原核表達試驗技術(shù)

TAKARADNA凝膠回收試劑盒目的DNA膠t夬切碎添加ElutionBufferDNA目的DNA膠t夬切碎添加ElutionBufferDNASolution先用酒精燈消毒手術(shù)刀，在酶切儀中切膠，把片段放入1.5ml管中，用槍頭攪碎。切膠:招SpinColumn安置于新15rnltubeJz1.2.3.加GM試劑溶膠：加入700--800ul左右的GM，放進45℃水浴鍋中溶膠。2.3.拿新的過濾柱和離心管，轉(zhuǎn)移溶膠后液體進過濾柱，12000rpm.1min離心，把濾液重新倒進過濾柱，同樣離心，后棄濾液。.加WB（加乙醇）清洗：向過濾柱中心加700ulWB，同樣條件下離心兩次，棄濾液，最后空離30s。.換新的1.5ml離心管，把柱子放入，加30ul的日utionBuffer/DDH2O.（注意要加在中央，不要碰壁）.離心1min，把濾液重新加入到過濾柱中，再離心，得到溶解的DNA液體，棄柱子。.保存：-20℃LB培養(yǎng)液制備（1000ml）.稱量：10g胰蛋白胨粉，5g酵母提取物，10gNacl于玻璃瓶，加DDH2O1000ml。.滅菌：把蓋子擰松，高壓蒸汽滅菌121℃，20min。.置室溫降溫，后放4℃保存。LB固體培養(yǎng)基制備.向100ml的液培中加入1.5g瓊脂粉，高壓滅菌20min。.抗生素貯存液：卡那霉素（Kan）貯存液50mg/ml、氨芐西林（Amp）貯存液100mg/ml（均經(jīng)過0.22pm濾膜過濾除菌），-20℃儲存，使用濃度卡那（k+）0.05mg/ml，氨芐（A+）0.1mg/ml。.取出培養(yǎng)液，待其溫度降至45—50℃時（不燙手），按照1:1000比例加入抗生素，充分混勻。.倒入6cm一次性培養(yǎng)皿中，靜置30—60min（等待平板冷卻）。.封口膠封口，倒置保存在4℃，期限為30D。純化PCR產(chǎn)物（膠回收）（天根試劑盒）.在紫外燈下準確切取含有目的DNA片段的凝膠（體積盡可能小），放入干凈的1.5mlEP管（預先稱取空管重量）中，稱取凝膠的重量。.按每0.1g凝膠加入100ulPC溶液的比例往EP管中加入溶液PC，50℃水浴放置約10min，期間不斷溫和晃動，確保凝膠完全溶解，此時溶液呈現(xiàn)黃色。.向吸附柱CB2（吸附柱放入收集管中）中加入500ul平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱重新放回收集管中。.將冷卻至室溫的凝膠溶解液加入吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。.向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液PW（已加入無水乙醇），靜置2min后12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，重復步驟一次。.12000rpm離心2min，盡量去除漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。.將吸附柱CB2放入一個干凈的EP管中，向吸附膜中間位置懸空滴加洗脫緩沖液EB35ul，室溫放置2min，12000rpm離心2min，收集DNA溶液。.將離心得到的DNA溶液重新加回吸附柱中并將吸附柱放入EP管中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，將DNA溶液收集到EP管中。.用超微量核酸測定儀測定DNA濃度和純度，溶液-20℃保存?zhèn)溆?。感受態(tài)大腸桿菌DH5a和BL21（DE3）的制備.將-80℃冰箱保存的DH5a和BL21（DE3）大腸桿菌甘油保存菌解凍，用酒精燈燒灼過的接種環(huán)挑取大腸桿菌，分別在兩個LB平板培養(yǎng)基（不含抗生素）上分級化線以能夠出現(xiàn)單菌落為宜），將劃線平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)。.用酒精燈燒灼過鑷尖的鑷子夾取高壓過的無菌小Tip頭，在劃線平板上挑取單菌落，接種到盛有15mlLB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中，37℃、150rpm培養(yǎng)。.培養(yǎng)4?5h時測定OD600值，當OD600值達至0.35?0.5時將盛有培養(yǎng)菌液的離心管冰浴放置停止培養(yǎng)。.依次取上述菌體培養(yǎng)液1ml于1.5mlEP管中（根據(jù)需求確定EP管數(shù)量），4℃、4000rpm離心5min,吸除上清（盡量除盡上清）。.在每個含有菌體沉淀的EP管中加入100ul冰浴預冷的SolutionA,輕輕彈動EP管使沉淀重懸。.4℃、4000rpm離心5min,吸除上清（盡量除盡上清）。.在每個EP管中加入100ul冰浴預冷的SolutionB,輕輕彈動EP管使菌體重懸。感受態(tài)大腸桿菌制作完成，可直接用于下游質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化實驗，亦可-80℃冰箱保存以備以后使用。T載體與sTim-3片段的連接、轉(zhuǎn)化.在200ul微量離心管中配制下列DNA溶液，總量為5W。隨后加入5W的SolutionI,16℃連接30min。試劑使用量pMD18-TVector1U1sTim-3片段純化回收液0.Ipiwl?0.3pmol對應(yīng)的體積JH20Upio5u】.將產(chǎn)物加入至100UlDH5a感受態(tài)細胞中，輕輕彈勻，冰浴靜置30min。同時取10ulsTim-3片段回收液加入一支含DH5a感受態(tài)細胞的EP管中作為陰性對照。.42℃加熱90s后，迅速轉(zhuǎn)移到冰浴中，靜置2-3min；后加入890ul不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫搖床中160rpm振蕩培養(yǎng)50min。.吸取200ul培養(yǎng)液（余培養(yǎng)液4℃冰箱保存?zhèn)溆茫┘拥胶蠥mp的LB固體培養(yǎng)基上，用無菌彎頭玻棒將菌液均勻涂開，室溫放置直至液體被吸收，37℃倒置培養(yǎng)過夜（12-16h）。.次日挑取單菌落轉(zhuǎn)入含0.5mlLB液體培養(yǎng)基（含Amp）的2mlEP管中，37℃、225rpm振蕩培養(yǎng)7h,產(chǎn)物置于4℃冰箱保存。.對培養(yǎng)產(chǎn)物行菌液PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定（步驟2.52）。.吸取0.3ml鑒定陽性的培養(yǎng)液加到含有15mlLB液體培養(yǎng)基（含Amp）的50ml離心管中（按1：50比例稀釋），37℃、225rpm振蕩培養(yǎng)過夜；次日提取質(zhì)粒。.對所提質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。.選取鑒定陽性的質(zhì)粒對應(yīng)的菌液送公司測序。提取重組質(zhì)粒.柱平衡：將吸附柱CP4放入收集管中，向吸附柱中加入500ul平衡液BL,12000rpm離心1min,倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中。.取過夜培養(yǎng)的菌液10ml加入15ml離心管中，10000rpm離心1min，倒掉上清，再次加入1.5ml菌液，吹打混勻后轉(zhuǎn)入一2mlEP管中，12000rpm離心1min，盡量吸除上清。.向含有菌體沉淀的離心管中加入550ul溶液P1（首次使用前先在P1溶液中加入RNase），在渦旋振蕩器上振蕩徹底懸浮菌體沉淀。.向離心管中加入550ul溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)直至菌液變得清亮粘稠（切勿劇烈振蕩，以免污染基因組DNA；所用時間不宜超過5min,以免質(zhì)粒受到破壞）。.待菌體充分裂解后，向離心管中加入770ul溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6?8次充分混勻（此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀），12000rpm離心10min使沉淀聚集于管底。.將過濾柱CS放入收集管中，然后將上一步收集的上清液分次加入過濾柱CS中（每次加入量700ml以內(nèi)），12000rpm離心2min。.小心地將離心后收集管中得到的液體分次加入已平衡的吸附柱CP4中，12000rpm離心1min,倒掉收集管中廢液，將吸附柱CP4放回收集管中。.向吸附柱CP4中加入500ul去蛋白液PD,12000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管。.向吸附柱CP4中加入600ul漂洗液PW（漂洗液PW可提前4℃冰箱或冰浴放置預冷），室溫靜置3min,12000rpm離心1min,倒掉收集管中廢液，將吸附柱放回收集管中。重復操作一次。.將吸附柱放回收集管中后12000rpm離心2min,后將吸附柱開蓋室溫放置數(shù)分鐘，以徹底去除吸附柱中殘留的漂洗液。.將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的1.5mlEP管中，向吸附膜的中間部