第八章 典型發(fā)酵過程的特性與工業(yè)控制1

發(fā)酵工程精品課程http:///jpkc/fjgc華東理工大學(xué)·生物工程學(xué)院

第八章典型培養(yǎng)過程傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)重組菌培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)前面已講述很多，本章著重在后兩方面的介紹典型培養(yǎng)過程http:///jpkc/fjgc第一節(jié)基因工程菌培養(yǎng)一、概述基因工程菌生產(chǎn)的主要產(chǎn)品有二類，蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)。非蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以通過代謝工程細(xì)胞來獲得，這些細(xì)胞插入編碼酶的DNA，產(chǎn)生新的途徑或增強(qiáng)某一途徑，從而得到新的化合物或增加產(chǎn)量。現(xiàn)代基因工程重點(diǎn)在蛋白質(zhì)產(chǎn)物上，主要產(chǎn)品如下：典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc細(xì)胞因子、疫苗、酶典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc產(chǎn)品最主要的用于人的治療，此外還有用于畜牧業(yè)、食品或工業(yè)用的生物催化劑。用于注射用的治療蛋白要求高度純化，由于病人可能產(chǎn)生的強(qiáng)的免疫反應(yīng)或副作用是災(zāi)難性的。有的蛋白轉(zhuǎn)譯后還要進(jìn)行修飾，如糖基化、磷酸化后才有活性。治療蛋白最主要的是保證產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，降低成本并不重要，由于這些產(chǎn)品大多用量很小，價格高，附加值高。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc二、宿主-載體系統(tǒng)

構(gòu)建基因工程菌，必須選擇宿主和表達(dá)系統(tǒng)，一般希望翻譯后的處理要簡單，如果用于食品要考慮宿主菌是否列入FDA表中，列入的認(rèn)為是安全的菌。常用的宿主系統(tǒng)有：大腸桿菌

G+細(xì)菌低等真核細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc1、大腸桿菌如果產(chǎn)品翻譯后不需要修飾，大腸桿菌是最普遍選用的宿主。優(yōu)點(diǎn)：人們對大腸桿菌的生理學(xué)和遺傳學(xué)背景了解得比其他任何生物深。有利于進(jìn)行復(fù)雜的基因操作；大腸桿菌有相當(dāng)高的生長速率，并能長到高細(xì)胞濃度（50g/l）；大腸桿菌能生長在簡單的便宜的培養(yǎng)基上。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc這些因素給大腸桿菌許多經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢。但大腸桿菌不是完美的宿主。主要問題是大腸桿菌分泌(secretion)的蛋白通常在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)這些蛋白達(dá)到高濃度時，會被水解或形成不溶的包含體。其中主要是外源蛋白，但也含有其它細(xì)胞物質(zhì)。包含體中的蛋白是不折疊的，不折疊的蛋白沒有生物活性，必須重新溶解并使它復(fù)性。大量的外源蛋白的產(chǎn)生會觸發(fā)熱沖擊響應(yīng)。熱沖擊調(diào)節(jié)子的一種響應(yīng)是增加蛋白水解酶的活性。在一些情況下，細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶是使蛋白的降解速率幾乎等于產(chǎn)生的速率。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc2、G+細(xì)菌枯草桿菌是可替代大腸桿菌的菌種，它是G+菌，它沒有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的這一性質(zhì)對生產(chǎn)非常有吸引力。然而枯草桿菌有許多問題妨礙它在商業(yè)上的采用。主要是枯草桿菌產(chǎn)生大量的蛋白酶，會很快降解產(chǎn)物。而且枯草桿菌基因構(gòu)建比大腸桿菌困難，質(zhì)粒穩(wěn)定性也比較差，所以在使用上有較大的限制，典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc3、低等真核細(xì)胞酵母菌釀酒酵母是第一個被人利用的生物，它的最大生長速率是大腸桿菌的25%，酵母比最大的細(xì)菌大，容易從發(fā)酵液中回收。酵母有簡單糖基化能力和分泌蛋白的能力。這些是它的優(yōu)點(diǎn)。但酵母達(dá)到高表達(dá)水平比大腸桿菌困難，外源蛋白分泌到胞外也有限，現(xiàn)在發(fā)展了其他的酵母如甲醇營養(yǎng)型酵母等。當(dāng)產(chǎn)生是外源蛋白需要復(fù)雜的糖基化和翻譯后修飾時，低等真核細(xì)胞就不能適應(yīng)，要用動物細(xì)胞組織培養(yǎng)來達(dá)到。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc4、哺乳動物細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞在表達(dá)時有正確的氨基酸排列，而且所有轉(zhuǎn)錄后處理與在整個動物中相同，在某種情況下可能轉(zhuǎn)錄后修飾有些不同但它可提供最接近于天然副本的產(chǎn)物，此外多數(shù)產(chǎn)物可以分泌到胞外。但動物細(xì)胞生長緩慢，培養(yǎng)基價格昂貴，蛋白表達(dá)水平較低。用于重組DNA生產(chǎn)蛋白的最常用的宿主是CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc三、利用基因工程菌生產(chǎn)的特點(diǎn)基因工程菌帶有外源基因，外源基因可能在質(zhì)粒上也可能整合到染色體上，這些基因可能不穩(wěn)定。丟失外源基因的菌往往比未丟失的菌生長快得多，這樣就會大大降低產(chǎn)物的表達(dá)。為了抑制基因丟失的菌的生長，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素?；蚬こ叹呐囵B(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長，生長到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc四、基因不穩(wěn)定性生產(chǎn)的目標(biāo)是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成對宿主細(xì)胞是有損害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細(xì)胞一般生長得快得多，從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株，這就導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性?；虻牟环€(wěn)定性原因：分離丟失、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)突變典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc1、分離丟失

當(dāng)細(xì)胞分裂時一個子細(xì)胞沒有接受質(zhì)粒就出現(xiàn)分離丟失。質(zhì)?？煞譃楦呖截愘|(zhì)粒（>20拷貝/細(xì)胞）和低拷貝質(zhì)粒（有時低到每個細(xì)胞一至二個拷貝）。低拷貝質(zhì)粒有專門的機(jī)制保證在子代細(xì)胞中有相等的分配，高拷貝質(zhì)粒通常很少遵循二分法分配到子代細(xì)胞。對于高拷貝質(zhì)粒，幾乎所有子細(xì)胞接受一些質(zhì)粒，也有可能有的細(xì)胞沒有接受質(zhì)粒，當(dāng)然形成無質(zhì)粒細(xì)胞的可能性是低的（每百萬細(xì)胞分裂中一個）。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc但在大的反應(yīng)器中含有非常多的細(xì)胞，總會存在無質(zhì)粒細(xì)胞，例如1000L發(fā)酵液，每毫升有109個細(xì)胞，總共就有1015個細(xì)胞，那么在這個反應(yīng)器中就含有109個無質(zhì)粒細(xì)胞。質(zhì)粒的分離丟失可能受許多環(huán)境因素影響，如溶氧、溫度、培養(yǎng)基組成和恒化器中的稀釋速率。許多質(zhì)粒也會形成多聚體，它是相同質(zhì)粒附著在一起形成一個單位。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc2、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性

除了分離不穩(wěn)定性問題外，某些細(xì)胞保留質(zhì)粒，但質(zhì)粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而不產(chǎn)生外源蛋白，減少對細(xì)胞的有害影響，這就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。如果質(zhì)粒發(fā)生突變，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長。而且由于不合成外源蛋白，生長得比原來的工程菌更快，使得在這種培養(yǎng)物中帶有改變了的質(zhì)粒占統(tǒng)治地位的菌，這種培養(yǎng)情況就是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc3、宿主細(xì)胞突變

宿主細(xì)胞的突變也會造成生產(chǎn)能力的減少。這些突變通常改變細(xì)胞調(diào)節(jié)，結(jié)果減少目標(biāo)蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表達(dá)的啟動子，利用宿主細(xì)胞的啟動子，如果宿主細(xì)胞啟動子的改變，將大大改變質(zhì)粒編碼蛋白的生產(chǎn)水平。乳糖操縱子是常用是操縱子，通過加入乳糖或它的結(jié)構(gòu)類似物（如IPTG）來啟動表達(dá)，如果乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發(fā)生突變就會阻止乳糖或乳糖的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)入細(xì)胞，從而不能啟動細(xì)胞的表達(dá)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc4、生長速率占優(yōu)勢的不穩(wěn)定性所有這三種因素的關(guān)鍵是改變了的宿主載體系統(tǒng)和原宿主-載體系統(tǒng)的生長速率不同。如果改變了的宿主載體系統(tǒng)比原來的宿主-載體系統(tǒng)有生長優(yōu)勢，那么改變了的系統(tǒng)將最終占優(yōu)勢，基因不穩(wěn)定性就出現(xiàn)。表達(dá)的誘導(dǎo)基因工程菌的產(chǎn)物表達(dá)需要誘導(dǎo)，誘因主要有：溫度誘導(dǎo)、乳糖或乳糖結(jié)構(gòu)類似物誘導(dǎo)、氧饑餓誘導(dǎo)、葡萄糖饑餓誘導(dǎo)、甲醇誘導(dǎo)等。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc五、重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)策略關(guān)鍵點(diǎn)：高密度、高表達(dá)菌密度的測定：光密度（OD值或A值）在波長600～660菌生長的障礙是重組菌攜帶外源基因，加重代謝負(fù)擔(dān)，生長緩慢重組蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌體內(nèi)合成后就會造成積累。高表達(dá)的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白對菌體有害，對細(xì)胞生長有抑制作用，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞中毒或死亡,因此工程菌的比生長速率往往遠(yuǎn)小于宿主菌。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc高表達(dá)的障礙是：外源基因的不穩(wěn)定，造成表達(dá)的下降。高生長速率與高表達(dá)之間的矛盾乙酸的產(chǎn)生蛋白的降解典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc高密度培養(yǎng)的措施分批補(bǔ)料培養(yǎng)以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，吸取了連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可消除高濃度底物對細(xì)胞生長的抑制作用，還可彌補(bǔ)低濃度底物限制細(xì)胞生長的缺陷，從而有效地控制了菌體的生長過程。因此，要實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)，最常用和最有效的方法就是分批補(bǔ)料流加培養(yǎng)法。現(xiàn)在常用的是反饋補(bǔ)料培養(yǎng)。有幾種反饋控制控制基質(zhì)濃度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生長速率的葡萄糖流加典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc1、控制基質(zhì)濃度流加用專門的電極維持基質(zhì)濃度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖為例，用葡萄糖電極檢測發(fā)酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖電極通過反饋系統(tǒng)與補(bǔ)糖單元相連。當(dāng)葡萄糖濃度在設(shè)定值之上，糖閥關(guān)閉；當(dāng)葡萄糖濃度由于菌體消耗低于設(shè)定值時，糖閥開啟，葡萄糖以一定速率加入。這樣，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效應(yīng)，達(dá)到很高的細(xì)胞濃度。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc2、恒pH流加大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上生長，pH會上升。這是由于菌體分解LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，造成氨積累的原因。因此用葡萄糖代替酸液進(jìn)行恒pH流加。實(shí)驗(yàn)通過pH反饋控制系統(tǒng)流加葡萄糖，使pH恒定，結(jié)果推遲了比生長速率的降低時間，細(xì)胞密度是無流加的2倍。可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氫氧化鈉堿液，同時流加氨水和葡萄糖。這種方法的缺點(diǎn)是葡萄糖濃度往往不易控制，容易產(chǎn)生乙酸，對某些工程菌不適宜。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc3、恒溶氧流加用復(fù)膜氧電極來控制補(bǔ)糖。當(dāng)培養(yǎng)液的氧飽和百分?jǐn)?shù)高于控制點(diǎn)，糖閥開啟，以一定速率補(bǔ)糖。加入的糖被菌利用則需要更多的氧，從而減少氧飽和百分?jǐn)?shù)，引起讀數(shù)下降。當(dāng)讀數(shù)下降到控制點(diǎn)以下，糖閥關(guān)閉，需氧就會隨之減少，氧的飽和百分?jǐn)?shù)逐漸上升，從而達(dá)到供需平衡。Konstantinov等進(jìn)一步發(fā)展了這種方法，用DO-state法間歇流加葡萄糖，通過控制溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速及糖流加速率，使乙酸維持在低濃度，從而獲得高密度和高表達(dá)典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc4、控制比生長速率的葡萄糖流加菌體的比生長速率與代謝產(chǎn)物的表達(dá)密切相關(guān)。比生長速率太大，超過某一值，易產(chǎn)生乙酸，這一比生長速率值稱為菌體的乙酸產(chǎn)生臨界比生長速率。通過考察得出最優(yōu)比生長速率，控制溶氧、轉(zhuǎn)速、補(bǔ)糖來控制比生長速率。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc六、生長與表達(dá)的影響因素不同發(fā)酵條件下工程菌發(fā)酵結(jié)果

通氣量攪拌轉(zhuǎn)速DOpHOD600

誘導(dǎo)時間菌體濕重蛋白量111501.87.00.741.913.8%22250742.0816.7%33500462.1018.2%435004.07.00.8362.2726.4%535003.67.02.4465.1858.9%*鯉魚生長激素基因工程菌典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc1、溶氧濃度對工程菌發(fā)酵的影響在鯉魚生長激素基因工程菌的發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵液的溶氧為1.8~2.6ppm/L時，菌體濕重為1.9~2.08g/L外源基因表達(dá)量為13.8%~16.7%，而當(dāng)溶氧值提高到4.0ppm/L時菌體濕重為2.27g/L外源基因表達(dá)量為26.4%。在誘導(dǎo)表達(dá)期間，要維持外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯，細(xì)胞需要大量的能量代謝以促進(jìn)呼吸作用。因此通過增大通氣量和提高攪拌轉(zhuǎn)速以保證較大的溶氧值，不僅提高工程菌的生長而且有利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc2、pH值對工程菌生長和表達(dá)的影響在相同通氣量和攪拌速度下，pH值對不同菌群生長影響不大，而對外源蛋白表達(dá)有一定影響。由于工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)工藝，前期為菌體生長階段，后期為蛋白誘導(dǎo)表達(dá)階段。偏堿性的pH對外源蛋白的表達(dá)不利，因此，表達(dá)開始要調(diào)節(jié)pH在6.8-7.0之間，以保證外源蛋白的高水平表達(dá)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc3、誘導(dǎo)時間對外源蛋白表達(dá)的影響誘導(dǎo)時間：加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時間隨著誘導(dǎo)時間的延長，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。誘導(dǎo)時間對酶表達(dá)水平和活力的影響誘導(dǎo)時間酶活力酶表達(dá)水平

00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc4、誘導(dǎo)時機(jī)對表達(dá)的影響以天冬酰氨酶表達(dá)為例，見表。在A600=0.295*10時生長速度比較快，這時菌體進(jìn)入誘導(dǎo)狀態(tài)，酶蛋白的積累加快，酶活和表達(dá)水平都較高。而菌體進(jìn)入對數(shù)期后期，由于發(fā)酵液中營養(yǎng)的消耗，氧氣的缺乏及代謝產(chǎn)物的積累，使菌體的生長速度明顯受到抑制。在此狀態(tài)下誘導(dǎo)，表達(dá)顯然受到影響。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc誘導(dǎo)時機(jī)對酶表達(dá)水平和活力的影響生物量（A600）酶活力酶表達(dá)水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc5、乙酸對生長和表達(dá)的影響（1）乙酸的產(chǎn)生及抑制作用機(jī)理當(dāng)葡萄糖加入量超過菌體生長和二氧化碳產(chǎn)生所需要量或在缺氧的條件下便會產(chǎn)生大量的乙酸，特別是在培養(yǎng)時間較長的高密度發(fā)酵過程中，問題更為嚴(yán)重。乙酸的產(chǎn)生與細(xì)胞中的電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)有關(guān)。Han認(rèn)為細(xì)菌在低比生長速率下通過氧化代謝的作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化的需求，不會產(chǎn)生乙酸，而在髙比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc乙酸的生成需要兩個關(guān)鍵性的酶，磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它們催化葡萄糖代謝中從乙酰輔酶A生成乙酸的兩步酶促反應(yīng)。EL-Mansi和Luli假設(shè)的乙酸抑制機(jī)理是：乙酸在中性pH環(huán)境中以離子化（CH3COO－）和質(zhì)子化（CH3COOH）兩種形式存在，質(zhì)子化的乙酸具有弱的親脂性可以穿過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)（pH7.5）解離成CH3COO-和H＋，這樣就降低了膜內(nèi)的pH值，使膜內(nèi)外的pH差減小，減弱了質(zhì)子的推動力，產(chǎn)生的能量就被大大減少，擾亂了細(xì)胞的正常代謝和生理活性。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc（2）減少乙酸積累的對策宿主菌不同的宿主產(chǎn)生乙酸不同，可通過誘變使乙酸生成途徑中的兩個關(guān)鍵酶，有一個突變了或活性降低了，使乙酸合成受阻。培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成能影響乙酸的產(chǎn)生，特別是碳源的含量影響最大。在基本培養(yǎng)基中大腸桿菌產(chǎn)生的乙酸比在復(fù)合培養(yǎng)基中產(chǎn)生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，Han等在培養(yǎng)基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）減輕了乙酸的抑制作用，提高了重組菌的生長速率和重組蛋白的產(chǎn)率。Klemam等研究了培養(yǎng)基pH值對產(chǎn)生乙酸的影響，發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌W3200在葡萄糖濃度為5g/L、pH6.0的培養(yǎng)基中乙酸生成量為6g/L.而pH7.5為12g/L。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc降低比生長速率細(xì)菌比生長速率高，乙酸的比生成速率就高，一般來說，在合成培養(yǎng)基中，當(dāng)重組菌的生長速率超過某個臨界值便產(chǎn)生乙酸。在連續(xù)培養(yǎng)中，當(dāng)稀釋速率超過0.2h－1才能檢測到乙酸的存在。較低的比生長速率雖然產(chǎn)酸少，但同時對產(chǎn)物表達(dá)不利，因此選取合適的比生長速率才能達(dá)到高密度、高表達(dá)發(fā)酵。降低培養(yǎng)溫度將溫度從370C降低到26-300C可以降低菌體對營養(yǎng)物的吸收率，從而減少有機(jī)酸的形成。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc透析培養(yǎng)在重組菌的培養(yǎng)過程中可以利用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中有害物質(zhì)，降低乙酸的含量從而實(shí)現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵。Lee等用中空纖維膜過濾裝置除去乙酸，可以在較高的葡萄糖濃度下培養(yǎng)重組菌而得到較高的密度限制性流加葡萄糖利用葡萄糖為碳源培養(yǎng)重組大腸桿菌時要控制其濃度在較低的范圍內(nèi)，減少乙酸的生成。目前大多數(shù)高密度發(fā)酵均采取了限制性流加葡萄糖的方法利用反饋的參數(shù)，如pH，μ，OUR,CER作為控制對象，和葡萄糖流加相關(guān)聯(lián)，控制流加量，使培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度限定在較低水平。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc七、甲醇營養(yǎng)型酵母的生長和表達(dá)（一）酵母作為宿主菌的優(yōu)點(diǎn)單細(xì)胞低等真核生物，易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作具有真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后加工的功能，具有適合于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)分泌外源蛋白質(zhì)到培養(yǎng)液中，利于純化。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc釀酒酵母最先內(nèi)用來作為外源基因的表達(dá)宿主菌之一，由于人們對釀酒酵母（S.Cerevisiae）的遺傳學(xué)和生理學(xué)背景了解得多，及其表達(dá)的安全性。但釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)也存在一些問題：一是缺乏強(qiáng)有力的嚴(yán)格調(diào)控的啟動子。目前一些常用的啟動子很難精確控制或需要大量昂貴的誘導(dǎo)物，如半乳糖苷酶啟動子需要半乳糖的誘導(dǎo)；二是分泌效率低，特別是對分子量大于30KD的外源蛋白幾乎不分泌；三是表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失；四是不適于高密度培養(yǎng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc（二）甲醇營養(yǎng)型酵母甲醇營養(yǎng)型酵母主要包括Candida、Torulopsis、Hansenula、Pichia。用作表達(dá)宿主株的主要是Hansenula和Pichia?；谝陨系膯栴}，人們發(fā)展了甲醇營養(yǎng)型酵母作為第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc甲醇營養(yǎng)型酵母的重要特性是能利用甲醇作為唯一的碳源和能量來源。因?yàn)榧状寄苷T導(dǎo)其表達(dá)甲醇代謝所需的酶，如醇氧化酶（AlcoholOxidase,AOX）二羥丙酮合成酶（Dihydroxy-acetonesynthase,DHAS）和過氧化氫酶（Catalase），表達(dá)的DHAS的含量甚至可達(dá)到總細(xì)胞蛋白的60-80%。而當(dāng)以葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源時，AOX幾乎不表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，AOX的表達(dá)是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，其啟動子能非常有效地控制外源基因的表達(dá)。已經(jīng)在P.pastoris染色體中鑒定了二個AOX基因（AOX1和AOX2），AOX1編碼的蛋白質(zhì)與AOX2編碼的蛋白質(zhì)有97%的同源性，但AOX1基因的啟動子（PAOX1）受甲醇強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而PAOX2則很弱。H.polymorpha染色體只有一個AOX基因，也受甲醇調(diào)節(jié)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc甲醇營養(yǎng)性酵母的另一個特點(diǎn)是甲醇代謝所需的三種酶被分揀轉(zhuǎn)運(yùn)入過氧化物酶體中，形成區(qū)域化。在葡萄糖為碳源時，菌體中只有一個或幾個很小的過氧化物酶體，而在甲醇作碳源時，過氧化物酶體幾乎占到整個細(xì)胞體積的80%，里面的蛋白質(zhì)主要AOX和DHAS。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc自1987年Gregg等首次在P.pastoris菌中表達(dá)乙型肝炎表面抗原以來，短短幾年間，至少有40多種外源蛋白在P.pastoris

和H.polymorpha中獲得表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中或聚集在胞漿，表達(dá)量最高的可達(dá)全菌蛋白的32%或每升12g產(chǎn)物。H.polymorpha表達(dá)比P.pastoris有更多的優(yōu)點(diǎn)，如更高的耐熱性（理想溫度為37-430C，而P.pastoris為300C）和在甲醇誘導(dǎo)下更快的生長速率，可減少培養(yǎng)時間，降低污染機(jī)會。H.polymorpha更適于大分子量蛋（150KD）的表達(dá)與分泌。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc為了提高外源表達(dá)蛋白在酵母細(xì)胞中的穩(wěn)定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下幾種方法：一是在培養(yǎng)液中補(bǔ)加一些富含氨基酸的組分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，提高給酵母細(xì)胞蛋白酶過量的底物，以減少目的蛋白的水解；二是由于P.pastoris能耐受較寬的pH范圍（pH3.0-7.0），因此可調(diào)培養(yǎng)液pH值抑制蛋白水解酶活性；三是改造P.pastoris表達(dá)宿主菌株，缺失基因組中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白穩(wěn)定。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc酵母細(xì)胞是真核生物，具有一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如過氧化物酶體等，它們對細(xì)胞的功能極端重要，過氧化物酶體內(nèi)不含DNA，也無蛋白質(zhì)合成機(jī)制，所有過氧化物酶體內(nèi)的蛋白都由核基因編碼表達(dá)，再轉(zhuǎn)運(yùn)入過氧化物酶體。因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中必定存在一些進(jìn)入過氧化物酶體所必須的局部信息。如果把表達(dá)的外源蛋白運(yùn)輸進(jìn)入過氧化物酶體儲存起來，不僅可使蛋白免受蛋白水解酶降解，增加其穩(wěn)定性，還可減少外源蛋白對宿主的毒害作用。一些實(shí)驗(yàn)表明，甲醇營養(yǎng)型酵母分揀外源蛋白進(jìn)入過氧化物酶體，使之區(qū)域化的信號。已鑒定出二種分揀進(jìn)入過氧化物酶體所需的靶信號PTS1和PTS2。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc由于甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)具有一些特殊的優(yōu)點(diǎn)（1）應(yīng)用AOX啟動子，轉(zhuǎn)錄效率高，易于誘發(fā)調(diào)控；（2）表達(dá)質(zhì)粒易于整合到基因組，不易丟失，適于高密度發(fā)酵，產(chǎn)量高；（3）表達(dá)產(chǎn)物分揀進(jìn)入過氧化物酶體等因此最近十幾年來，人們越來越多的應(yīng)用它作為外源基因表達(dá)的系統(tǒng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc（三）甲醇營養(yǎng)型酵母培養(yǎng)中的影響因素1、甲醇濃度對基因工程菌P.Pestoris表達(dá)rHSA的影響按搖瓶培養(yǎng)方法每24h分別補(bǔ)加甲醇使其在培養(yǎng)基中濃度為5、10、20、30、40、50g／L誘導(dǎo)培養(yǎng)96h，結(jié)果見表2(表中數(shù)據(jù)為2個發(fā)酵瓶平均值)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc在甲醇濃度為10g／L時畢赤酵母表達(dá)目的蛋白量達(dá)到最高，這可能是當(dāng)甲醇濃度小于10g／L，甲醇成為限制性底物，限制了蛋白的表達(dá)當(dāng)濃度高于20g／L時，甲酵濃度過高，對目的蛋白的表達(dá)也有抑制作用。因此，在搖瓶條件下，甲醇的最佳誘導(dǎo)濃度為10g／L。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc2、pH對基因工程菌P.Pastoris表達(dá)rHSA的影響按搖瓶培養(yǎng)方法把菌種接至用0.2mol/L的磷酸緩沖液配制好的搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中pH分別為5.43、5.72、5.84、5.98、6.29、6.59和7.05，每24h加甲醇至終濃度10g／L進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc由基因工程菌P.Pastoris表達(dá)目的蛋白和細(xì)胞光密度曲線(圖1)可以看出pH為5.84時目的蛋白表達(dá)量最高。pH為5.43時，目的蛋白基本沒有表達(dá)，但細(xì)胞光密度極大，說明在低pH值條件下，適合細(xì)胞生長而不適合目的的蛋白表達(dá)；當(dāng)pH值在5.72—7.00時，細(xì)胞光密度基本相同，而目的蛋白表達(dá)量基本是呈逐漸下降的趨勢，pH為7.05時，目的蛋白表達(dá)量明顯下降。因此，既利于P.Pastoris細(xì)胞生長又利于目的蛋白高表達(dá)的pH范圍為5.72—6.59。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc3、接種量對基因工程菌P.Pastoris表達(dá)rHSA的影響在用重組畢赤酵母生產(chǎn)人骨唾液酸蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物表達(dá)量與接種量有關(guān)。在BMGY中培養(yǎng)菌體至A600為9，離心后水洗，分別用4、2、1、1／2、1／5、1／10倍體積BMMY(1％甲醇)重懸，進(jìn)行2d的誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明產(chǎn)量隨發(fā)酵密度增大而明顯提高，重懸于1／5體積的BMMY中(相當(dāng)于菌體吸收度A600約45)的表達(dá)量最高，為0.204g／L，但增大到A600為90時，表達(dá)量有所下降(見圖2)。典型培養(yǎng)過程基因工程菌培養(yǎng)http:///jpkc/fjgc典型