常用分子生物學(xué)技術(shù) 11-7 new

南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室周玨宇常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用Thepopulartechnologyinmolecularbiology:principleandapplication一、分子雜交與印跡技術(shù)二、PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用三、核酸序列分析四、基因文庫五、生物大分子相互作用研究技術(shù)六、遺傳修飾動物模型的建立和應(yīng)用主要內(nèi)容2第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

Molecularhybridization

&blottingtechnology3核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理4實(shí)質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過程5核酸分子雜交技術(shù)是依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針檢測樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核酸序列。6雜交分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段標(biāo)記核酸探針制備待測核酸樣品制備核酸探針分子雜交操作程序預(yù)雜交加入標(biāo)記核酸探針漂洗除去未參與雜交的標(biāo)記探針檢測雜交信號7（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。8帶有放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記的，且序列已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)9二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡(SouthernBlotting)（二）RNA印跡(NorthernBlotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡(WesternBlotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。10英國人Southern(1975)發(fā)明，將瓊脂糖中的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上進(jìn)行DNA分子雜交分析的方法。

Southern印跡EdwinSouthern11是經(jīng)典的RNA分析法，用于組織細(xì)胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析。過程類似于Southernblotting。

Northern印跡12Northern印跡分析原理示意圖13Nouthern印跡檢測miRNA的表達(dá)14蛋白質(zhì)水平上檢測細(xì)胞或組織中特定基因的表達(dá)活性的最常用的方法（定性和半定量分析）。Western印跡15蛋白質(zhì)樣品的制備SDS分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的Ig）最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息Westernblot基本程序161718辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗可以使加入的化學(xué)發(fā)光底物發(fā)生氧化降解，發(fā)射波長為428nm的光，并可通過X光膠片感光記錄下來。

19SDSpurifiedrecombinanthumanCK2α(重組人酪蛋白激酶2α)subunitanditsWesternblotting用已知的特異抗體檢測目的基因蛋白重組人酪蛋白激酶2α

20三種印跡技術(shù)的比較21放射自顯影照片22其他：斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA芯片(DNAchip)23斑點(diǎn)印跡(dotblotting)將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)在尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交。用途：特定基因的定性分析。2425原位雜交（insituhybridization，ISH）將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測特異的DNA或RNA序列。可對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的mRNA進(jìn)行區(qū)域定位。優(yōu)點(diǎn)：不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。26小鼠大腦皮層mRNA原位雜交細(xì)胞原位雜交27miRNA的原位雜交2829DNA芯片將多種已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于檢測細(xì)胞或組織樣品中的核酸種類的技術(shù)。3031疊加圖：綠色代表下調(diào)；紅色代表上調(diào)；黃色無差異。正常樣品Cy3標(biāo)記待測樣品Cy5標(biāo)記疊加石奕武，胡維新等：多發(fā)性骨髓瘤的基因表達(dá)譜分析，湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，28（3）：201－205321.芯片的制備

Geneprobes（cDNA、DNA）substrate

Ready-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayer33SamplecellsExtractRNAorDNA2)RTorPCRamplification3)FluorescentlabelingReferencecellsSamplereadycombineLabeledRNAorDNA(Sample)LabeledRNAorDNA(Reference)

2)1)3)1)2)3)2.基因表達(dá)譜雙色標(biāo)記343.分子雜交1)hybridizeApplysample2)rinse354.檢測分析Laser1Laser2Detector1Detector2Scanner芯片的掃描365.圖像處理Detector1Detector2False-colordifferentialimage376.圖像分析383940第二節(jié)

PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

（PolymeraseChainReaction，PCR）41聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。421971年，Khorana（美國MIT教授，1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主）：“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因?！焙怂狍w外擴(kuò)增最早設(shè)想被遺忘原因：（1）很難進(jìn)行測序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發(fā)現(xiàn)了II型限制酶，體外克隆基因已成為可能。431976年，臺籍科學(xué)家錢嘉韻（AliceChien）從黃石國家公園的嗜熱菌Thermus

aquaticus中分離出熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶。1985年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的KaryMullis發(fā)明PCR反應(yīng)，Saiki等首次應(yīng)用PCR法成功地?cái)U(kuò)增了人-珠蛋白的DNA，并應(yīng)用于鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。44451988年Saiki開始將耐熱性TaqDNA聚合酶應(yīng)用于PCR，整個反應(yīng)只加一次酶即可，擴(kuò)增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡化。1989年被譽(yù)為的“分子年”，PCR為十大科技發(fā)明之首。1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學(xué)獎。46patentsoldbyCetuscorp.toLaRochefor$300milliondependsonthermo-resistantDNApolymerase(e.g.Taqpolymerase)andathermalcycler47TheNobelPrizeinChemistry1993"forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry"MichaelSmithLaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method""forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies"485Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA一、PCR技術(shù)的工作原理55

555

5

5549Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。5030次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,82451理論擴(kuò)增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），25～30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加109倍。實(shí)際擴(kuò)增率：(１＋Ｘ)n，X為PCR的實(shí)際擴(kuò)增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。52

53

PCR反應(yīng)條件變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C54模板DNA引物TaqDNA聚合酶4種dNTP含Mg2+的緩沖液。PCR的反應(yīng)體系55DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、

rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA

（一）模板（template）56模板DNA的來源：

—微生物中提取DNA—從細(xì)胞中提取DNA：血細(xì)胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、精斑、口腔上皮細(xì)胞

—固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：

0.1～2ug/100ul體系

—PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高

—模板DNA濃度過高導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加

57（二）引物（primers）人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer58引物：決定PCR反應(yīng)的特異性PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增59基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的原則60①引物長度：

15-30bp，常用20bp左右—引物的有效長度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜—特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段61③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶

—ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)

—特別避免3′端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶6263⑤引物3′端的堿基要求嚴(yán)格配對（不能做任何修飾）—特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失?、抟?′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對擴(kuò)增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA

互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個堿基而對PCR反應(yīng)無影響

643’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記（放射性元素或非放射性物質(zhì)，如生物素、地高辛等）。65⑦引物的特異性：—引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：—每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好—引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會66引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0OligoPrimerexpressprimer3MethPrimer67（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）Thermusaquaticus68目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少69DNA聚合酶

Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（應(yīng)用最廣）其他DNA聚合酶：TthDNA聚合酶

VentDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶等70特性：熱穩(wěn)定性：92.5℃、95℃、97.5℃時，半衰期分別為130min、40min、5-6min延伸效率：75-80℃時，150個核苷酸/s校正功能：TaqDNA聚合酶沒有3’-5’外切酶活性，

Vent

、Pfu等具有3’-5’外切酶活性71（四）dNTP的質(zhì)量與濃度在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200μM，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配高濃度的dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性

72（五）PCR緩沖液（PCRbuffer）一般組成：50mMKCl,10-50mMTris-HCl（室溫PH8.3），1.5mMMgCl2

附加成分：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如Tween20，濃度0.05%）二甲亞砜（DMSO）73Mg2+濃度Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少74二、PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析75巢式PCR（nestedPCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）原位PCR（insituPCR）熒光定量PCR（qPCR）三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)76其他PCR技術(shù)名稱主要用途簡并引物擴(kuò)增法擴(kuò)增未知基因片斷巢式PCR提高PCR敏感性、特異性，可分析突變復(fù)合PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴(kuò)增未知基因組DNA單側(cè)引物PCR通過已知序列擴(kuò)增未知cDNA錨定PCR分析具有不同末端的序列增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著PCR有利于產(chǎn)物的分離cDNA末端快速擴(kuò)增擴(kuò)增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色體基因原位PCR研究表達(dá)基因的細(xì)胞比例臆斷PCR鑒定細(xì)菌或遺傳作用通用引物PCR擴(kuò)增相關(guān)基因或檢測相關(guān)病原77（一）巢式PCR（nestedPCR）TwosetsofprimersareusedintwosuccessivePCRs.78原理：先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA（complementaryDNA），再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。是一種快速、簡便、敏感性極高的檢測mRNA表達(dá)的方法。（二）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）798081（三）原位PCR技術(shù)(insituPCR)原位PCR技術(shù)就是將PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來，從而在組織細(xì)胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。

保持了兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢又彌補(bǔ)了各自的不足。是細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。82細(xì)胞或組織固定：經(jīng)固定和乙醇通透化處理后適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入；PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段；原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。83multidrugresistanceassociated-protein(mrp)genemultidrugresistanceassociatedprotein84（四）實(shí)時PCR技術(shù)(realtimePCR)實(shí)時PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。兩種方法：SYBRgreen（熒光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）。

85實(shí)時熒光定量PCR常規(guī)定量PCR技術(shù)：

—對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量

—重復(fù)性差

—半定量實(shí)時定量PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一輪循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量

86同一個樣品重復(fù)96次起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量終點(diǎn)定量起點(diǎn)定量起始DNA量是樣本中本來的量，更有意義； 終點(diǎn)DNA量經(jīng)過PCR“加工”，不是所需要的數(shù)據(jù)起點(diǎn)定量誤差小，終點(diǎn)定量誤差大87PCR方程只在指數(shù)期成立Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期平臺期y=x(1+e)n指數(shù)增長期88熒光定量PCR技術(shù)基本原理熒光擴(kuò)增曲線圖Ct值閾值標(biāo)準(zhǔn)定量曲線

89熒光擴(kuò)增曲線：每個循環(huán)收集一個熒光強(qiáng)度信號，通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到熒光擴(kuò)增曲線。90什么是CT值熒光信號有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著增長（即穿過閾值線）時的循環(huán)次數(shù)從基線到指數(shù)增長的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)半對數(shù)圖譜線性圖譜91什么是閾值（threshold）基線范圍閾值標(biāo)準(zhǔn)偏差基線信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差x10熒光域值是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15前15個循環(huán)的熒光信號為熒光本底信號92標(biāo)準(zhǔn)定量曲線CT值與起始DNA濃度的關(guān)系CT值lg起始DNA濃度CT=-klgX0+b93與DNA結(jié)合時發(fā)光游離時不發(fā)光

1.SYBRGreenI染料法SYBRGreenI是一種DNA小溝結(jié)合染料94在PCR過程中染料與DNA結(jié)合發(fā)光聚合完成聚合開始95熔解曲線

(Dissociationcurve)[導(dǎo)數(shù)圖譜][原始數(shù)據(jù)]只有染料法才需要做熔解曲線探針法沒有必要總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半的溫度稱為熔解溫度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。96染料法小結(jié)成本低：不需要探針適合初步篩查：先用SYBR篩查，再用探針法熔解曲線：鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體無模板特異性：不能分辨主帶與雜帶，是總信號不能做多重檢測：每孔只能檢測一個目標(biāo)基因靈敏度低：適合于5000拷貝以上的基因定量97

TaqMan探針的結(jié)構(gòu)3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'2.熒光標(biāo)記探針法98TaqMan探針定量原理reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.聚合probeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.鏈取代Q3'3'5'5'3'5'5'3.探針被切斷R3'5'5'3'5'5'4.聚合完成QRR=報(bào)告基團(tuán)ReporterQ=淬滅基團(tuán)Quencher3'99當(dāng)某個熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一個熒光基團(tuán)的吸收光譜重疊，且兩個基團(tuán)距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，這個過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，實(shí)際相當(dāng)于短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽。

F?rsterresonanceenergytransferthroughspace(F?rsterAnn.Phys.1948)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)100Taq酶的5’→3’外切活性101TaqManMGB探針FAM

MGB完全配對，有信號FAM

MGB一個堿基不配對，沒有信號MGB探針能夠分辨1個堿基的差別102TaqManMGB探針原理AGGCCTTGAGAGATATRGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR||||||||||||||||QQ(non-fluorescentquencher)NFQQMGB

(minorgroovebinder)NFQMGBR報(bào)告熒光非熒光淬滅基團(tuán)小溝結(jié)合物提高探針Tm值103降低背景熒光：MGB探針的淬滅基團(tuán)NFQ，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強(qiáng)度。提高Tm值，探針設(shè)計(jì)更短：MGB修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高10°C左右，使MGB探針可比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了成本，也使探針設(shè)計(jì)成功率大為提高。104兩種探針比較TAMRA0.00.20.40.60.81.01.21.40510152025303540CycleNumberRnMGBTAMRA探針：長38-mer:ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGMGB探針：長17-mer:CTGTAAGTAGATATAAC105Loop能和靶序列互補(bǔ)Stem是由互補(bǔ)序列組成分子信標(biāo)（Molecularbeacon）3.TaqMan探針的衍生形式工作原理發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針

內(nèi)部淬滅的熒光團(tuán)106RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)技術(shù)107Oligo1:FluoresceinOligo2:

LCRed640FRETProbesExcitationEmissionTransfer熒光能量傳遞雜交雙探針108探針法小結(jié)NoBlots!NoGels!既靈敏又特異：PCR與分子雜交的結(jié)合

雙倍放大：PCR放大與熒光放大的結(jié)合109110第三節(jié)

核酸序列分析

Nucleicacidsequenceanalysis111分子生物學(xué)的三大核心技術(shù)DNA序列分析—DNA測序，1977聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—DNA擴(kuò)增，1985DNA重組技術(shù)—基因克隆，1973112核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)末端合成終止法(Sanger法)DNA序列測定是基因診斷最確切的方法。113一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gilbert法)基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。114Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法

115

(Sanger雙脫氧鏈終止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′雙脫氧核苷三磷酸脫去二、DNA鏈末端合成終止法116117DNA單鏈模板

末端終止117118119雙脫氧末端終止法

讀出模板互補(bǔ)序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應(yīng)混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′

放射性標(biāo)記的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′120121122TheNobelPrizeinChemistry1980"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA""fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids"PaulBergWalterGilbertFrederickSanger1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USAHarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom

123DNA自動測序法設(shè)計(jì)原理：以Sanger法為基礎(chǔ)熒光標(biāo)記物：不同顏色的熒光分別代表A、G、C、T電泳電信號顯示124

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記，平板電泳到毛細(xì)管電泳多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

單色熒光標(biāo)記平板電泳同位素標(biāo)記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T125ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′TGAATGA3′ACGCT126ABI3730DNA測序儀127DNA自動測序結(jié)果舉例128表示一個SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)出現(xiàn)了雙峰，對應(yīng)的核苷酸分別為C和T，因此該位點(diǎn)為CT雜合型，如果該位點(diǎn)只有一個峰C或者T，則該位點(diǎn)基因型為CC或TT純合型129目前所用測序技術(shù)的缺點(diǎn)1、原理基于DNA鏈終止法，故測序長度受限，目前為1000nt左右。2、測序反應(yīng)費(fèi)時費(fèi)力科學(xué)家們完成第一個人類基因組測序整整花了13年的時間，耗費(fèi)了30億美元的費(fèi)用。3、測序準(zhǔn)確度不高

DNA聚合酶造成的堿基錯配，DNA序列判讀錯誤。4、測序基于PCR反應(yīng)，需要引物，并且有些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的難于進(jìn)行PCR反應(yīng)的片段不能測序。130下一代測序技術(shù)又稱為二代測序技術(shù)，其代表技術(shù)為羅氏公司(Roche)的454測序儀(RocheGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因組分析儀(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiDsequencer)。131①可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行化分析②不需電泳，設(shè)備易于微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本

優(yōu)勢：測序策略主要基于循環(huán)芯片測序法（Cyclic-arraysequencing），即制備DNA文庫，單分子擴(kuò)增，在固相載體上形成DNA簇陣列，并行地利用DNA聚合酶或者連接酶進(jìn)行酶促反應(yīng)，同時讀取反應(yīng)產(chǎn)生的特異性熒光信號，最終得到超大量的DNA序列信息。132舉例：Solexa測序HiSeq2000133基本流程：

①將基因組DNA隨機(jī)切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面；④對固定片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，從而制成polony芯片。⑤針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進(jìn)行一系列循環(huán)反應(yīng)，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學(xué)信號而間接確定堿基序列。134Solexa測序：在一個反應(yīng)中同時加入4種核苷的標(biāo)簽，采用邊合成邊測序（SBS－sequencingbysynthesis）。完成人類基因組草圖不同測序儀的比較圖135單分子測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù)

主要策略：

①通過摻入并檢測熒光標(biāo)記的核苷酸，來實(shí)現(xiàn)單分子測序，如單分子實(shí)時技術(shù)（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學(xué)方式來實(shí)現(xiàn)單分子測序；③直接讀取單分子DNA序列信息。

136基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)137基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。138一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫的載體有噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。139cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。二、cDNA文庫140141第五節(jié)

生物大分子相互作用研究技術(shù)ThemethodofProtein-proteinandProtein-DNAintraction142酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)143標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個基于親和色譜原理的分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。

144標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖145（二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原間專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。原理：如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

146實(shí)驗(yàn)流程示意圖147缺點(diǎn)為：1.可能檢測不到低親和力和瞬間的Pr-Pr相互作用2.兩種Pr的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；3.必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。148（三）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途149酵母轉(zhuǎn)錄因子（Gal4）與BD-fusion誘餌（bait）與AD-fusion獵物或靶蛋白（preyortargetprotein）報(bào)告基因（reportergene）

LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)告基因。150ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZreportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZreportergeneGAL4UASPromoterlacZreportergeneXDNA-BDX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下會產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，所以可以輕易的檢測出LacZ基因的表達(dá)。

151酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因的表達(dá)文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。152或稱凝膠遷移變動實(shí)驗(yàn)(gelshiftassay)，最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定（EMSA）153細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物標(biāo)記的DNA片段蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物電泳遷移滯后凝膠電泳顯影滯后條帶表明DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域只能確定DNA序列中含有蛋白結(jié)合位點(diǎn)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖154染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法155原理：在活細(xì)胞狀態(tài)下用化學(xué)交聯(lián)試劑固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將