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第二章DNA的復(fù)制_第2頁
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文檔簡介

DNA的復(fù)制DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代;通過轉(zhuǎn)錄和翻譯,將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子,從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則。

RNA病毒的遺傳信息貯存在RNA分子,遺傳信息的流向是RNA通過復(fù)制,將遺傳信息由親代傳遞給子代;通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA,再由DNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì),這種遺傳信息的流向就豐富了中心法則的內(nèi)容。

中心法則

Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律1954年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀后修正的“中心法則”一.DNA復(fù)制概況DNA在復(fù)制時,以親代DNA的每一條單鏈DNA作模板,合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA,每個子代DNA中都含有一條親代DNA.這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。

DNA以半保留方式進行復(fù)制,是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實驗所證明。2、實驗證據(jù)(1958Meselson和Stahl):

MatthewMesselsonFranklinStahl復(fù)制叉與復(fù)制子DNA的復(fù)制是由固定的起始點開始的。一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子(replicon)。一個復(fù)制子只含一個復(fù)制起點。復(fù)制時,雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進行,所以,復(fù)制起點呈叉子形式,被稱為復(fù)制叉(Replicationfork)。復(fù)制叉(Replicationfork):DNA復(fù)制時在DNA鏈上通過解旋、解鏈和SSB蛋白的結(jié)合等過程形成的Y字型結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉.復(fù)制叉復(fù)制叉部分生物復(fù)制子的比較從復(fù)制原點到終點,組成一個能夠獨立進行復(fù)制的DNA復(fù)制單位叫復(fù)制子復(fù)制子(replicon):原核生物只有一個復(fù)制原點,整個染色體只有一個復(fù)制單位。真核生物有多個復(fù)制起始點,因此是多復(fù)制子。每個復(fù)制子在每一次細胞循環(huán)中只啟動一次。DNA復(fù)制是從DNA分子的特定位置開始的,這一位置叫復(fù)制原點(復(fù)制起始點)(大腸桿菌用ori表示,酵母ARS)。是由一些具有特定核苷酸排列順序的片段組成。富含A-T。在原核生物中,復(fù)制起始點通常為一個,而在真核生物中則為多個。

復(fù)制起點DNA復(fù)制時,以復(fù)制起始點為中心,向兩個方向進行復(fù)制。但在低等生物中,也可進行單向復(fù)制(如滾環(huán)復(fù)制)。雙向復(fù)制真核生物基因組可以同時在多個復(fù)制起點上進行復(fù)制,也就是說它們的基因組包含有多個復(fù)制子。細菌、病毒和線粒體的DNA分子都是作為單個復(fù)制子完成復(fù)制的;原核生物DNA的復(fù)制雙向復(fù)制(BidirectionalReplication)無論是原核生物還是真核生物,DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點以雙向等速復(fù)制方式進行的。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序為起點,向兩個方向等速生長前進。DNASynthesis由于DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行的,因此在復(fù)制叉附近解開的DNA鏈一條是5’→3’方向,另一條是3’→5’方向,兩個模板極性不同。所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’,為了解釋DNA的等速復(fù)制現(xiàn)象,日本學(xué)者岡崎(Okazaki)等提出了DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型(semi-discontinuousreplication)。半不連續(xù)復(fù)制Semi-discontinuousreplication岡崎片段 前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的,因而稱之為DNA的半不連續(xù)復(fù)制。

[3H]Thymidinepulse-chaselabelingandalkalinesucrosegradient:discoveryofsemi-discontinousreplication用3H脫氧胸苷短時間標記后提取DNA,得到不少平均長度為2-3kbDNA片段。用DNA連接酶溫度敏感突變株進行實驗,在連接酶不起作用的溫度下,有大量小片段累積,說明復(fù)制過程中至少有一條鏈首先合成較短的片段,然后再生成大分子DNA。由于DNA聚合酶只能以5‘→3’方向聚合子代DNA鏈,即模板DNA鏈的方向必須為3'→5'。因此,分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。DNA的半不連續(xù)復(fù)制以3′→5′方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時基本上是連續(xù)進行的,其子代鏈的聚合方向為5′→3′,這一條鏈被稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。以5′→3′方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時則是不連續(xù)的,其鏈的聚合方向也是5′→3′,這條鏈被稱為滯后鏈(laggingstrand)。由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的,因此,滯后鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時,由滯后鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小,在原核生物中約為1000~2000個核苷酸,而在真核生物中約為100個核苷酸。

二.參與DNA復(fù)制的酶雙螺旋DNA復(fù)制是DNA聚合酶催化的酶促反應(yīng)過程。DNA聚合酶只能延長已有的DNA或RNA引物鏈,不能從頭起始DNA鏈的合成;在復(fù)制叉結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi),DNA雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起,要拷貝每一條鏈都必須將雙螺旋DNA解旋并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力,這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成,DNA聚合酶不能完成這一過程;在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段的連接也是DNA聚合酶無法完成的。①DNA旋轉(zhuǎn)酶(拓撲異構(gòu)酶);②使DNA雙股鏈在復(fù)制叉解開的解旋酶;③在DNA復(fù)制前防止解開的DNA單鏈局部退火的DNA結(jié)合蛋白;④合成RNA引物的酶;⑤除去RNA引物的酶;⑥使岡崎片段共價連接的DNA連接酶1、DNA聚合酶

DNA聚合酶種類和生理功能:在原核生物中,已發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種,分別命名為DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ),DNA聚合酶Ⅱ(polⅡ),DNA聚合酶Ⅲ(polⅢ),DNA聚合酶Ⅳ(polⅣ),DNA聚合酶Ⅴ(polⅤ)。前三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與DNA復(fù)制的主要是polⅢ和polⅠ。

參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶,必須以一段具有3’端自由羥基(3’-OH)的RNA作為引物(primer),才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小,通常為1-10個核苷酸。RNA引物的堿基順序,與其模板DNA的堿基順序相配對。

RNA引物polⅠ為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì),可被特異的蛋白酶水解為兩個片段,其中的大片段稱為Klenowfragment,具有5'→3‘DNA聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

Containstwocatalyticsites,oneforadditionofdNTPsandoneforremovalofthemispaired

dNTP.Thepolymerizationsite:(1)bindstotwometalionsthatalterthechemicalenvironmentaroundthecatalyticsiteandleadtothecatalysis.(2)Monitorstheaccuracyofbase-pairingforthemostrecentlyaddednucleotidesbyformingextensivehydrogenbondcontactswithminorgrooveofthenewlysynthesizedDNA.Exonuclease

site/proofreadingsiteDNAPolymerase-palmdomainBindstotheincoming

dNTP,enclosesthecorrectpaireddNTPtothepositionforcatalysisBendsthetemplatetoexposetheonlynucleotideatthetemplatethatreadyforformingbasepairwiththeincomingnucleotideStabilizationofthepyrophosphateDNAPolymerase-fingerdomainNotdirectlyinvolvedincatalysisInteractswiththesynthesizedDNAtomaintaincorrectpositionoftheprimerandtheactivesite,andtomaintainastrongassociationbetweenDNAPolanditssubstrate.DNAPolymerase-thumbdomainpolⅢ由十種亞基組成,其中α亞基具有5′→3′DNA聚合酶活性,因而具有復(fù)制DNA的功能;而ε亞基具有3′→5′外切酶的活性,因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的,它涉及DNA的錯誤傾向修復(fù)(errorpronerepair)。當(dāng)DNA受到較嚴重損傷時,即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個酶,使修復(fù)缺乏準確性(accuracy),因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會殺死許多細胞,但至少可以克服復(fù)制障礙,使少數(shù)突變的細胞得以存活。

原核生物中的三種DNA聚合酶

在真核生物中,目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種,分別命名為DNA聚合酶α(polα),DNA聚合酶β(polβ),DNA聚合酶γ(polγ),DNA聚合酶δ(polδ),DNA聚合酶ε(polε)。參與染色體DNA復(fù)制的是polα(延長滯后鏈)和polδ(延長前導(dǎo)鏈),參與線粒體DNA復(fù)制的是polγ,polε與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補缺口有關(guān),polβ只在其他聚合酶無活性時才發(fā)揮作用。

DNA復(fù)制的保真性: 為了保證遺傳的穩(wěn)定,DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時的保真性主要與下列因素有關(guān):1.遵守嚴格的堿基配對規(guī)律;2.DNA聚合酶在復(fù)制時對堿基的正確選擇;3.對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯誤及時進行校正。

2、DNA解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白 復(fù)制過程中,復(fù)制叉在不斷前進,復(fù)制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈,為使復(fù)制能夠順利進行,就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性,使單鏈DNA處于穩(wěn)定的狀態(tài)。承擔(dān)上述任務(wù)是DNA解旋酶(DNAhelicase)和單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)。

DNA解旋酶是很多細胞過程所要求的(如核苷酸切除修復(fù)、同源重組、轉(zhuǎn)錄終止)。DNA解旋酶是利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵,解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動的一類酶的總稱(又稱解鏈酶)。解鏈酶的作用示意圖單鏈DNA結(jié)合蛋白行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能。SSB與DNA單鏈相結(jié)合,既防止核酸水解酶的作用,又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈,從而保持一種伸展狀態(tài),以保證復(fù)制順利進行。在E.coli中SSB為四聚體,對單鏈DNA有很高的親和性,但對雙鏈DNA和RNA沒有親合力。SSB與DNA結(jié)合時有協(xié)同作用,當(dāng)一個SSB與DNA結(jié)合時,就會有更多的SSB迅速結(jié)合上去擴展分布整個DNA單鏈,將DNA包被上蛋白聚合體。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)的作用為:①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在,即穩(wěn)定單鏈DNA,便于以其為模板復(fù)制子代DNA;②保護單鏈DNA,避免核酸酶的降解。

3、拓撲異構(gòu)酶天然DNA的負超螺旋雖然有利于DNA的解旋,但隨著復(fù)制的進行,復(fù)制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力,因此復(fù)制中需要DNA旋轉(zhuǎn)酶去除解螺旋酶的解鏈產(chǎn)生的扭曲張力。大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)又稱拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase),超螺旋:DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成的空間結(jié)構(gòu)(1)正超螺旋(positivesupercoil):

盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同

(2)負超螺旋(negativesupercoil):

盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反

正超螺旋:兩股以右旋方向纏繞的螺旋,在外力往緊纏的方向捻轉(zhuǎn)時,會產(chǎn)生一個左旋的超螺旋,以解除外力捻轉(zhuǎn)造成的脅變。這樣形成的螺旋為正超螺旋。負超螺旋:兩股以右旋方向纏繞的螺旋在外力向松纏的方向捻轉(zhuǎn)時,產(chǎn)生一個右旋的超螺旋以解除外力捻轉(zhuǎn)造成的脅迫。這樣形成的超螺旋為負超螺旋.正超螺旋負超螺旋天然DNA分子一般為負超螺旋負超螺旋DNA更易于局部解鏈,易于參加DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等拓撲異構(gòu)酶or溴化乙錠拓撲異構(gòu)酶or溴化乙錠DNA扭曲與雙螺旋相同(擰緊)DNA扭曲與雙螺旋相反(松開)負超螺旋松弛DNA正超螺旋3、拓撲異構(gòu)體(Topologicalisomer):具有不同連接數(shù)的相同DNA分子4、拓撲異構(gòu)酶(Topoisomerase):能夠改變DNA連接數(shù)從而改變DNA分子超螺旋水平的酶(1)拓撲異構(gòu)酶I(topoisomerase--I)作用機制:切開環(huán)狀一條鏈,連接數(shù)改變±1,不需ATP

(2)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ作用機制:切開環(huán)狀兩條鏈,連接數(shù)改變±2,需要ATP

結(jié)合到一條鏈上形成復(fù)合物切斷一條鏈形成酶和蛋白的復(fù)合體共價連接Tyrosine-5’P一條鏈穿越重新連接L=2L=3

拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseI)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ-TopII引入負超螺旋作用于雙鏈:涉及雙鏈的斷裂和連接--每次使DNA的連接數(shù)改變2DNA拓撲異構(gòu)酶每作用一次產(chǎn)生兩個負超螺旋,因此可以消除復(fù)制叉向前移動所產(chǎn)生的正超螺旋,并且復(fù)制完的兩個子代DNA雙鏈的分離也需要DNA旋轉(zhuǎn)酶的催化功能。當(dāng)加入DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素(Coumermycin),新生霉素(novobiocin),萘啶酮酸(nalidixicacid)等時均能抑制細菌DNA的合成??梢奃NA旋轉(zhuǎn)酶是DNA復(fù)制所必不可少的。4、引發(fā)酶與引物RNA的合成 DNA的半不連續(xù)復(fù)制中,DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成,只能在已有引物的3‘端向前延伸。迄今為止,人們所發(fā)現(xiàn)的引物大多為一段RNA,其長度和序列隨著基因組的種類而表現(xiàn)出不同,在大多數(shù)情況下為1~10個核苷酸。催化RNA引物(RNAprimer)合成的酶叫引發(fā)酶(primerase)。引發(fā)酶識別DNA單鏈模板特異順序,以核糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產(chǎn)生3'-OH,為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。引物與典型的RNA(如mRNA)不同,它們在合成以后并不與模板分離,而是以氫鍵與模板結(jié)合。RNA引物必須去除以完成DNA復(fù)制!RNaseHDNApolymeraseDNAligase5、DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成,而使兩段DNA連接起來。DNA連接酶催化的條件是:①需一段DNA片段具有3'-OH,而另一段DNA片段具有5'-Pi基;②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中,即其中有一條鏈是完整的;③需要消耗能量,在原核生物中由NAD+供能,在真核生物中由ATP供能。三、DNA復(fù)制過程復(fù)制的起始(initiation)DNA鏈的延伸(elongation)復(fù)制的終止(termination)1.DNA復(fù)制的起始復(fù)制起始原點DNA雙螺旋的解旋復(fù)制的引發(fā) DNA聚合酶只能延長已存在的DNA鏈,而不能從頭合成DNA鏈,那么,新DNA的復(fù)制是怎樣開始的呢?大腸桿菌(E.coli)的OriC復(fù)制原點參與DNA復(fù)制起始和引發(fā)的蛋白質(zhì)DNA解旋酶(DNAhelicase)

催化DNA雙鏈的解鏈過程。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein):

以四聚體形式存在于復(fù)制叉處,只保持單鏈的存在,并不能起解鏈作用。DNA拓撲異構(gòu)酶(DNAtopoisomerase)

消除DNA雙鏈的超螺旋堆積。引物酶(primase)

合成一小段RNA引物,為DNA新鏈的合成提供3’-OH末端。2.DNA鏈的延伸DNA鏈的延伸需要的蛋白質(zhì):DNA聚合酶滑動夾(SlidingDNAclamp)RNA酶(RNaseH等) 在復(fù)制完成后切除RNA引物。DNA連接酶(DNAligase) 通過生成3’5’-磷酸二酯鍵連接兩條DNA鏈。DNApolymerasecatalyzeDNAsynthesisDNAStructureofaslidingDNAclampSlidingDNAclampsencirclethenewlyreplicatedDNAproducedbyanassociatedDNApolymerase.SlidingclampsdramaticallyincreaseDNApolymeraseprocessivity(持續(xù)合成能力)RemovalofRNAprimersfromnewlysynthesizedDNARNA引物的切除3.

復(fù)制的終止當(dāng)復(fù)制叉前移,遇到20bp重復(fù)性終止子序列(Ter)時,Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移,等到相反方向的復(fù)制叉到達后在DNA拓撲異構(gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體,釋放子鏈DNA。四.DNA復(fù)制的幾種主要方式DNA復(fù)制通常是從雙螺旋的特定位置——復(fù)制原點(ori)開始,一般是富含A-T的區(qū)段,該區(qū)段的雙鏈DNA具有較強的呼吸作用(breathing),是經(jīng)常瞬間處于打開形成單鏈的區(qū)段(frequentlyopeningregion),由此產(chǎn)生的瞬時單鏈與SSB蛋白結(jié)合,對復(fù)制的起始十分重要。原核生物的復(fù)制原點通常為一個,而真核生物則有多個特定的復(fù)制原點。根據(jù)DNA合成的起始方式,復(fù)制可分為重新起始與共價延伸兩種類型:前者是前導(dǎo)鏈從新開始,也叫復(fù)制叉式復(fù)制;后者是先導(dǎo)鏈共價結(jié)合在一條親代鏈上,也叫滾環(huán)式復(fù)制。復(fù)制主要以雙向等速進行,如原核生物E.coli等及真核生物DNA的復(fù)制;部分是單方向進行,如質(zhì)粒ColE1的復(fù)制;或以不對稱的雙向方式進行,如線粒體DNA的復(fù)制。1、復(fù)制叉式復(fù)制

(一)、復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始階段,由下列兩步構(gòu)成。

1、預(yù)引發(fā):(1).解旋解鏈,形成復(fù)制叉:由拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶作用,使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開,堿基間氫鍵斷裂,形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在兩條單鏈DNA上,形成復(fù)制叉。DNA復(fù)制時,局部雙螺旋解開形成兩條單鏈,這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。對于雙向復(fù)制而言,形成的兩個復(fù)制叉向相反方向行進,每個復(fù)制叉上的兩條DNA鏈均被拷貝。(2).引發(fā)體組裝:由蛋白因子(如dnaB等)識別復(fù)制起始點,并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。2、引發(fā):在引物酶的催化下,以DNA為模板,合成一段短的RNA片段,從而獲得3'端自由羥基(3'-OH)。

(二)、復(fù)制的延長

1、聚合子代DNA: 由DNA聚合酶催化,以3′→5′方向的親代DNA鏈為模板,從5′→3′方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中,參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ;在真核生物中,是DNA聚合酶α(延長滯后鏈)和DNA聚合酶δ(延長前導(dǎo)鏈)。

2、引發(fā)體移動: 引發(fā)體向前移動,解開新的局部雙螺旋,形成新的復(fù)制叉,滯后鏈重新合成RNA引物,繼續(xù)進行鏈的延長。

(三)、復(fù)制的終止

去除引物,填補缺口: 在原核生物中,由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物,并由該酶催化延長引物缺口處的DNA,直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。 在真核生物中,RNA引物的去除,由一種特殊的核酸酶來水解,而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。

連接岡崎片段: 在DNA連接酶的催化下,形成最后一個磷酸酯鍵,將岡崎片段連接起來,形成完整的DNA長鏈。

ThecompositionoftheDNAPolIIIholoenzyme2、滾環(huán)式復(fù)制θ型復(fù)制是雙鏈環(huán)狀DNA以復(fù)制叉方式進行復(fù)制的特例。某些雙鏈環(huán)狀DNA或單鏈DNA的復(fù)制型(replicationform,RF),在復(fù)制時,以滾環(huán)復(fù)制方式進行。滾環(huán)復(fù)制是在一條斷裂的親本鏈的3'-OH端不斷地發(fā)生DNA聚合作用,因而又稱共價延伸。由于斷開的3'-OH端仍然與其互補鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu),因而沒有合成RNA引物的必要。合成先導(dǎo)鏈的模板也總是呈環(huán)狀。滾環(huán)復(fù)制是單向復(fù)制的特殊方式,是某些噬菌體DNA復(fù)制的共同方式,E.coli噬菌體(如φX174、M13)的環(huán)形雙螺旋DNA復(fù)制時,僅僅以1條鏈作為模板合成若干環(huán)形DNA分子拷貝;某些雙鏈DNA的合成也可以通過滾動環(huán)的復(fù)制方式進行,例如,噬菌體λ復(fù)制的后期以及真核生物如非洲爪蟾卵母細胞中rDNA基因的擴增都是以這種方式進行的。Rollingcirclesproducemultimersofareplicon線粒體DNA的D-嚕噗復(fù)制雙鏈環(huán)狀DNA中的一條前導(dǎo)鏈已經(jīng)引發(fā)并開始合成,與其模板形成雙鏈結(jié)構(gòu),而另一條親本鏈則被前導(dǎo)鏈置換出來成為單鏈狀態(tài)。這種由一條單鏈和一條雙鏈組成的三元泡狀結(jié)構(gòu),叫做置換嚕噗或D-嚕噗(displacementloop)。只有前導(dǎo)鏈將另一條親本鏈(即滯后鏈的模板)的特別序列置換出來成為單鏈形式,才能產(chǎn)生滯后鏈前體的引發(fā)并合成其互補鏈。DNA復(fù)制的不同方式

3、真核生物端粒的形成:端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分,通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成,可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。

端粒結(jié)構(gòu)Telomeres端粒是線狀染色體末端的DNA重復(fù)序列。端粒是線狀染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu),在正常人體細胞中,可隨著細胞分裂而逐漸縮短。把端粒當(dāng)作一件絨線衫袖口脫落的線段,絨線衫像是結(jié)構(gòu)嚴密的DNA,排在線上的DNA決定人體性狀。與人頭發(fā)的直與曲,眼睛的藍與黑,人的高與矮等等,甚至性格的暴躁和溫和有關(guān)。原核生物的末端問題在原核生物中:如果是環(huán)狀的DNA雙鏈雙向復(fù)制,RNA引物切除后不管是前導(dǎo)鏈還是滯后鏈都可以通過3’末端的延伸首尾相連把GAP補上(如大腸桿菌);不存在末端問題如果是線狀的DNA雙鏈,會在復(fù)制時從線狀轉(zhuǎn)換成環(huán)狀或發(fā)夾結(jié)構(gòu)來避開末端復(fù)制的問題(如T4噬菌體和草履蟲的線狀線粒體DNA)。在真核生物中:對于前導(dǎo)鏈來說,因為真核生物的復(fù)制是從復(fù)制叉向兩個方向復(fù)制的,前導(dǎo)鏈的切去的RNA的部分,可以被復(fù)制叉另外一個方向的后隨鏈補平,不存在末端問題而對于滯后鏈來說,其5’端就是通過端粒酶來完成末端復(fù)制了。真核生物的末端問題只有后隨鏈才有末端問題,前導(dǎo)鏈不存在末端問題,為什么?端粒的結(jié)構(gòu)與功能1972年JamesWatson提出了“復(fù)制末端問題”,復(fù)制DNA的DNA多聚酶并不能將線性染色體末端的DNA完全復(fù)制。也就是說在線性DNA復(fù)制時,DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA(一段端粒)不復(fù)制。端粒DNA復(fù)制的特點是在每次DNA復(fù)制中,每條染色體的3'端均有一段DNA無法得到復(fù)制,隨著細胞每次分裂,染色體3'一末端將持續(xù)喪失50-200bp的DNA,因而細胞分裂具有一定的限度,即分裂壽命。所以端粒的長度可作為細胞的“分裂時鐘”,反映細胞分裂能力。端粒酶的結(jié)構(gòu)端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體,由RNA和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成,是RNA依賴的DNA聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNA的酶,通過明顯的模板依賴方式每次添加一個核苷酸。端粒酶實質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)端粒酶結(jié)合蛋白(TEP)端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)端粒酶結(jié)合蛋白(TEP)端粒酶RNA是第一個被克隆的端粒酶組分。端粒酶RNA含有與同源端粒DNA序列TTAGGG的互補序列,核糖核酸酶H切割此模板區(qū),能使體外消除端粒酶延長端粒的功能。人類TERT(hTERT)基因為一單拷貝基因,定位于5p15.33,具有7個保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元T。破壞TERT將消除端粒酶活性并致端??s短。TEP1、生存動力神經(jīng)細胞基因(SMN)產(chǎn)物、hsp90、PinX1、Est1p和Est3p

線性DNA在復(fù)制完成后,其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶(telomerase)的催化下,進行延長反應(yīng)。端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體,它可以其RNA為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進行延長。

端粒酶(telomerase)的作用機制轉(zhuǎn)座

TranspositionDNA的轉(zhuǎn)座基本概念:轉(zhuǎn)座子最先由BarbaraMcClintock于20世紀40年代在玉米遺傳學(xué)研究時發(fā)現(xiàn)的。DNA的轉(zhuǎn)座:由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座子(transposon,Tn)是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。轉(zhuǎn)座子存在于所有生物體內(nèi),人類基因組中有約35%以上的序列為轉(zhuǎn)座子序列,其中大部分與疾病有關(guān)。轉(zhuǎn)座子分為兩大類:1.轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征1.插入序列(insertionalsequence,IS)2.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)最簡單的轉(zhuǎn)座子,不含任何宿主基因。它們是細菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個細菌細胞常帶有少于10個IS序列。轉(zhuǎn)座子常被定位到特定的基因,造成該基因突變。插入序列(IS因子)IS因子的特征:很小的DNA片段末端具有倒置重復(fù)序列(反向互補)復(fù)制宿主靶位點DNA(4-15bp)可獨立存在,帶有介導(dǎo)自身移動的蛋白,可作為其他轉(zhuǎn)座子的組成部分.特征:復(fù)合型轉(zhuǎn)座子兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列,表明IS序列插到功能基因的兩端就可能產(chǎn)生復(fù)合型轉(zhuǎn)座子。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子是一類帶有某些抗藥性基因(或其它宿主基因)的轉(zhuǎn)座子。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子復(fù)合型轉(zhuǎn)座子還有一類無IS序列、體積龐大的的轉(zhuǎn)座子(5000bp以上)——TnA家族。TnA特征:攜帶3個基因,其中一個為編碼β-內(nèi)酰胺酶基因AmpR,使氨芐青霉素失活;兩翼都有38bp的倒置重復(fù)序列(IR)轉(zhuǎn)座后靶位點大都成為正向重復(fù)序列限制性內(nèi)切酶在靶DNA上

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