section 2 蛋白質(zhì)成熟和周轉(zhuǎn)

Section2蛋白質(zhì)的成熟和周轉(zhuǎn)MatureandTurn-overofProtein中心法則表述了遺傳信息從DNA，到RNA，最后翻譯成新生肽鏈的過(guò)程，但蛋白質(zhì)肽鏈合成之后還需要經(jīng)歷折疊、修飾、組裝以及分揀、運(yùn)輸和在細(xì)胞內(nèi)定位等過(guò)程，卻是中心法則未能描繪的內(nèi)容，也是目前研究的熱點(diǎn)。一、蛋白質(zhì)折疊、組裝和修飾；二、蛋白質(zhì)分揀、投送、定位；三、蛋白質(zhì)壽命和限制性降解體系

未折疊蛋白（U）快折疊中間體慢成熟蛋白（N）1。蛋白折疊的動(dòng)力學(xué)：折疊的起始：自由能降低過(guò)程，為自發(fā)性折疊中間態(tài)：熔球態(tài)(moltenglobulestate)；前熔球態(tài)(pro-moltenglobulestate)

限速步驟：二硫鍵的形成；Pro的順?lè)串悩?gòu)化過(guò)程2。蛋白折疊及裝配的熱力學(xué)——輔助因子：分子伴侶(molecularchaperones)；折疊酶（foldase）一、蛋白質(zhì)折疊、組裝和修飾：新生肽鏈的剪切：

N-端信號(hào)肽的切除：信號(hào)肽酶前體激活：原肽切除新生肽鏈的自剪接：內(nèi)含肽、外顯肽新生肽鏈翻譯后修飾：糖基化：N-連接、O-連接等脂質(zhì)修飾：豆蔻?；?；異戊二烯化；棕櫚?；?；法尼基化糖基磷脂酰肌醇化：肽鏈C-端接上GPI錨鉤末端修飾：如N-端S、A、M乙?；图柞；Ｗo(hù)、環(huán)化、

E焦谷氨酸化；豆蔻?；?；C-端連接GPI等動(dòng)態(tài)可逆修飾：如蛋白磷酸化、乙?；?、甲基化、泛肽化、ADP核糖基化等3。蛋白質(zhì)剪切和修飾：二、蛋白質(zhì)分揀、投送、定位：

蛋白質(zhì)運(yùn)送有三種形式：

跨膜運(yùn)送、核孔運(yùn)輸、囊泡運(yùn)送2c2a2b進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（一）蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：1.邊合成邊跨ER膜：細(xì)胞內(nèi)相當(dāng)部分的蛋白質(zhì)，包括分泌蛋白、溶酶體蛋白、膜蛋白等，必須要先進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。此類蛋白主要是由附著于ER上的核糖體合成，邊合成邊跨躍ER。1.1進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列：新生肽鏈的信號(hào)肽1.2載體：SRP、SRP受體（SR）、ER上的轉(zhuǎn)位器、信號(hào)肽酶復(fù)合物（SPC）等。1.2.1SPR：SPR構(gòu)成：

7SRNA+6條肽鏈（9、14、19、54、68、72kDa）功能：

p54:識(shí)別結(jié)合信號(hào)肽；介導(dǎo)與SR的結(jié)合

p68:高度堿性蛋白，與p72形成異二聚體；與SR的結(jié)合

p72：與p68形成異二聚體，是肽鏈轉(zhuǎn)位所必須的

p9/p14：形成異二聚體，與RNA末端結(jié)合；與核糖體作用，中止肽鏈跨膜前的合成

p19：幫助p54與7SRNA結(jié)合，其他功能不清。SPR結(jié)構(gòu)P54亞基分為N、G、M三個(gè)結(jié)構(gòu)域：N：位于N-端G：結(jié)合GTP，具GTP酶活性M：在C-端，因含多個(gè)Met而得名，易于形成兩親螺旋，提供與疏水信號(hào)肽結(jié)合位點(diǎn)P9和p14結(jié)構(gòu)以及與RNA的結(jié)合

革蘭氏陰性菌和支原體SRP：其RNA為4.5S，只含有一個(gè)稱為Ffh的p48類似物。1.2.2SR(SRP受體）：SR的結(jié)構(gòu)：是ER上的一個(gè)內(nèi)在蛋白，由和兩個(gè)亞基構(gòu)成：亞基：69kDa，含多個(gè)疏水區(qū)，其一帶大量正電荷，與

SRP的p68/p72作用。亞基：30kDa，與亞基1：1結(jié)合。SR功能：引導(dǎo)SPR和新生肽鏈正確結(jié)合到ER上；一旦結(jié)合完成，促使SRP解離1.2.3ER上的轉(zhuǎn)位器：新生肽鏈通過(guò)ER上的特定通道，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到ER腔內(nèi)，這一通道，連同核糖體受體和信號(hào)肽受體在內(nèi)，現(xiàn)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)位器（Translocon）在去污劑和脂質(zhì)體中，分離出來(lái)的最小的轉(zhuǎn)位器為圓柱形的親水通道寡聚體，外徑=85?，內(nèi)徑=20?，由SRP受體、Sec61復(fù)合物和一個(gè)轉(zhuǎn)位鏈相關(guān)膜蛋白（TRAM）組成。轉(zhuǎn)位器中部分蛋白的結(jié)構(gòu)特征：1.3信號(hào)肽酶大多數(shù)新生肽鏈進(jìn)入ER后，信號(hào)肽將由信號(hào)肽酶切除。真核細(xì)胞信號(hào)肽酶1.4新生肽鏈的轉(zhuǎn)位過(guò)程：部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白還可通過(guò)不依賴SPR的途徑，進(jìn)入ER，尤其是酵母，比高等的真核細(xì)胞更多地使用該途徑。不依賴SRP的跨ER膜轉(zhuǎn)運(yùn)是一種翻譯后運(yùn)送方式。過(guò)程：肽鏈在細(xì)胞質(zhì)合成后，以不完全折疊狀態(tài)與分子伴侶（如Hsp70等）結(jié)合，然后在Sec61p以及Ydilp（功能類似于DnaJ）的幫助下跨越ER膜。在ER腔內(nèi)，再由Bip等其它分子伴侶幫助完成折疊。此運(yùn)送方式具有方向性，因?yàn)椋cATP結(jié)合而尚未與底物結(jié)合的Bip，可以封閉ER轉(zhuǎn)位器的ER側(cè)。2。不依賴SRP的跨ER膜轉(zhuǎn)運(yùn)：3。ER滯留信號(hào)：

3.1常見(jiàn)ER滯留信號(hào)：

BiP、grp94和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶都是滯留在ER中的，在它們的C-末端有同樣的四肽KDEL。如果除去BiPC-端的KDEL四肽，BiP就被分泌；溶菌酶的C-端接上了這一四肽，也被保留在ER中，不再被分泌。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證明：KDEL四肽是將蛋白質(zhì)滯留在ER中的一種信號(hào)。在酵母中也有類似的情況，只是四肽的序列為HDEL。

含有KDEL的蛋白質(zhì)約十多個(gè)，它們的作用可能和BiP相同，起“質(zhì)量監(jiān)督”作用。使折疊不正確新生肽鏈和沒(méi)有裝配好的單體(亞基)不能通過(guò)ER，進(jìn)入高爾基體ER膜蛋白分為I型和II型，I型肽鏈的N-端在ER腔內(nèi)，而C-端在細(xì)胞質(zhì)中；II型則相反。其中I型肽鏈的C-端有一個(gè)序列為KKXX或KXKXX的信號(hào)序列與定位方式有關(guān)。此外，腺病毒中有一種E19膜糖蛋白，它出現(xiàn)于病毒感染的早期，是I型ER膜整合蛋白，其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的肽段較短，C-端15肽是定位在ER上所必需的，如果除去這肽段中的8個(gè)氨基酸殘基，E19就被送到細(xì)胞表面。

這種滯留信號(hào)如何起作用？目前還不清楚，很可能是通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的肽段和微管等細(xì)胞骨架相互作用。3.2ER膜上滯留信號(hào)：1。高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)屬于囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)：高爾基體是肽鏈加工過(guò)程中不可或缺的細(xì)胞器。一種小的GTP結(jié)合蛋白——ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白（Rab）家族（約30種）引導(dǎo)高爾基體囊泡到達(dá)正確的目的地。Rab蛋白都是小分子的GTP酶，分子量大約都在200aa左右，差異在于C-端序列不同，并決定了它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的分布特征。其中：Rab1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體；Rab2在近側(cè)高爾基體；Rab6在中間高爾基體；Rab9和10在遠(yuǎn)側(cè)高爾基體等。（二）蛋白質(zhì)在高爾基體內(nèi)的分揀和定位：Ras：是原癌基因ras的編碼產(chǎn)物，分子量21kDa的一條肽鏈，作用機(jī)理類似Gα,故又稱P21蛋白或小G蛋白。幾乎1/3人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)有Ras突變，它對(duì)細(xì)胞分化至關(guān)重要。Rab1Rab2Rab3Rab6Rab10Rab9Rab7Rab4Rab5Rab蛋白在胞漿中可將結(jié)合的GDP換成GTP，并結(jié)合到特定的出芽囊泡表面，促使其與正確受體融合后，將GTP水解為GDP，Rab-GDP復(fù)合體從囊泡上脫落，完成一個(gè)Rab循環(huán)。2。高爾基體中蛋白質(zhì)的定位信號(hào)：位于肽鏈C-端的YQRL被認(rèn)為是蛋白質(zhì)定位于高爾基體的一個(gè)信號(hào)肽。3。高爾基體內(nèi)蛋白質(zhì)向胞外的分泌：肽鏈經(jīng)ER進(jìn)入高爾基體后，除了部分定位于ER和高爾基體外，其余的將被以囊泡形式進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外或溶酶體等其它細(xì)胞器。囊泡的形式有兩種：籠形蛋白包被小泡（如：從高爾基體到溶酶體）非籠形蛋白包被小泡（如：從ER到高爾基體）

高爾基體中的蛋白通過(guò)兩種方式分泌到胞外連續(xù)分泌：或固有分泌、組成型分泌，指通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)小泡/顆粒，非選擇性地將蛋白連續(xù)投送到細(xì)胞膜或分泌到胞外的分泌方式。例如：免疫球蛋白、白蛋白、大多數(shù)糖蛋白和間質(zhì)蛋白等基體組成型分子。調(diào)節(jié)性分泌：指某些特殊的分泌細(xì)胞可以將一些分泌蛋白儲(chǔ)存于囊泡中，在特定的刺激下再分泌出去的分泌方式。一般調(diào)節(jié)性分泌的蛋白都屬于激素、酶原和神經(jīng)遞質(zhì)等具有特定生物活性的蛋白。調(diào)節(jié)性分泌囊泡中帶有色顆粒蛋白（chromogranin)和分泌顆粒素（secretogranin)兩種蛋白，在pH6.5和鈣離子濃度1mmol/L條件下(通常在TGN內(nèi)），可彼此聚集，并選擇性介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互聚集，聚集蛋白將進(jìn)入調(diào)節(jié)性分泌囊泡，否則將被連續(xù)分泌。

高爾基體內(nèi)蛋白的兩種分泌方式籠形蛋白（三）蛋白質(zhì)向溶酶體的分揀和投送：溶酶體本身不能合成蛋白質(zhì)，所有的酶都是輸入的，以補(bǔ)充這些酶的代謝更新以及細(xì)胞分裂時(shí)溶酶體的膨脹之用。同時(shí)這些溶酶體酶又不能流失到細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的其它部位，以免產(chǎn)生有害的水解作用。進(jìn)入溶酶體的蛋白大致可分為兩類：一類是溶酶體固有的蛋白，包括多達(dá)50種的可溶性水解酶和凝集素等。另一類是需要在溶酶體內(nèi)被降解的蛋白。它們帶有不同的信號(hào)。1。溶酶體蛋白質(zhì)進(jìn)入的信號(hào)：溶酶體蛋白質(zhì)絕大多數(shù)為水解酶類，因此它們的分揀信號(hào)明顯區(qū)別于其它蛋白，采用的是特殊的糖信號(hào)——Man-6-P。高爾基體膜的腔面一側(cè)存在著6-P-甘露糖的結(jié)合蛋白受體（P型動(dòng)物凝集素——P-selectin)能夠特異結(jié)合N-寡糖末端帶有6個(gè)磷酸甘露糖的標(biāo)記的溶酶體蛋白，并與其形成復(fù)合物。復(fù)合物從高爾基體上出芽并被引入籠形蛋白包被的囊泡中，形成早期內(nèi)吞體，后者很快除去籠形蛋白后與晚期內(nèi)吞體結(jié)合，內(nèi)部PH降為5.5，導(dǎo)致復(fù)合物解體，磷酸化的酶與其受體分離。晚期內(nèi)吞體分裂為小的轉(zhuǎn)運(yùn)體，溶酶體酶失去磷酸基并被運(yùn)送到溶酶體；而P-selectin被送回高爾基體循環(huán)使用。除了溶酶體酶以外，還有一些蛋白質(zhì)也含有Man-6-P糖鏈，如甲狀腺球蛋白、某些病毒外殼的糖蛋白，可能Man-6-P受體還有鮮為人知的生物學(xué)意義。2。溶酶體膜蛋白的定位信號(hào)：定位于溶酶體膜上的蛋白信號(hào)是其某一肽段，而不是糖信號(hào)。例如I型溶酶體蛋白gp120：其在細(xì)胞質(zhì)中的C-端的氨基酸殘基序列中的GY（Gly-Tyr)是其定位于溶酶體膜的關(guān)鍵，否則將被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上。溶酶體膜蛋白的C-端常具有和質(zhì)膜蛋白類似的YXX和L（為疏水a(chǎn)a）序列，說(shuō)明它們可能是利用相似的序列插入膜內(nèi)，通過(guò)內(nèi)吞體進(jìn)入溶酶體的。3。待降解蛋白進(jìn)入溶酶體信號(hào)：蛋白質(zhì)降解是細(xì)胞內(nèi)的重要事件，溶酶體是一個(gè)重要的承擔(dān)者。需要進(jìn)入溶酶體降解的蛋白質(zhì)具有的特定信號(hào)序列是：KFERQ或RIDKQ。細(xì)胞中帶有上述序列的蛋白質(zhì)約占總量的1/3，新生蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，該序列處于掩蔽狀態(tài)；而老化蛋白會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化而使KFERQ序列暴露，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Hsp70家族的prp73，能與帶有KFERQ序列的蛋白結(jié)合，并介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)老化蛋白進(jìn)入溶酶體。有實(shí)驗(yàn)顯示：細(xì)胞中蛋白質(zhì)選擇性進(jìn)入哺乳動(dòng)物溶酶體和酵母液泡，是在饑餓條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的。4。酵母中液泡蛋白的定位信號(hào)：酵母液泡與溶酶體有類似的功能，也存在大量的水解酶，包括羧肽酶Y（CPY）、蛋白酶A和B、二氨肽酶等，他們的定位信號(hào)不是Man-6-P，而是一些親水性的肽段介導(dǎo)。例如：CPY的定位與原肽區(qū)域內(nèi)的肽段QRPL有關(guān)，進(jìn)入液泡后，該序列將因?yàn)橄鄳?yīng)的原肽被切除而激活。（四）線粒體蛋白質(zhì)的分揀和投送線粒體90％以上的蛋白質(zhì)是先在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以前體形式合成，再通過(guò)特定方式投送入線粒體的。（折疊和解折疊）

1。線粒體蛋白的投送：線粒體的蛋白質(zhì)是在核糖體上合成之后，在分子伴侶Hsp70、MSF等的幫助下，識(shí)別線粒體表面受體，并以近似伸展?fàn)顟B(tài)跨越線粒體膜孔道。其中Hsp70和MSF的機(jī)制不同：Hsp70直接與Tom20/22接觸，然后與外膜孔道Tom40作用，使蛋白在內(nèi)外膜接觸點(diǎn)跨膜；而MSF則先與Tom31/70結(jié)合，然后再轉(zhuǎn)給Tom20/22。接觸點(diǎn)處外膜的孔道是Tom20/22誘導(dǎo)的Tom40，而內(nèi)膜孔道是Tim44結(jié)合的Tim23/17。MSFMSFMSF1a1b3b23a452。有三類不同的線粒體蛋白以不同的方式被轉(zhuǎn)送：2.1P類蛋白：是可溶性的、定位于基質(zhì)或內(nèi)外膜間隙的線粒體蛋白。它們的前體的N-端具有信號(hào)肽段，稱為前序列(presequence)，也曾被稱為導(dǎo)肽（leadingpeptide）。定位于基質(zhì)的蛋白：屬其中一個(gè)亞類。如啤酒酵母中的細(xì)胞色素氧化酶的亞基IV（COXIV）。定位于內(nèi)、外膜的間隙的蛋白：是另一亞類，除了有前序列，緊接著還有一段被認(rèn)為是分揀信號(hào)的疏水的肽段。如細(xì)胞色素C1、細(xì)胞色素b2、F0ATP酶的亞基9等。分揀信號(hào)在蛋白質(zhì)正確定位后也被切除。P類蛋白質(zhì)的前序列特征：都富含酸性殘基和帶羥基的氨基酸，傾向形成兩親螺旋。在兩親螺旋的一個(gè)側(cè)面集中了肽段的所有正電荷。這樣的兩親螺旋具有一定的膜活性，易于插入脂雙層中，并給脂雙層一定的擾動(dòng)。

線粒體P類蛋白的定位：2.2A類蛋白質(zhì)：是定位在外膜或內(nèi)膜上的線粒體蛋白，如ADP-ATP的載體(AAC)、孔蛋白(porin)等。沒(méi)有前序列，分揀信號(hào)存在于肽鏈內(nèi)部，可能是空間構(gòu)象中的某一區(qū)域，構(gòu)成這一區(qū)域的肽段分散在整個(gè)肽鏈不同地方。這類蛋白質(zhì)中存在多個(gè)可以穿越膜的肽段，在受體和第一個(gè)穿越膜的肽段結(jié)合后，就進(jìn)一步促使了其余的肽段定位在膜上，加快了整個(gè)轉(zhuǎn)送過(guò)程。

2.3C類蛋白質(zhì)：線粒體C類蛋白即細(xì)胞色素C。

它和前兩類不同，成熟的蛋白質(zhì)含有血紅素，而前體蛋白質(zhì)是脫輔基的蛋白質(zhì)。在線粒體的外膜上有一些和前體高度親和的結(jié)合位點(diǎn)，只要有脫輔基前體中的l-38這段肽鏈，就能使肽鏈自發(fā)的插入并進(jìn)入人造的膜，肽鏈其它部分都和轉(zhuǎn)送活性無(wú)關(guān)。前體肽鏈的N-端，在前體通過(guò)線粒體外膜的過(guò)程或隨后就和血紅素發(fā)生共價(jià)的結(jié)合，由存在于外膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞色素血紅素裂合酶催化，這一結(jié)合有利于整個(gè)肽鏈穿越線粒體外膜。如果缺少這個(gè)裂合酶，前體的進(jìn)入就會(huì)變得很慢。因此認(rèn)為外膜上的受體和這裂合酶很接近，很可能以某種方式與它偶聯(lián)。

線粒體C類（a）和A類（b）蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)：（五）葉綠體蛋白質(zhì)的分揀和投送植物葉綠體的結(jié)構(gòu)類似于線粒體，但更為復(fù)雜。一些進(jìn)入葉綠體類囊體膜的蛋白，采用與進(jìn)入線粒體內(nèi)外抹間隙的P類蛋白相似的機(jī)制：具有2-3個(gè)信號(hào)肽序列；在內(nèi)外膜接觸點(diǎn)處穿膜；進(jìn)入基質(zhì)后切除導(dǎo)向基質(zhì)序列，然后再利用第二段信號(hào)肽進(jìn)入類囊體腔。但是蛋白進(jìn)入類囊體膜的受體可能不相同。例如質(zhì)藍(lán)素和一種金屬結(jié)合蛋白進(jìn)入類囊體膜時(shí)，各有特點(diǎn)：

不同蛋白質(zhì)進(jìn)入類囊體腔的示意圖前體蛋白Toc75通道基質(zhì)蛋白類囊體膜蛋白multipletransmembranehelicesinasinglepolypeptidehaveonlyonetransmembranehelix;theamino-terminaldomainisoutsidethecellintypeIproteinsandinsideintypeII.transmembranedomainsofseveraldifferentpolypeptidesassembletoformachannelthroughthemembrane.TypeVproteinsareheldtothebilayerprimarilybycovalentlylinkedlipids；andtypeVIproteinshavebothtransmembranehelicesandlipid(GPI)anchors.（六）蛋白質(zhì)在質(zhì)膜上的定位

I型：C端在胞質(zhì)，N-端或在胞外，或者在細(xì)胞器前面一側(cè)。IIIIIIIVVVI1。穿膜蛋白質(zhì)肽段的定位情況：不同穿膜蛋白在膜上的定位過(guò)程：C端帶較多正電荷—I型N端帶較多正電荷—II型存在多個(gè)穿膜信號(hào)，奇數(shù)疏水肽段為起始，偶數(shù)為終止信號(hào)蛋白質(zhì)的膜定位依賴于肽鏈內(nèi)部的一段或多個(gè)疏水序列，根據(jù)序列存在的部位、數(shù)量不同，蛋白將以不同形式折疊于膜上。存在多個(gè)穿膜信號(hào)時(shí)，疏水肽段中出現(xiàn)順序?yàn)槠鏀?shù)的疏水肽段為起始信號(hào)，偶數(shù)則為終止信號(hào)。幾乎所有的膜蛋白最初都是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)定位的，然后通過(guò)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)，在Ran蛋白家族的引導(dǎo)下到達(dá)預(yù)定的細(xì)胞器或質(zhì)膜，最后融合到需要的膜部位。2。利用GPI錨鉤定位的蛋白：此類蛋白一般在C-端存在疏水的GPI化信號(hào)序列，并借此序列插在膜中，在GPI轉(zhuǎn)酰肽酶作用下，在信號(hào)序列末端切斷肽鏈并轉(zhuǎn)移到已合成的GPI錨鉤上。3。利用脂肪鏈定位：相當(dāng)一部分膜上蛋白是利用各種脂肪鏈修飾定位在膜上脂肪鏈修飾方式何特征為：豆蔻酰化：修飾部位一般在N-端的Gly上，修飾或定位序列為MGXXS/T/G。異戊二烯化和甲酯化：修飾部位一般在肽鏈的C-端倒數(shù)第四位的Cys上，被接上異戊二烯后，C-端三肽被切除，異戊二烯化的Cys羧基還將被甲酯化。棕櫚?；阂话闶钦婧思?xì)胞或病毒中的蛋白，發(fā)生在蛋白質(zhì)C-端或N-端的Cys上。并且相當(dāng)一部分是雙重脂質(zhì)化：C-端附近的S-棕櫚?；彤愇於┗?；或N-端附近S-棕櫚?；蚇-豆蔻?；?，個(gè)別為N-端附近S-棕櫚?；蚇-棕櫚?；?。4。原核細(xì)胞中蛋白質(zhì)的膜定位：原核細(xì)胞中蛋白質(zhì)的膜定位情況與真核不同：新生肽鏈的信號(hào)肽傾向于轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)，插入膜中則成為螺旋：穿膜復(fù)合物原核細(xì)胞沒(méi)有內(nèi)膜系統(tǒng)，但革蘭氏陰性菌有內(nèi)外兩層膜，定位于外膜(OM)的蛋白質(zhì)可能以三種不同方式定位：A:在細(xì)胞質(zhì)中合成的蛋白，先形成轉(zhuǎn)運(yùn)小泡，進(jìn)入內(nèi)外膜之間的周質(zhì)后，再與外膜融合并定位其上；B：先穿越內(nèi)膜到周質(zhì)，再定位于外膜；C：直接通過(guò)內(nèi)外膜結(jié)合部（Bayer氏斑），定位于外膜。（七）蛋白質(zhì)的核定位：1.蛋白質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)的信號(hào)和定位：分子量小于40kDa（至少不大于65kDa）、直徑小于23nm的蛋白質(zhì)可以擴(kuò)散的方式進(jìn)入核內(nèi)，遷移速度與大小成反比；組蛋白的進(jìn)入需要專門(mén)受體介導(dǎo)；其它大分子量蛋白進(jìn)入需要有特定的核定位序列（NLS）

核孔復(fù)合物（NPC）：NPC是核運(yùn)輸?shù)目椎?，總分子量約125MDa，外徑120nm，核孔有效直徑和長(zhǎng)度都是50nm左右。一些核孔蛋白的特征是富含Phe和Gly，序列為FXFG或GLFG，稱FG重復(fù)序列，是輸入蛋白的亞基等轉(zhuǎn)運(yùn)受體的結(jié)合位點(diǎn)。

NLS的基本特征10個(gè)aa左右；富含堿性aa（尤其是Lys）和親水a(chǎn)a；末端常包含一個(gè)Pro或Gly，如PKKKRKV（SV40病毒大T抗原）、PKKARED或VSRKRPR（多瘤病毒T抗原）；提示該序列不一定位于末端，通常應(yīng)位于蛋白表面或球蛋白的轉(zhuǎn)角處。

輸入蛋白（importin）：是蛋白質(zhì)輸入的載體由和兩個(gè)亞基構(gòu)成的異二聚體，亞基識(shí)別入核蛋白的NLS，亞基識(shí)別核孔胞質(zhì)側(cè)纖毛，以及核孔蛋白。入孔時(shí)的?？课稽c(diǎn)是：大鼠：核孔蛋白p62/p54/p52酵母：Nup1和Nsp1入核的過(guò)程：

Pr-NLS

轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)Pr-β亞基停泊在NPC纖毛上

轉(zhuǎn)運(yùn)Pr-亞基

纖毛擺動(dòng)

核質(zhì)

Ran-GTP

轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物解離

Pr釋放

NPC纖毛NPC

Ran為Ras相關(guān)核蛋白，是小的GTP酶。Ran-GDP幫助蛋白入核；Ran-GTP介導(dǎo)空載亞基出核。

細(xì)胞核內(nèi)也有部分物質(zhì)需要被輸出核外，包括核酸分子、非蛋白類分子、蛋白質(zhì)等。核輸出蛋白質(zhì)存在一些特定的出核序列（NES），多數(shù)是含有Leu的模體，還要依賴輸出蛋白(exportin)的幫助。從核內(nèi)輸出到細(xì)胞質(zhì)的核酸（包括tRNA、微小RNA前體和小螺旋RNA等）也具有出核信號(hào)，當(dāng)與輸出蛋白結(jié)合后，在GDP-Ran的幫助下，完成通過(guò)核孔的過(guò)程。核孔不僅是物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ?，也參與基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡和分泌等過(guò)程，使通過(guò)調(diào)節(jié)NPC成分（Nup153、CAN和Nup38）的磷酸化/去磷酸化，或被胱天蛋白酶降解等實(shí)現(xiàn)的。2。核輸出信號(hào)及其有關(guān)蛋白：（八）蛋白質(zhì)在過(guò)氧化體內(nèi)的定位過(guò)氧化體是除去細(xì)胞過(guò)氧化氫的細(xì)胞器，此外一些脂質(zhì)、固醇、嘌呤也在此降解。進(jìn)入過(guò)氧化體的肽鏈，其C-端有特定序列，經(jīng)常是SKL，尤其其中的Leu是不可取代的。進(jìn)入過(guò)氧化體的蛋白在核糖體合成之后，先折疊成為天然構(gòu)象，其C-端的SKL信號(hào)肽被過(guò)氧化體靶向序列1受體（PTS1R）專一性識(shí)別和結(jié)合，并將蛋白質(zhì)牽引到過(guò)氧化體膜，與膜上的受體Pex14p結(jié)合，復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)。隨后復(fù)合物解離，結(jié)合蛋白PTS1R返回細(xì)胞質(zhì)，循環(huán)使用。除了Pex14p外，還有至少21種與過(guò)氧化體定位相關(guān)的蛋白，Pex1p-22p.蛋白質(zhì)在

過(guò)氧化氫體

內(nèi)的定位（九）蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的滯留信號(hào)迄今為止，對(duì)何種序列決定了蛋白質(zhì)滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還知之甚少。有兩種看法：一是：不含任何信號(hào)序列的蛋白合成后留在胞質(zhì)；二是：相當(dāng)多的細(xì)胞質(zhì)滯留蛋白其N-端是被?；模；欠駷榧?xì)胞質(zhì)滯留信號(hào)，還有待進(jìn)一步確定。

（十）蛋白質(zhì)由胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的途徑1。胞吞作用的不同途徑：1.1胞吞作用（endocytosis):細(xì)胞攝入大分子的作用吞噬作用（phagocytosis）：被吞物較大胞吞作用吞飲作用（pinocytosis）：被吞物較小吞飲作用又有4種方式：形成籠形蛋白包被小泡（CV）；一般小窩；無(wú)外被小泡或小窩（NCV）；巨胞飲體研究較多的是籠形蛋白包被方式。循環(huán)內(nèi)吞體內(nèi)吞載體小泡（或多層小泡體）早期內(nèi)吞體晚期內(nèi)吞體12341.2.1轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞特點(diǎn)：為受體介導(dǎo)形成籠形蛋白包被小泡受體隨后釋放回細(xì)胞表面脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白亦被釋放和循環(huán)使用。1.2進(jìn)入細(xì)胞后的內(nèi)吞體還

可經(jīng)4種不同的方式處理：1.2.2LDL受體介導(dǎo)的內(nèi)吞特點(diǎn)：為受體介導(dǎo)形成籠形蛋白包被小泡受體隨后釋放回細(xì)胞表面（受體中存在FDNPVY序列負(fù)責(zé)受體的聚集和內(nèi)化）籠形蛋白1.2.3重新定位方式特點(diǎn)：1.為受體介導(dǎo)2.內(nèi)吞后，受體和配體一起被運(yùn)到質(zhì)膜的特定部位，是配體重新定位的過(guò)程。1.2.3生長(zhǎng)因子類受體介導(dǎo)的內(nèi)吞特點(diǎn)：受體和配體結(jié)合是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程；內(nèi)吞后，受體和配體共同進(jìn)入溶酶體，并均被降解。2。內(nèi)吞后的分揀信號(hào)：細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)吞體-溶酶體途徑的信號(hào)也有不同，大體分為4類：（1）含Tyr模體：NPXY和YXX（2）含雙Leu型模體：D/EXXXL/I和DXXLL（3）其它信號(hào)模體：多數(shù)為T(mén)GN和內(nèi)吞體之間的往返蛋白（4）泛肽信號(hào)：參與內(nèi)吞時(shí)其63號(hào)Lys可被多泛肽化；在蛋白體內(nèi)降解時(shí)是在第48號(hào)Lys上。蛋白自身固有信號(hào)標(biāo)記信號(hào)AP：銜接蛋白，指能識(shí)別泛肽并與之結(jié)合的蛋白。不同類型的AP蛋白都具有：3個(gè)相似的亞基、和；一個(gè)各自特有的亞基（AP2）、（AP1）、（AP3）和（AP4）。這些AP蛋白都和籠形蛋白相作用，以便打包和投送。三、蛋白質(zhì)壽命和限制性降解體系（一）蛋白質(zhì)降解的基本概念：生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解是重要的生理生化過(guò)程。蛋白質(zhì)降解包含的內(nèi)容是多方面的，包括：（1）食物的消化（2）細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的新陳代謝（老化蛋白的降解）（3）合成或加工過(guò)程中的“次品”的處理——質(zhì)量控制（4）作為功能調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)限制性降解（二）蛋白質(zhì)的壽命及相關(guān)規(guī)則：細(xì)胞內(nèi)絕大多是蛋白質(zhì)的降解服從一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。蛋白質(zhì)半衰期介于幾十秒到百余天之間，多數(shù)在70-80天，但并不是恒定的，而是與細(xì)胞的生理狀態(tài)相關(guān)。N-端規(guī)則：蛋白質(zhì)的壽命與蛋白質(zhì)的N-端殘基性質(zhì)有相關(guān)性。N-端aa為：D、R、L、K和F：半衰期為2-3分鐘；A、G、M和V：半衰期超過(guò)10hr(原核)；超過(guò)20hr(真核）PEST假設(shè)：含該序列的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞中會(huì)很快被降解

一些氨基酸脫羧酶中的PETS模體定位（三）蛋白質(zhì)的降解場(chǎng)所和降解體系：1。溶酶體和組織蛋白酶（cathepsin)：1.1溶酶體降解：胞外蛋白：血漿蛋白、激素蛋白、質(zhì)膜上的受體蛋白等，幾乎都是通過(guò)胞吞方式進(jìn)入溶酶體降解。自體吞噬(autophgy):內(nèi)部組分吞噬非選擇性分泌自噬(crinophy):過(guò)剩分泌顆粒降解胞內(nèi)蛋白

選擇性：由KFERQ信號(hào)介導(dǎo)，在營(yíng)養(yǎng)充足細(xì)胞中此途徑關(guān)閉，只用非選擇途徑。

溶酶體主要降解胞外和質(zhì)膜蛋白，正常情況下在胞內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)過(guò)程中不起作用。1.2組織蛋白酶：溶酶體內(nèi)的蛋白酶通常被稱為組織蛋白酶，但這些酶類也可能存在于其它組織中。包括兩類：酸性蛋白酶：包括組織蛋白酶D和E等。

D型分布較廣，多數(shù)以水溶形式存在于溶酶體，只有20%為膜結(jié)合型；E是二硫鍵結(jié)合的二聚體糖蛋白，42kDa，僅存在于淋巴樣組織、腸胃道、血細(xì)胞，溶酶體內(nèi)極少，不同組織中糖鏈結(jié)構(gòu)不同。巰基蛋白酶：包括組織蛋白酶B（二肽羧肽酶）、H（氨肽酶）、L和S（內(nèi)肽酶）等。多數(shù)分子量為24-35kDa，且分布較廣，但組織蛋白酶S僅存于與II類MHC有關(guān)的抗原提呈細(xì)胞。2。細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶和有關(guān)體系：2.1蛋白體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)依賴于ATP的蛋白酶泛肽-蛋白連接酶（E1）（E2）（E3）(proteasome)真核26S蛋白體結(jié)構(gòu)：有蓋的中空?qǐng)A桶，11×16?19S帽含有6種不同的ATP酶，特異地識(shí)別被泛肽連接的蛋白；20S核心中的兩個(gè)亞基環(huán)是蛋白降解的場(chǎng)所；環(huán)內(nèi)徑較小，因此只有松散的肽鏈才能進(jìn)入。19S帽環(huán)環(huán)環(huán)

原核細(xì)胞蛋白酶體系：在原核細(xì)胞中也存在20S蛋白酶體，如古細(xì)菌中，其結(jié)構(gòu)和大小均類似于真核。但與19S帽結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的是PAN。細(xì)菌中的HsIUV和CIpAP沒(méi)有歸屬蛋白體，但也是細(xì)胞質(zhì)中依賴于ATP的蛋白酶體系。

HsIUV

由HsIV和HsIU兩部分購(gòu)成：HsIV是6聚體，兩個(gè)六聚體構(gòu)成了中間蛋白水解區(qū)室，活性中心是Thr；而HsIU是7聚體，類似于真核的環(huán)相似，具有ATP酶活性。大腸桿菌CIpAP的CIpA（X）對(duì)應(yīng)于HsIU，具有ATP酶活性；CIpP對(duì)應(yīng)于HsIV，具有蛋白酶活性（中心為Ser）FteH是另一類需要ATP的微生物蛋白酶，為膜結(jié)合型，需要Zn2+，降解膜蛋白和一些噬菌體中與融原性有關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白時(shí)起重要作用。2.2細(xì)胞質(zhì)中依賴于鈣離子的蛋白酶胞質(zhì)中依賴于鈣離子的蛋白酶為需鈣蛋白酶（calpain)特征：一是可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合；二是富含PETS序列分類：遍在型類：可被低濃度Ca2+激活（微摩爾級(jí)）需鈣蛋白酶m類：需高濃度Ca2+激活（毫摩爾級(jí)）組織特異型：骨骼?。╬94）、胃（nCL-2）等果蠅、線蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)和一些曲霉中也發(fā)現(xiàn)類似組織特異姓的需鈣蛋白，都是單鏈蛋白酶，只有催化活性無(wú)調(diào)節(jié)鏈。2.3三邊帽蛋白酶（tricon)

是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白體系，但結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，而且特異。底物和產(chǎn)物：蛋白酶體降解的產(chǎn)物一般為3-25aa的小肽，tricon以蛋白體降解后的寡肽為自己的底物，將其進(jìn)一步降解為2-4個(gè)氨基酸大小的小肽。亞基結(jié)構(gòu)：這類酶的亞基一般由1071個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分為5個(gè)結(jié)構(gòu)域：6和7結(jié)構(gòu)域（螺旋漿狀結(jié)構(gòu)）；C1結(jié)構(gòu)域（螺旋捆）；C2（夾心結(jié)構(gòu)）和PDZ結(jié)構(gòu)域組裝：亞基先形成二聚體，3個(gè)二聚體形成一個(gè)720kDa的六聚體，酶的活性中心在六聚體的中心；六聚體還可進(jìn)一步組裝成大小和形狀都與病毒顆粒類似的二十面體，外徑55nm，內(nèi)徑37nm。六聚體俯視圖六聚體側(cè)視圖亞基(單體)結(jié)構(gòu)（7為底物入口)（6為產(chǎn)物出口)活性中心一個(gè)二聚體二十面體結(jié)構(gòu)

Tricon的催化特性：屬于Ser蛋白家族，活性中心基團(tuán)包括His746和Ser965；活性中心位于六聚體的中心部位，7是底物的入口，6是產(chǎn)物的出口。

Tricon還可以和其它因子結(jié)合，包括F1、F2和F3。

F1是由293個(gè)氨基酸構(gòu)成的脯氨酰亞氨基肽酶，可從N-端開(kāi)始切除Pro和其它疏水氨基酸（Gly和Tyr除外）；F2和F3為金屬肽酶，底物專一性與F1相反，催化帶電荷氨基酸水解。其結(jié)果作用是將tricon降解產(chǎn)物2-4肽，繼續(xù)降解為游離氨基酸，供細(xì)胞再利用。2.4胱天蛋白酶（caspase)家族

胱天蛋白酶是Cys依賴性Asp專一性蛋白酶（Cysteine-dependantAsp–specificprotease,caspase）的簡(jiǎn)稱。（活性中心必需Cys，作用位點(diǎn)為Asp專一性的）。此類蛋白酶與細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）密切相關(guān)，轉(zhuǎn)入多種細(xì)胞株，均可引起細(xì)胞凋亡，因而目前備受關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)的胱天蛋白酶不少于10種，依功能可被分為：（1）激活細(xì)胞因子的：胱天蛋白酶1、4、5；（2）引發(fā)凋亡（起始）的：胱天蛋白酶2、8、9，10；（3）凋亡執(zhí)行的：胱天蛋白酶3、6、7；人胱天蛋白酶原包括N-端肽、大亞基和小亞基以及兩個(gè)連接區(qū)大亞基的His237和Cys285為活性中心兩必需氨基酸，Cys285附近的序列非常保守，基本都是QACR/Q/G；Asp297是使活化的胱天蛋白酶切位點(diǎn)；而Asp316可被其它酶切斷裂而激活酶原；執(zhí)行凋亡的酶如胱天蛋白酶3、6、7的N端肽非常短；而起始型的如胱天蛋白酶8和10的N端肽具有死亡效應(yīng)物結(jié)合域，可以各種引發(fā)凋亡的上游分子結(jié)合；而其它胱天蛋白酶的N-端肽具有胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD），便于激活復(fù)合物的組裝N-端肽大亞基小亞基His237Cys285Asp297Asp3163。其它細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的酶降解：3.1細(xì)胞器中的蛋白酶線粒體和葉綠體中也存在特定的蛋白酶，用于降解被自由基破壞的蛋白和沒(méi)有參與組裝的游離蛋白質(zhì)亞基，保持細(xì)胞器蛋白平衡。此外還有一些基質(zhì)金屬蛋白酶，切除來(lái)自細(xì)胞質(zhì)的新生肽鏈中的前肽。3.2無(wú)蛋白酶細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的降解無(wú)蛋白酶的細(xì)胞器，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是通過(guò)將蛋白逆向運(yùn)出細(xì)胞器再降解（如ERAD），或進(jìn)入高爾基體后，以轉(zhuǎn)運(yùn)小泡形式送到溶酶體或液泡降解。（四）蛋白質(zhì)限制性酶解的生物學(xué)意義：蛋白質(zhì)限制性酶解的廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面