核磁共振新技術(shù)

核磁共振新技術(shù)及其應用

核磁共振概述核磁共振新技術(shù)及應用概述

核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段，由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品，并具有迅速、準確、分辨率高等優(yōu)點而得以迅速發(fā)展和廣泛應用，已經(jīng)從物理學滲透到化學、生物、地質(zhì)、醫(yī)療以及材料等學科，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大作用。核磁共振是1946年由美國斯坦福大學布洛赫(F.Bloch)和哈佛大學珀賽爾(E.M.Purcell)各自獨立發(fā)現(xiàn)的，兩人因此獲得1952年諾貝爾物理學獎。50多年來，核磁共振已形成為一門有完整理論的新學科。12位因?qū)舜殴舱竦慕艹鲐暙I而獲得諾貝爾獎科學家

1944年I.Rabi1952年F.Block1952年E.M.Purcell1955年W.E.Lamb1955年P(guān).Kusch1964年C.H.Townes1966年A.Kastler1977年J.H.VanVleck1981年

N.Bloembergen1983年H.Taube1989年N.F.Ramsey1991年R.R.Ernst核磁共振原理

半數(shù)以上的原子核具有自旋，旋轉(zhuǎn)時產(chǎn)生一小磁場。當加一外磁場，這些原子核的能級將分裂，既塞曼效應。在外磁場B0中塞曼分裂圖：共振條件：

=0=0

實現(xiàn)核磁共振的兩種方法a．掃場法:改變0b．掃頻法:改變核磁共振新技術(shù)

核磁雙共振

二維核磁共振

NMR成像技術(shù)極化轉(zhuǎn)移技術(shù)魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)

高效液相色譜與核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）核磁雙共振

雙核自旋系統(tǒng)檢測器2擾動1脈沖雙共振是同時用兩種頻率的射頻場作用在兩種核組成的系統(tǒng)上，第一射頻場B1使某種核共振，第二射頻場B2使另外一種核共振，這樣兩個原子核同時發(fā)生共振。

第二射頻場為干擾場，通常用一個強射頻場干擾圖譜中某條譜線，另一個射頻場觀察其他譜線的強度、形狀和精細結(jié)構(gòu)的變化，從而確定各條譜線之間的關(guān)系，區(qū)分相互重疊的譜線。二維核磁共振及多維核磁共振

二維核磁共振使NMR技術(shù)產(chǎn)生了一次革命性的變化，它將擠在一維譜中的譜線在二維空間展開（二維譜）,從而較清晰地提供了更多的信息。

NMR成像技術(shù)投影重建成像方法Fourier成像方法弛豫時間成像方法逐點掃描方法線掃描方法切片掃描方法高分率成像和快速成像法極化轉(zhuǎn)移技術(shù)靈敏核

非靈敏核檢測（非靈敏核）J脈沖序列1脈沖序列2

極化轉(zhuǎn)移(PT)是一種非常實技術(shù)，它用二種特殊的脈沖序列分別作用于非靈敏核和靈敏核兩種不同的自旋體系上。通過兩體系間極化強度的轉(zhuǎn)移，從而提高非靈敏核的觀測靈敏度，基本的技巧是從高靈敏度的富核處“借”到了極化強度。在NMR測定中，為取得高質(zhì)量的譜圖，要求磁場均勻，樣品的填充因子高，磁化率均勻，前兩個因素可以通過硬件研制不斷改善，而磁化率均勻與否則與樣品性質(zhì)、數(shù)量及周圍環(huán)境直接相關(guān)，這樣，當樣品量有限時,就必須考慮磁化率的均勻性。

1982年，魔角旋轉(zhuǎn)（MAS）開始用于高分辨工作，此后，將MAS用于小體積微量樣品引起了興趣，實驗表明運用MAS可以消除固體及非均相溶液中磁化率不同而造成的譜線加寬。樣品應以相當或大于1.8kHz轉(zhuǎn)速下旋轉(zhuǎn)，可使邊帶得到有效抑制，根據(jù)這些結(jié)果，成功地設計了新型的超微量探頭。

超微量探頭的發(fā)展概況

魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)

在固體中自旋之間的耦合較強，共振譜較寬，掩蓋了其他精細的譜線結(jié)構(gòu)，耦合能大小與核的相對位置在磁場中的取向有關(guān)，其因子是(3cos2β-1)，如果有一種方法使β=θ=54.440（魔角），則3cosβ-1=0，相互作用減小，達到了窄化譜線的目的。魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)就是通過樣品的旋轉(zhuǎn)來達到減小相互作用的，當樣品高速旋轉(zhuǎn)時β與θ的差別就會平均掉。

90年代中，一種與常規(guī)高分辨液相探頭設計完全不同的超微量探頭（目前稱之為NanoNMRProbe，下同）問世了，這種探頭與常規(guī)固體高分辨探頭也不盡相同，后者為高功率，高速魔角旋轉(zhuǎn)用于消除化學位移各向異性和使偶極偶合平均化，對于磁化率的不連續(xù)性是不考慮的。另外，常規(guī)MAS探頭對線寬要求僅為5Hz（甚至50Hz），而1H微量探頭因為1H核本身總的譜寬窄，要求線寬＜0.5Hz（CDCl3在丙酮-d6）中，特殊設計的NanoNMRprobe，其成功之處在于將體積很小的樣品（＜40μL），能100%地保持在檢測線圈內(nèi)，并確保填充因子高，和均勻的磁化率，以得到最高靈敏度，構(gòu)成探頭的物料也必須使磁化率的不連續(xù)性達到最小，才能達到最小的線寬。NanoNMRProbe超微量探頭的結(jié)構(gòu)原理

NanoNMRProbe內(nèi)腔長28mm，魔角（54.7°），轉(zhuǎn)速在1.5~2.0kHz之間，為保持長期穩(wěn)定性，帶有2H鎖線圈，并有變溫功能，探頭種類有直接檢測用的1H和13C{1H}和間接檢測用的1H{13C}探頭，樣品體積最大為40μL，可取得線形好，靈敏度高和分辨率最佳的譜圖，若樣品量很少，溶劑量可相應減少，保持樣品有一定濃度，溶劑雜質(zhì)及偽峰不會增加，還可提高動態(tài)范圍，只要氘代試劑的量能保證場一頻聯(lián)鎖，即使樣品溶液體積未充滿整個樣品管（40μl），也不會使勻場變壞，或使譜線變寬，確保取得高質(zhì)量的譜圖。NanoNMRProbe的應用1、超微量樣品的測定樣品量不同的薄荷醇,分別為為40μg，4μg和400ng，溶于CD2C12中,采樣次數(shù)分別為4次,400次和32240次.2、Nano探頭在組合化學中的應用組合化學是近二十年發(fā)展起來的一種快速合成與篩選大量化合物的新方法，其在發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化藥物先導化合物的過程中發(fā)揮了重要作用。組合化學包括了組合合成、群集篩選和對感興趣化合物結(jié)構(gòu)解析的三大步驟。因而有“平行”合成技術(shù)、“混-分”合成技術(shù)、編碼-解碼技術(shù)、“一珠一化合物”技術(shù)、“位置掃描”技術(shù)、天然寡聚物的生物組合合成及篩選技術(shù)、“動態(tài)化學庫”技術(shù)、“多樣性”導向的組合合成技術(shù)、“Microarray”技術(shù)、組合配基裝配、“非天然”天然組合化學庫合成技術(shù)等等。在多種合成方法中，“一珠一化合物”技術(shù)最大的優(yōu)點是化學庫的空間可分離性，亦即化學庫中所有的化合物同時并存且相互獨立，因而，這種樹脂珠-化學庫的方式可直接用于固相篩選法。利用該技術(shù)在短時間內(nèi)迅速合成并篩選的化合物可以達到幾千萬這樣的天文數(shù)字，大大加快了發(fā)現(xiàn)藥物先導化合物的步伐。但是在產(chǎn)物分析中，由于樹脂引起磁場的不均勻，常規(guī)的NMR技術(shù)受到了限制。較早的做法是將反應的中間體或最終產(chǎn)物從樹脂上切落下來，再利用常規(guī)方法進行分析和鑒定。這種方法費時，費樣，而且經(jīng)常破壞化合物的結(jié)構(gòu)，得出錯誤的信息。九十年代初發(fā)展的高分辨魔角核磁共振技術(shù)(Highresolutionmagicanglespinning(HR/MAS)NMR)可以克服樹脂引起的磁場不均勻性,得到最高靈敏度和最小線寬的NMR譜圖。該技術(shù)不破壞樣品，可靈敏、直接地提供偶聯(lián)在樹脂上化合物的結(jié)構(gòu)信息。

頂部譜圖用常規(guī)5mm液體高分辨探頭91．1mg干樹脂，掃描一次中部譜圖：用常規(guī)5rnm固體CP／MAS探頭，樹脂樣品為20.2mg．轉(zhuǎn)速為3.8kHz，掃描8次底部譜圖：用Nano探頭，樹脂用量僅為5.4mg，魔角轉(zhuǎn)速為2kHz，掃描8次目前，廣泛用于監(jiān)測固相合成反應；指導反應條件的優(yōu)化;鑒定固載在單一樹脂珠上化合物的結(jié)構(gòu)；以及分析樹脂上固載化合物的構(gòu)象等等。高分辨魔角核磁共振是組合化學中有用的分析工具，可以跟蹤固相有機合成反應，快速直接地提供連在樹脂上的化合物的結(jié)構(gòu)信息，指導反應條件的優(yōu)化，它能直接簡便地定量反應的產(chǎn)率，而這種分析方法恰恰在常規(guī)NMR中很難實現(xiàn)。高效液相色譜與核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）1、LC-NMR技術(shù)發(fā)展概況①NMR譜儀的靈敏度較低；

②系統(tǒng)無法應付較大的動力學范圍；③流動檢測池和探頭沒有商品化以及溶劑峰壓制效果不理想。

2、LC-NMR聯(lián)用技術(shù)的軟硬件及原理1）計算機軟件支持

2）LC-NMR聯(lián)用的相關(guān)硬件

a.NMR流動探頭

b.HPLC系統(tǒng)

c.峰敏技術(shù)

d.在線/離線組份收集器

3、技術(shù)問題及解決措施

動力學范圍不夠?qū)捝V分辨率的喪失HPLC-NMR通信NMR靈敏度解決方法：1）流速、檢測池及探頭2）溶劑峰壓制

不同的溶劑峰壓制技術(shù)大都是基于化學位移和馳豫時間的不同而設計的，理想的峰壓制技術(shù)應滿足以下幾點要求：（1）消除溶劑峰而不干擾所要的信號（2）不影響峰壓制區(qū)域以外的信號強度（3）能同時壓制多個溶劑峰（4）易于實現(xiàn)以避免損失測試信號（5）在梯度HPLC體系中能跟隨溶劑信號位置改變而改變

WET序列，已經(jīng)可以成功地完成HPLC-NMR中使用普通試劑而必需的峰壓制4、LC-NMR的操作模式及其應用1）操作模式

a連續(xù)流動：在洗脫過程中，溶劑組成不斷變化，給峰壓制造成一定困難，另外樣品停留時間短，靈敏度低，一般只適用于1H和19F測試。

b停止流動：顧名思義即使溶液停留于檢測池中進行測試。當組分的保留時間已知，或者HPLC-NMR采用靈敏的在線檢測器時，可以采用這種方法。

c分時止流：按一定的時間間隔暫停流動相，來檢測NMR譜。這種方法在被檢組分沒有UV發(fā)色團時尤其適用。通過HPLC-NMR譜，也可以估計色譜峰的純度。d收集分析：色譜洗脫峰被預先收集到一個樣品池中，然后進行離線NMR檢測。e紫外激發(fā)：這種方法主要是利用軟件技術(shù)，在UV檢測到組分峰時，經(jīng)過計算將樣品組分準確地滯留于檢測池中，并通過NMR進行采樣。

2）應用范圍

a在藥物代謝研究中應用

b食品化學

c高聚物分析

d在天然產(chǎn)物化學中的作用

e環(huán)境化學中的應用藤黃酸大鼠膽汁代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證研究藤黃酸是從中藥藤黃中分離得到的化合物，其抗癌作用與一般的化療抗癌藥物有所區(qū)別，實驗研究結(jié)果表明，藤黃酸對多種腫瘤顯示較強的抗腫瘤活性，并在有效計量范圍內(nèi)毒副作用比較小，對腫瘤細胞的抑制有非常高的選擇性，能選擇性的殺死癌細胞，而對正常動物造血系統(tǒng)和免疫功能沒有影響，這是目前腫瘤化療藥物所不具備的。藥代動力學研究已顯示，藤黃酸在腫瘤組織中有較高的分布和較長的持續(xù)時間。

藤黃酸HPLC分析的色譜條件

色譜柱為InertsilODS柱，5μm(150×4.6mm)；柱溫30℃；流動相為乙腈-水-醋酸(85：15：1)，流速1.0ml/min，280nm檢測。A空白膽汁色譜圖BII代謝物分析色譜圖CI相代謝物分析色譜圖D藤黃酸色譜圖藤黃酸在大鼠膽汁中可檢測到2個主要代謝產(chǎn)物，即代謝物1（MT1，Rt=17.996min）和代謝物2（MT2,Rt=19.557min）。LC-NMR的分析條件采用Varian公司的Prostar-230高效液相色譜儀，分析柱為InertsilODS-3柱(150×4.6mm)。流動相為D2O:CH3OH=85:15。流速為1ml/min，檢測器為VarianProstar-330二極管陣列檢測器，紫外檢測波長為280nm。將服藥膽汁樣品溶于200μl甲醇和水的混合溶劑中。在INOVA-500LC-NMR上，用停止流動的方法分別采集LC-1HNMR譜。進樣量為25μl，采用WET方式壓制溶劑峰。譜寬7500Hz，1H譜采樣時間為1.5s，馳豫時間為1s，采樣數(shù)據(jù)點16K，累加次數(shù)為256。

MS圖譜MT1的ESI-MS給出[M-1]-為m/z645，故其分子量為646，與藤黃酸（628）相比，質(zhì)量數(shù)多18，可能為藤黃酸的羥基化物。代謝產(chǎn)物2的LC-MS譜給出MT2的[M-H]-峰為m/z643，故其分子量為644。比藤黃酸質(zhì)量數(shù)(628)多16。MT1(上圖)，MT2(中圖)和藤黃酸(下圖)LC-1HNMR低場區(qū)信號比較代謝物1(MT1)的結(jié)構(gòu)分析

（1）高場區(qū)：MT1的1H-NMR譜高場區(qū)示有多個甲基信號(δ1.73(6H,s),1.66,1.65,1.63,1.56,1.36,1.35(each3H,s))，與藤黃酸類化合物的1HNMR譜特征相符。（2）低場區(qū)藤黃酸的10位烯質(zhì)子的信號(7.56(1H,d,J=6.9Hz))在MT1的1HNMR譜中消失，而MT1在δ4.65(1H,br.d,J=4.0Hz)處顯示一個含氧取代基的偕位質(zhì)子信號，據(jù)此推斷MT1為藤黃酸的10位羥基化產(chǎn)物。

(3)MT1氫譜的低場區(qū)的27,32,37-H的信號也與藤黃酸有明顯不同，藤黃酸中27-H(δ5.96(1H,t,J1=J2=7.2Hz))的信號在MT1中向低場位移至δ6.52(1H,t,J1=J2=7.2Hz)，而原本重疊在一起的32,37-H(δ5.25(2H,m))也分成為兩個多重峰（δ5.05and5.25(each1H,m)。這與10位有含氧取代基的化合物的氫譜特征相吻合（見表3-1），故斷定MT1為10-羥基-藤黃酸。代謝物2(MT2)的結(jié)構(gòu)分析

MT2的LC-1HNMR譜符合藤黃酸類化合物的氫譜特征。在其氫譜上，δ7.4左右沒有雙峰出現(xiàn)，因此藤黃酸結(jié)構(gòu)中的?9，在MT2的結(jié)構(gòu)中消失。MT2的氫譜上在4.4ppm出現(xiàn)一個質(zhì)子的d峰信號，偶合常數(shù)約為4Hz,這與MT1的10-H信號非常相似，因此判斷MT2的10位亦存在含氧取代基。由于MT2僅比藤黃酸多一個氧，因此推測MT2可能為藤黃酸的9,10-環(huán)氧衍生物.

藤黃酸MT1MT210-甲氧基藤黃酸在景洪哥納香提取混合物中的應用研究景洪哥納香(Groniothalamus．Cheliensis)為番茄科哥納香屬植物，據(jù)文獻報道，哥納香屬植物中富含苯乙稀比喃類化合物，該類化合物具有抗癌用．目前已從自然界中分離得到70余種該類化合物。儀器及實驗條件

景哥洪納香(20kg)用95％的酒精提取3次，所得浸膏(1300g)在索式提取器中，先后用石油醚，氯仿、乙酸乙酯萃?。确虏糠?315g)用硅膠柱層析，以CHCL3：乙酸乙酯梯度洗脫，得到105mg混合物．采用Varian公司的Prostar一230高效液相色譜儀，分析柱為InertsilODS一3柱(250×46mm)．流動相為D2O，CH2CN，采用梯度洗脫，0～1min時其洗脫比例為D2O：CH3CN=68：32，逐漸增加乙腈的比例至25min時達到D2O：CH3CN=40：60，至45min時達到D2O：CH3CN=20：60．流速為1mL／min，檢測器為VarianProstar一330二極管振列檢測器，紫外檢測波長為254nm將5mg混合物樣品溶于200μL乙腈和水的混合溶劑中結(jié)果與討論苯乙稀吡喃類化合物在δ6.00～7.00為雙鍵上的稀質(zhì)子，δ4.00～5.00為環(huán)上連氧環(huán)質(zhì)子，δ7.00～7.80為單取代的苯質(zhì)子．通過對HPLC-NMR得到的HNMR譜分析,得到各譜均符合苯乙稀吡喃類化合物的特征．4，5，6色譜峰有兩套雙鍵上的稀質(zhì)子信號，如果為雙倍體，每對δ6.00～7.00雙鍵上的稀質(zhì)子比例應相同，但現(xiàn)在比例不同，4，5，6色譜峰的HNMR譜為混合物HNMR．其中5號色譜蜂HNMR譜有兩套雙鍵上的稀質(zhì)子信號δ7.033，δ6.080和δ7．033，6．210;兩套乙?；〈|(zhì)子5．492，5．370，10個苯質(zhì)子δ7.00～7.80兩套,δ4.00～5.00有2個質(zhì)子,也是兩套.這兩套質(zhì)子比例均為2:1.，認為該結(jié)構(gòu)為哥納香三醇或類似物6號峰HNMR譜中含有5號峰所有信號及另一套雙鍵上的稀質(zhì)子信號δ7．033．6．080，δ5．734有一個質(zhì)子信號．二者比例為1：4．因此認為該物質(zhì)可能為苯乙烯或類似物.．4號峰HNMR譜所含信號與5號色譜蜂HNMR譜類似，但是不含乙?；〈|(zhì)子，在較低場(4．00以下)含質(zhì)子信號．認為該結(jié)構(gòu)為哥納香二醇或類似物核磁共振技術(shù)在新藥篩選中的作用

1.合理性藥物設計合理性藥物設計是以了解生物大分子（如蛋白質(zhì)）的三維結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的分子識別為基礎(chǔ)的。然而，小分子配體和蛋白質(zhì)進行分子識別形成復合物的過程并非象鑰匙和鎖的模型那樣簡單，而是一個雙重誘導契合（double-inducedfit）的過程

蛋白質(zhì)-配體雙重誘導契合模型示意圖

2.非合理性藥物設計

快速篩選方法(高通量篩選:HTS)(high-throughoutscreening)

優(yōu)點：無需知道蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)缺點：需要花費大量的時間和精力去建立針對一個或一類蛋白的檢定方法；所能檢測到的都是親和力相對較高的分子；要直接針對一個很大的化合物庫進行篩選；多種官能團的結(jié)構(gòu)多樣性問題以及酰胺和酯鍵限制藥物的生物利用度的問題也需要進一步解決SAR-by-NMR（Structure-activityrelationshipbyNMR）通過NMR將上述合理性藥物設計和非合理性藥物設計（組合化學）巧妙地結(jié)合起來，產(chǎn)生了一種極為有效的發(fā)現(xiàn)藥物靶分子高親和性配體的方法，稱為SAR-by-NMR。這種新方法結(jié)合了合理性設計中的配體設計和優(yōu)化方法（如LUDI）和非合理性設計(如組合化學)的合理因素，大大地提高了先導化合物發(fā)現(xiàn)的速度和有效性。

該方法利用15N標記的蛋白質(zhì)，和15N-1HHSQC實驗。由于小分子和蛋白質(zhì)結(jié)合后，會改變蛋白質(zhì)結(jié)合位點的局部化學環(huán)境，因此通過二維15N-HSQC譜中15N或1H的化學位移的變化可以檢測到是否有小分子域蛋白質(zhì)結(jié)合。同時配體和蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)可以通過化學位移的變化和配體濃度的關(guān)系測得。結(jié)合位點也可以由發(fā)生化學位移變化的原核子來確定。SAR-by-NMR原理示意圖SAR-by-NMR成功之處：1、使用了NMR實驗方法來辨別小分子和靶蛋白的結(jié)合，能夠很快地從小分子化合物庫中發(fā)現(xiàn)結(jié)合于靶蛋白亞活性位點的低親和性配體。2、可以通過蛋白質(zhì)特定酰胺信號的變化直接得到配體結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)信息。這一點首先對辨別小分子是結(jié)合在靶蛋白的不同亞位點上非常重要，同時，通過比較結(jié)合在同一亞位點的小分子的結(jié)構(gòu)，可以得到哪些官能團對結(jié)合有主要貢獻的信息，然后通過結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系對小分子進行優(yōu)化3、可以直接研究“變構(gòu)效應”即第一個亞位點配體存在下進行篩選時可能發(fā)現(xiàn)那些只有在第一個配體存在下才能和靶蛋白的其他亞位點結(jié)合的配體第二個配體(三角形)只有在另一個配體(橢圓形)存在的情況下才能和靶蛋白穩(wěn)定地結(jié)合

“連接模式”策略ΔGAB=ΔGA+ΔGB+ΔGlink

所謂“連接模式”，就是把親和性比較弱的單個分子片段通過連接橋連接起來，這樣得到的新的分子和靶蛋白結(jié)合時，將不僅僅是單個片段結(jié)合自由能的簡單相加

這個策略成功的關(guān)鍵還在于所設計的連接橋的長度及其性質(zhì)（如剛性等）能否使ΔGlink達到最優(yōu)親和性為mM和μM數(shù)量級的小分子經(jīng)連接可得到nM甚至