第二章 生物催化劑的發(fā)現(xiàn)13

2.1概述2.2微生物酶篩選的策略2.3微生物和酶的一般篩選方法2.4優(yōu)良菌種選育2.5從環(huán)境中微生物基因組DNA篩選酶的方法2.6生產(chǎn)用菌種的保藏2.1概述2．1．1生物催化劑的概念1生物催化劑：是生物反應(yīng)過程中起催化作用的游離或固定化酶的總稱。

2分類

結(jié)構(gòu)形式細(xì)胞酶多細(xì)胞生物體游離型催化劑固定化催化劑酶或產(chǎn)酶微生物的篩選一般產(chǎn)酶微生物篩選的原則①能夠通過發(fā)酵在相對較短的時間內(nèi)高產(chǎn)目標(biāo)酶；②微生物應(yīng)該盡可能地利用便宜和方便的原料生產(chǎn)酶；③微生物所產(chǎn)生的酶最好有比較高的專一性④所采用的微生物應(yīng)該是不產(chǎn)生有害物質(zhì)的非致病性的安全微生物⑤微生物的遺傳穩(wěn)定性應(yīng)該比較高生物催化劑篩選的主要途徑

（1）從商品酶庫中篩選

（2）從已知菌種來源和菌種保藏中心篩選生物催化劑

（3）從自然界發(fā)現(xiàn)和篩選產(chǎn)酶微生物

（4）從基因庫篩選建立有效和方便的篩選分析方法2．2．2從極端微生物中篩選極端酶的策略極端酶（extremozyme）是由極端微生物（extremophile）產(chǎn)生的酶，與之相對應(yīng)的中間型是常態(tài)微生物（mesophilicorganism）產(chǎn)生的酶。而極端微生物是在極端條件(-2～15℃，60～110℃，離子強度達5mol／LNaCl，pH＜4或pH≥9)下生存的微生物．它們所產(chǎn)生的酶在相應(yīng)的極端條件下也具有較高的穩(wěn)定性。有的極端微生物，特別是屬于古細(xì)菌(Archaea)的菌種中，存在新的代謝途徑，可能產(chǎn)生具有新的催化活力和用途的酶。經(jīng)鑒定過的絕大多數(shù)極端微生物屬于古細(xì)菌類，屬于中間型的古細(xì)菌也有發(fā)現(xiàn)。2.2.3未培養(yǎng)生物催化劑的發(fā)現(xiàn)策略未培養(yǎng)微生物（unculturedmicroorganism）

美國微生物學(xué)家Colwell的實驗室在1982年首先提出“不能培養(yǎng)微生物（nonculturablemicroorganism）”的概念，他們發(fā)現(xiàn)快速生長的霍亂弧菌和大腸桿菌移植到無營養(yǎng)料的鹽水中，經(jīng)長時期的低溫保存后，細(xì)胞數(shù)不減，代謝活力不變，但在正常肉湯培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生菌落，因此他們用“活的但不能培養(yǎng)（viablebutnonculturable,VBNC)”一語描述這種潛伏狀態(tài)的細(xì)菌。

微生物資源研究和開發(fā)領(lǐng)域里的一個重大探索就是，可以采用最新的分子生物學(xué)方法，繞過菌種的分離純化這一步驟，直接在自然界中尋找有開發(fā)價值的微生物基因。把來源于未經(jīng)培養(yǎng)的微生物的DNA克隆到經(jīng)培養(yǎng)馴化的宿主生物體(即可培養(yǎng)微生物，多用大腸桿菌)中，然后用高通量篩選技術(shù)從重組的克隆里篩選為新酶編碼的基因。未培養(yǎng)微生物的發(fā)現(xiàn)又被稱為分子篩選(MolecularScreening)。2．3微生物和酶的一般篩選方法2．3．1從自然界發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶微生物采樣富集培養(yǎng)：是根據(jù)微生物的生理特點，在目的微生物含量較少時，設(shè)計一種選擇型培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，是目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種。分為分批式（搖瓶培養(yǎng)）和恒化式（連續(xù)培養(yǎng)）兩種不同的方式。分離篩選（初篩和復(fù)篩）圖2-2從自然界發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶微生物的方法富集培養(yǎng)方法可采用分批式（搖瓶培養(yǎng)）和恒化式（連續(xù)培養(yǎng)）兩種方式。分批式培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種的時間是關(guān)鍵。恒化培養(yǎng)通過改變限制性基質(zhì)的濃度來控制兩類不同菌株的比生長速率，通過改變稀釋速率進行連續(xù)富集培養(yǎng)，特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)。多糖產(chǎn)生菌的篩選:取樣特點：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株純種培養(yǎng)一類為工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多的稀釋涂布法、劃線分離法等較為粗放的方法，只能達到“菌落純”。另一類是單細(xì)胞或單孢子分離方法，可達到“菌株純”或“細(xì)胞純”。厭氧培養(yǎng)方法可分物理法、化學(xué)法、生物法和混合法等四類。常見的物理學(xué)方法包括煮沸法、空氣置換法、氣體噴射法或轉(zhuǎn)管法等?；瘜W(xué)方法包括鐵絲絨法、保險粉法、藥劑添加選擇法及焦性沒食子酸法等。生物學(xué)方法包括共生耗氧法、燕麥發(fā)芽法等?；旌戏ㄓ袇捬豕?袋)法。2．3．2生物催化劑的高效篩選高通量篩選（high-throughscreening,HTS）是近年來發(fā)展起來的一種新型篩選技術(shù)，其特點是微量、快速、靈敏、準(zhǔn)確，在短時間內(nèi)可以檢測大量的微生物。Monica和Uwe等人用熒光標(biāo)記，從而高通量地分析水解酶的合成活性。這種方法以脂肪酶和酯酶催化的乙烯酯和醇之間的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)為基礎(chǔ)。在酯合成的過程中，由于乙烯醇的醛-烯醇異構(gòu)化反應(yīng)釋放出乙醛，生成的乙醛繼續(xù)與肼1產(chǎn)生熒光衍生物2，然后用熒光技術(shù)進行定量。最終用產(chǎn)生的乙醛濃度來定量水解酶的合成活性。2．4．1自然選育自然選育（spontaneousmutation）：未經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程。復(fù)壯：狹義的復(fù)壯是一消極措施，一般指對已衰退的菌種進行復(fù)壯；廣義的復(fù)壯是一積極的措施，即在菌種的生產(chǎn)性狀未衰退前就不斷進行純種分離和生產(chǎn)性狀測定，以在群體中獲得生產(chǎn)性狀更好的自發(fā)突變株。多因素低劑量的誘變效應(yīng)：自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)以及微生物自身代謝活動中所產(chǎn)生的一些誘變物?；プ儺悩?gòu)效應(yīng)：指四種堿基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G）可以酮式或烯醇式出現(xiàn)，胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)可以氨基式或亞氨基式出現(xiàn)。從而造成錯誤配對TG，CA；但是幾率只有10-8～10-9。2．4．2誘變選育誘變育種的原理突變基因突變?nèi)旧w畸變選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如亞硝基胍(NTG)。表2-2常用的各類誘變劑物理誘變劑紫外線、快中子、X射線、γ射線、激光、等離子束等化學(xué)誘變劑2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤硫酸二乙酯（DES）、甲基硫酸乙酯、亞硝基乙基脲（EMS）、亞硝基甲基脲（NEU）、亞硝酸（NA）、氮芥（NM）、4-硝基喹啉（4-NQO）、乙烯亞胺（EI）、羥胺生物誘變劑噬菌體、轉(zhuǎn)座子紫外線的作用機制主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性，造成菌體死亡和變異。亞硝基胍是亞硝基烷基類化合物的一種，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到12％一80％的營養(yǎng)缺陷型菌株，故有超誘變劑之稱。通常在濃度為300μg／mL，溫度為28℃和時間為60分鐘的條件下進行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。

誘變育種的基本方法誘變育種誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變菌株篩選抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變菌株篩選組成型突變菌株篩選抗性突變菌株篩選出發(fā)菌株的選擇誘變劑種類和劑量的選擇誘變劑使用方法的選擇2．5從環(huán)境中微生物基因組DNA篩選酶的方法從土壤和水樣中提取DNA土樣→分離去除細(xì)菌→分離收集DNA片段→用限制酶剪切DNA→PCR擴增→克隆到（Bacterialartificialchromosome，）BAC載體內(nèi)→轉(zhuǎn)化培養(yǎng)微生物（大腸桿菌）→篩選轉(zhuǎn)化株→功能基因→新酶土壤微生物DNA文庫的構(gòu)建

2.6生產(chǎn)用菌種的保藏目的：提高菌種存活率，減少菌種的變異，保持原來優(yōu)良的生產(chǎn)性能。原理：根據(jù)菌種的生物生理、生化特點，人工地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于不活潑狀態(tài)，生長繁殖處于休眠狀態(tài)。保藏時首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體（孢子、芽孢等），其次是要創(chuàng)造一個最有利于休眠的環(huán)境，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，以達到降低其代謝活動，延長保存期的目的。

菌種保藏的方法：斜面保藏法、礦物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷凍干燥法、冷凍法、液態(tài)真空干燥法、瓊脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麥粒保藏法、無水硅膠保藏法。

（1）砂土管保藏法利用土壤顆粒對微生物起保護作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制備和真空抽干兩步。適用菌種：產(chǎn)孢子的微生物，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌（奈氏球菌、弧菌、假單胞桿菌）以及酵母不適用。（2）真空冷凍干燥法先在菌懸液加入保護劑（如：脫脂牛奶、血清等）然后在較低溫度下使成凍結(jié)狀態(tài)，最后減壓抽干。

特點：它是菌種保藏中最有效的一種方法。保存期可達一年至數(shù)十年之久，并且存活率高，變異率低。單使手續(xù)麻煩，需要一定的設(shè)備。

適用菌種：對于不長孢子或長的很少孢子的真菌保藏效果不佳。曲法保藏：將麩皮與水按比例混合，滅菌后接入菌種，待孢子長成后即為成曲。將試管放入盛有氯化鈣的干燥器中，干燥后低溫保藏。適用于有大量孢子的霉菌和某些放線菌的保藏。麥粒保藏法：麥粒滅菌后接入菌液，培養(yǎng)有菌絲或孢子時，置通風(fēng)、避光、干燥處保藏。適用于一些放線菌、芽孢桿菌、酵母的保藏。無水硅膠保藏法：將細(xì)胞懸浮液和等體積的脫脂滅菌牛奶混勻，加入裝有無水硅膠的試管中，然后將試管放于干燥器內(nèi)，室溫或4℃保藏。對于細(xì)菌和真菌效果都較好。防止菌株衰退的措施菌種退化：一般都把菌株的生活力、產(chǎn)孢子能力的衰退和產(chǎn)物產(chǎn)量的下降統(tǒng)稱為退化。衰退的可能原因（1）、基因突變:回復(fù)突變（2）、分離現(xiàn)象（3）、代謝失調(diào)菌種退化的鑒別①單位容積發(fā)酵液的酶活力單位；②瓊脂平皿上的單菌落形態(tài)；③