a.NMR流動(dòng)探頭

b.HPLC系統(tǒng)

c.峰敏技術(shù)

d.在線/離線組份收集器

3、技術(shù)問題及解決措施

動(dòng)力學(xué)范圍不夠?qū)捝V分辨率的喪失HPLC-NMR通信NMR靈敏度解決方法：1）流速、檢測(cè)池及探頭2）溶劑峰壓制

不同的溶劑峰壓制技術(shù)大都是基于化學(xué)位移和馳豫時(shí)間的不同而設(shè)計(jì)的，理想的峰壓制技術(shù)應(yīng)滿足以下幾點(diǎn)要求：（1）消除溶劑峰而不干擾所要的信號(hào)（2）不影響峰壓制區(qū)域以外的信號(hào)強(qiáng)度（3）能同時(shí)壓制多個(gè)溶劑峰（4）易于實(shí)現(xiàn)以避免損失測(cè)試信號(hào)（5）在梯度HPLC體系中能跟隨溶劑信號(hào)位置改變而改變

WET序列，已經(jīng)可以成功地完成HPLC-NMR中使用普通試劑而必需的峰壓制4、LC-NMR的操作模式及其應(yīng)用1）操作模式

a連續(xù)流動(dòng)：在洗脫過程中，溶劑組成不斷變化，給峰壓制造成一定困難，另外樣品停留時(shí)間短，靈敏度低，一般只適用于1H和19F測(cè)試。

b停止流動(dòng)：顧名思義即使溶液停留于檢測(cè)池中進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)組分的保留時(shí)間已知，或者HPLC-NMR采用靈敏的在線檢測(cè)器時(shí)，可以采用這種方法。

c分時(shí)止流：按一定的時(shí)間間隔暫停流動(dòng)相，來檢測(cè)NMR譜。這種方法在被檢組分沒有UV發(fā)色團(tuán)時(shí)尤其適用。通過HPLC-NMR譜，也可以估計(jì)色譜峰的純度。d收集分析：色譜洗脫峰被預(yù)先收集到一個(gè)樣品池中，然后進(jìn)行離線NMR檢測(cè)。e紫外激發(fā)：這種方法主要是利用軟件技術(shù)，在UV檢測(cè)到組分峰時(shí)，經(jīng)過計(jì)算將樣品組分準(zhǔn)確地滯留于檢測(cè)池中，并通過NMR進(jìn)行采樣。

2）應(yīng)用范圍

a在藥物代謝研究中應(yīng)用

b食品化學(xué)

c高聚物分析

d在天然產(chǎn)物化學(xué)中的作用

e環(huán)境化學(xué)中的應(yīng)用藤黃酸大鼠膽汁代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證研究藤黃酸是從中藥藤黃中分離得到的化合物，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥物有所區(qū)別，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，藤黃酸對(duì)多種腫瘤顯示較強(qiáng)的抗腫瘤活性，并在有效計(jì)量范圍內(nèi)毒副作用比較小，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制有非常高的選擇性，能選擇性的殺死癌細(xì)胞，而對(duì)正常動(dòng)物造血系統(tǒng)和免疫功能沒有影響，這是目前腫瘤化療藥物所不具備的。藥代動(dòng)力學(xué)研究已顯示，藤黃酸在腫瘤組織中有較高的分布和較長的持續(xù)時(shí)間。

藤黃酸HPLC分析的色譜條件

色譜柱為InertsilODS柱，5μm(150×4.6mm)；柱溫30℃；流動(dòng)相為乙腈-水-醋酸(85：15：1)，流速1.0ml/min，280nm檢測(cè)。A空白膽汁色譜圖BII代謝物分析色譜圖CI相代謝物分析色譜圖D藤黃酸色譜圖藤黃酸在大鼠膽汁中可檢測(cè)到2個(gè)主要代謝產(chǎn)物，即代謝物1（MT1，Rt=17.996min）和代謝物2（MT2,Rt=19.557min）。LC-NMR的分析條件采用Varian公司的Prostar-230高效液相色譜儀，分析柱為InertsilODS-3柱(150×4.6mm)。流動(dòng)相為D2O:CH3OH=85:15。流速為1ml/min，檢測(cè)器為VarianProstar-330二極管陣列檢測(cè)器，紫外檢測(cè)波長為280nm。將服藥膽汁樣品溶于200μl甲醇和水的混合溶劑中。在INOVA-500LC-NMR上，用停止流動(dòng)的方法分別采集LC-1HNMR譜。進(jìn)樣量為25μl，采用WET方式壓制溶劑峰。譜寬7500Hz，1H譜采樣時(shí)間為1.5s，馳豫時(shí)間為1s，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)16K，累加次數(shù)為256。

MS圖譜MT1的ESI-MS給出[M-1]-為m/z645，故其分子量為646，與藤黃酸（628）相比，質(zhì)量數(shù)多18，可能為藤黃酸的羥基化物。代謝產(chǎn)物2的LC-MS譜給出MT2的[M-H]-峰為m/z643，故其分子量為644。比藤黃酸質(zhì)量數(shù)(628)多16。MT1(上圖)，MT2(中圖)和藤黃酸(下圖)LC-1HNMR低場(chǎng)區(qū)信號(hào)比較代謝物1(MT1)的結(jié)構(gòu)分析

（1）高場(chǎng)區(qū)：MT1的1H-NMR譜高場(chǎng)區(qū)示有多個(gè)甲基信號(hào)(δ1.73(6H,s),1.66,1.65,1.63,1.56,1.36,1.35(each3H,s))，與藤黃酸類化合物的1HNMR譜特征相符。（2）低場(chǎng)區(qū)藤黃酸的10位烯質(zhì)子的信號(hào)(7.56(1H,d,J=6.9Hz))在MT1的1HNMR譜中消失，而MT1在δ4.65(1H,br.d,J=4.0Hz)處顯示一個(gè)含氧取代基的偕位質(zhì)子信號(hào)，據(jù)此推斷MT1為藤黃酸的10位羥基化產(chǎn)物。

(3)MT1氫譜的低場(chǎng)區(qū)的27,32,37-H的信號(hào)也與藤黃酸有明顯不同，藤黃酸中27-H(δ5.96(1H,t,J1=J2=7.2Hz))的信號(hào)在MT1中向低場(chǎng)位移至δ6.52(1H,t,J1=J2=7.2Hz)，而原本重疊在一起的32,37-H(δ5.25(2H,m))也分成為兩個(gè)多重峰（δ5.05and5.25(each1H,m)。這與10位有含氧取代基的化合物的氫譜特征相吻合（見表3-1），故斷定MT1為10-羥基-藤黃酸。代謝物2(MT2)的結(jié)構(gòu)分析

MT2的LC-1HNMR譜符合藤黃酸類化合物的氫譜特征。在其氫譜上，δ7.4左右沒有雙峰出現(xiàn)，因此藤黃酸結(jié)構(gòu)中的?9，在MT2的結(jié)構(gòu)中消失。MT2的氫譜上在4.4ppm出現(xiàn)一個(gè)質(zhì)子的d峰信號(hào)，偶合常數(shù)約為4Hz,這與MT1的10-H信號(hào)非常相似，因此判斷MT2的10位亦存在含氧取代基。由于MT2僅比藤黃酸多一個(gè)氧，因此推測(cè)MT2可能為藤黃酸的9,10-環(huán)氧衍生物.

藤黃酸MT1MT210-甲氧基藤黃酸在景洪哥納香提取混合物中的應(yīng)用研究景洪哥納香(Groniothalamus．Cheliensis)為番茄科哥納香屬植物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，哥納香屬植物中富含苯乙稀比喃類化合物，該類化合物具有抗癌用．目前已從自然界中分離得到70余種該類化合物。儀器及實(shí)驗(yàn)條件

景哥洪納香(20kg)用95％的酒精提取3次，所得浸膏(1300g)在索式提取器中，先后用石油醚，氯仿、乙酸乙酯萃?。确虏糠?315g)用硅膠柱層析，以CHCL3：乙酸乙酯梯度洗脫，得到105mg混合物．采用Varian公司的Prostar一230高效液相色譜儀，分析柱為InertsilODS一3柱(250×46mm)．流動(dòng)相為D2O，CH2CN，采用梯度洗脫，0～1min時(shí)其洗脫比例為D2O：CH3CN=68：32，逐漸增加乙腈的比例至25min時(shí)達(dá)到D2O：CH3CN=40：60，至45min時(shí)達(dá)到D2O：CH3CN=20：60．流速為1mL／min，檢測(cè)器為VarianProstar一330二極管振列檢測(cè)器，紫外檢測(cè)波長為254nm將5mg混合物樣品溶于200μL乙腈和水的混合溶劑中結(jié)果與討論苯乙稀吡喃類化合物在δ6.00～7.00為雙鍵上的稀質(zhì)子，δ4.00～5.00為環(huán)上連氧環(huán)質(zhì)子，δ7.00～7.80為單取代的苯質(zhì)子．通過對(duì)HPLC-NMR得到的HNMR譜分析,得到各譜均符合苯乙稀吡喃類化合物的特征．4，5，6色譜峰有兩套雙鍵上的稀質(zhì)子信號(hào)，如果為雙倍體，每對(duì)δ6.00～7.00雙鍵上的稀質(zhì)子比例應(yīng)相同，但現(xiàn)在比例不同，4，5，6色譜峰的HNMR譜為混合物HNMR．其中5號(hào)色譜蜂HNMR譜有兩套雙鍵上的稀質(zhì)子信號(hào)δ7.033，δ6.080和δ7．033，6．210;兩套乙酰基取代質(zhì)子5．492，5．370，10個(gè)苯質(zhì)子δ7.00～7.80兩套,δ4.00～5.00有2個(gè)質(zhì)子,也是兩套.這兩套質(zhì)子比例均為2:1.，認(rèn)為該結(jié)構(gòu)為哥納香三醇或類似物6號(hào)峰HNMR譜中含有5號(hào)峰所有信號(hào)及另一套雙鍵上的稀質(zhì)子信號(hào)δ7．033．6．080，δ5．734有一個(gè)質(zhì)子信號(hào)．二者比例為1：4．因此認(rèn)為該物質(zhì)可能為苯乙烯或類似物.．4號(hào)峰HNMR譜所含信號(hào)與5號(hào)色譜蜂HNMR譜類似，但是不含乙?；〈|(zhì)子，在較低場(chǎng)(4．00以下)含質(zhì)子信號(hào)．認(rèn)為該結(jié)構(gòu)為哥納香二醇或類似物核磁共振技術(shù)在新藥篩選中的作用

1.合理性藥物設(shè)計(jì)合理性藥物設(shè)計(jì)是以了解生物大分子（如蛋白質(zhì)）的三維結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的分子識(shí)別為基礎(chǔ)的。然而，小分子配體和蛋白質(zhì)進(jìn)行分子識(shí)別形成復(fù)合物的過程并非象鑰匙和鎖的模型那樣簡單，而是一個(gè)雙重誘導(dǎo)契合（double-inducedfit）的過程

蛋白質(zhì)-配體雙重誘導(dǎo)契合模型示意圖

2.非合理性藥物設(shè)計(jì)

快速篩選方法(高通量篩選:HTS)(high-throughoutscreening)

優(yōu)點(diǎn)：無需知道蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)缺點(diǎn)：需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力去建立針對(duì)一個(gè)或一類蛋白的檢定方法；所能檢測(cè)到的都是親和力相對(duì)較高的分子；要直接針對(duì)一個(gè)很大的化合物庫進(jìn)行篩選；多種官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)多樣性問題以及酰胺和酯鍵限制藥物的生物利用度的問題也需要進(jìn)一步解決SAR-by-NMR（Structure-activityrelationshipbyNMR）通過NMR將上述合理性藥物設(shè)計(jì)和非合理性藥物設(shè)計(jì)（組合化學(xué)）巧妙地結(jié)合起來，產(chǎn)生了一種極為有效的發(fā)現(xiàn)藥物靶分子高親和性配體的方法，稱為SAR-by-NMR。這種新方法結(jié)合了合理性設(shè)計(jì)中的配體設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法（如LUDI）和非合理性設(shè)計(jì)(如組合化學(xué))的合理因素，大大地提高了先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的速度和有效性。

該方法利用15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)，和15N-1HHSQC實(shí)驗(yàn)。由于小分子和蛋白質(zhì)結(jié)合后，會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的局部化學(xué)環(huán)境，因此通過二維15N-HSQC譜中15N或1H的化學(xué)位移的變化可以檢測(cè)到是否有小分子域蛋白質(zhì)結(jié)合。同時(shí)配體和蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)可以通過化學(xué)位移的變化和配體濃度的關(guān)系測(cè)得。結(jié)合位點(diǎn)也可以由發(fā)生化學(xué)位移變化的原核子來確定。SAR-by-NMR原理示意圖SAR-by-NMR成功之處：1、使用了NMR實(shí)驗(yàn)方法來辨別小分子和靶蛋白的結(jié)合，能夠很快地從小分子化合物庫中發(fā)現(xiàn)結(jié)合于靶蛋白亞活性位點(diǎn)的低親和性配體。2、可以通過蛋白質(zhì)特定酰胺信號(hào)的變化直接得到配體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)信息。這一點(diǎn)首先對(duì)辨別小分子是結(jié)合在靶蛋白的不同亞位點(diǎn)上非常重要，同時(shí)，通過比較結(jié)合在同一亞位點(diǎn)的小分子的結(jié)構(gòu)，可以得到哪些官能團(tuán)對(duì)結(jié)合有主要貢獻(xiàn)的信息，然后通過結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系對(duì)小分子進(jìn)行優(yōu)化3、可以直接研究“變構(gòu)效應(yīng)”即第一個(gè)亞位點(diǎn)配體存在下進(jìn)行篩選時(shí)可能發(fā)現(xiàn)那些只有在第一個(gè)配體存在下才能和靶蛋白的其他亞位點(diǎn)結(jié)合的配體第二個(gè)配體(三角形)只有在另一個(gè)配體(橢圓形)存在的情況下才能和靶蛋白穩(wěn)定地結(jié)合

“連接模式”策略ΔGAB=ΔGA+ΔGB+ΔGlink

所謂“連接模式”，就是把親和性比較弱的單個(gè)分子片段通過連接橋連接起來，這樣得到的新的分子和靶蛋白結(jié)合時(shí)，將不僅僅是單個(gè)片段結(jié)合自由能的簡單相加

這個(gè)策略成功的關(guān)鍵還在于所設(shè)計(jì)的連接橋的長度及其性質(zhì)（如剛性等）能否使ΔGlink達(dá)到最優(yōu)親和性為mM和μM數(shù)量級(jí)的小分子經(jīng)連接可得到nM甚至