透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素香菇多糖

第八章糖類藥物制備原理1糖科學(xué)蛋白核酸糖類生物化學(xué)最后的巨大前沿之一2第一節(jié)概述糖類廣布于生物體中，可分為單糖、低聚糖和多糖，已發(fā)現(xiàn)不少糖類物質(zhì)及其衍生物具有很高藥用價(jià)值，有些已在臨床廣泛應(yīng)用。多糖類藥物近來很引人注目，尤其在抗凝、降血脂、提高機(jī)體免疫和抗腫瘤、抗輻射方面都具有顯著藥理作用與療效。如PS-K多糖和香菇多糖對(duì)小鼠S180瘤株有明顯抑制作用，已作為免疫型抗腫瘤藥物，豬苓多糖能促進(jìn)抗體的形成，是一種良好免疫調(diào)節(jié)劑，還有茯苓多糖、云芝多糖、銀耳多糖、胎盤脂多糖等都已在臨床上應(yīng)用。肝素是天然抗凝劑，用于防治血栓、周圍血管病、心絞痛、充血性心力衰竭與腫瘤的輔助治療。硫酸軟骨素有利尿、解毒、鎮(zhèn)痛作用。3糖類藥物的分類單糖糖的衍生物多糖低聚糖葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、乳果糖6-磷酸葡萄糖、1,6-二磷酸葡萄糖磷酸肌醇香菇多糖、肝素等4Text1Text3Txt5植物動(dòng)物微生物海藻多糖的分類〔按照其來源不同來分〕黃芪多糖、人參多糖、刺五加多糖肝素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素香菇多糖、靈芝多糖、豬苓多糖海帶多糖、微藻多糖5多糖在細(xì)胞內(nèi)的存在方式游離型結(jié)合型：

糖蛋白：如人參多糖、黃芪多糖等

脂多糖：如胎盤脂多糖、細(xì)菌脂多糖等。6多糖類藥物的藥理活性抗氧化

調(diào)節(jié)血糖血脂

抗輻射損傷抗?jié)冋{(diào)節(jié)免疫功能抗病毒

抗突變

抗衰老抗腫瘤抗凝血

香菇、海帶、冬蟲夏草泥鰍、銀杏葉多糖硫酸多糖類肝素、甲殼素、海帶多糖7國內(nèi)已經(jīng)上市的多糖藥物8一、單糖及其衍生物的制備游離單糖及小分子寡糖易溶于冷水及溫乙醇，如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、雙糖類如蔗糖、麥芽糖，三糖類如棉籽糖、龍膽糖，四糖類如來蘇糖，以及多元醇類，如衛(wèi)矛醇、甘露醇等。可以用水或在中性條件下以50%乙醇為提取溶劑，也可以用82%乙醇，在70~78℃下回流提取。用中性醋酸鉛去雜蛋白及其他雜質(zhì)，單糖或小分子寡糖也可以在提取后，用吸附層析法或離子交換法進(jìn)行純化。9二、多糖的別離與純化多糖可來自動(dòng)物、植物和微生物。植物體內(nèi)含有水解多糖衍生物的酶，必須抑制或破壞酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。供提取多糖的材料必須新鮮或及時(shí)枯燥保存，不宜久受高溫，以免破壞其原有形式，速凍冷藏是保存提取多糖材料的有效方法。提取方法依照不同種類的多糖的溶解性質(zhì)而定。如昆布多糖、果聚糖、糖原易溶于水；殼多糖與纖維素溶于濃酸；直鏈淀粉易溶于稀堿；酸性粘多糖常含有氨基已糖、已糖醛酸以及硫酸基等多種結(jié)構(gòu)成分，且常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，提取別離時(shí)，通常先用蛋白酶或濃堿、濃中性鹽解離蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合鍵后，用水提取，再將水提取液減壓濃縮，以乙醇或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀酸性多糖，最后用離子交換色譜進(jìn)一步純化。10〔一〕多糖的提取提取多糖時(shí)，一般先需進(jìn)行脫脂，以便多糖釋放。方法是將材料粉碎，用甲醇或1：1乙醇乙醚混合液，加熱攪拌1~3h，也可用石油醚脫脂。動(dòng)物材料可用丙酮脫脂、脫水處理。多糖的提取方法主要有以下幾種。

1.難溶于冷水、熱水，可溶于稀堿液者2.易溶于溫水、難溶于冷水和乙醇者3.粘多糖

111.難溶于冷水、熱水，可溶于稀堿液者這一類多糖主要是不溶性膠類，如木聚糖、半乳聚糖等。用冷水浸潤材料后用0.5mol/LNaOH提取，提取液用鹽酸中和、濃縮后，加乙醇沉淀得多糖。如在稀堿中仍不易溶出者，可參加硼砂，對(duì)甘露聚糖、半乳聚糖等能形成硼酸絡(luò)合物的多糖，此法可得相當(dāng)純的物質(zhì)。2.易溶于溫水、難溶于冷水和乙醇者材料用冷水浸過，用熱水提取，必要時(shí)可加熱至80~90℃攪拌提取，提取液用正丁醇與氯仿混合液除去雜蛋白(或用三氯乙酸除雜蛋白)，離心除去雜蛋白后的清液，透析后用乙醇沉淀得多糖。123.粘多糖粘多糖：是指含有氨基糖與糖醛酸或它的衍生物的多糖。是含氮的不均一多糖，是構(gòu)成細(xì)胞間結(jié)締組織的主要成分，也廣泛存在于哺乳動(dòng)物各種細(xì)胞內(nèi)，也稱為糖胺聚糖。特點(diǎn)：是一種長鏈復(fù)合糖分子，由己糖醛酸和氨基己糖或中性糖組成的二糖單位彼此相連而形成，可與蛋白質(zhì)相連形成蛋白多糖

。13〔1〕堿解法多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖肽鍵對(duì)堿不穩(wěn)定，故可用堿解法使糖與蛋白質(zhì)分開。堿處理時(shí)，可將組織在40℃以下，用0.5mol/LNaOH溶液提取，提取液以酸中和，透析后，以高嶺土、硅酸鋁或其他吸附劑除去雜蛋白，再用乙醇沉淀多糖。粘多糖分子上的硫酸基一般對(duì)堿較穩(wěn)定，但假設(shè)硫酸基與鄰羥基處于反式結(jié)構(gòu)或硫酸基在C-3或C-6，此時(shí)易發(fā)生脫硫作用。如肝素、硫酸乙酰肝素的氨基葡萄糖C-6上有硫酸基，C-3上可為游離羥基或硫酸基，因此對(duì)這類多糖不宜用堿解法提取。14〔2〕酶解法蛋白酶水解法已逐步取代堿提取法而成為提取多糖的最常用方法。蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵，因此成品中會(huì)保存較長的肽段。為除去長肽段，常可與堿解法合用。酶解時(shí)要防止細(xì)菌生長，可加甲苯、氯仿、酚或疊氮化鈉作抑菌劑，常用的酶制劑有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶。酶解液中的雜蛋白可用三氯醋酸法，磷鉬酸—磷鎢酸沉淀法，高嶺土吸附法、三氟三氯乙烷法，等電點(diǎn)法去除，再經(jīng)透析后，用乙醇沉淀即可制得粗晶粘多糖。15〔二〕多糖的純化多糖的純化方法很多，但必須根據(jù)目的物的性質(zhì)及條件選擇適宜的純化方法。且用一種方法不易得到理想的結(jié)果，因此必要時(shí)應(yīng)考慮合用幾種方法。1.乙醇沉淀法2.分級(jí)沉淀法3.季胺鹽絡(luò)合法4.離子交換層析法此外，區(qū)帶電泳法、超濾法及金屬絡(luò)合法等在多糖的別離純化中也常采用。如應(yīng)用區(qū)帶電泳法可別離透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素與肝素等。161.乙醇沉淀法乙醇沉淀法是制備粘多糖的最常用手段。乙醇的參加，改變了溶液的極性，導(dǎo)致糖溶解度下降。供乙醇沉淀的多糖溶液，其含多糖的濃度以1~2%為佳。如使用充分過量的乙醇，粘多糖濃度少于0.1%也可以沉淀完全。向溶液中參加一定濃度的鹽，如醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨或氯化鈉有助于使粘多糖從溶液中析出，鹽的最終濃度5%即足夠。使用醋酸鹽的優(yōu)點(diǎn)是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙醇過量時(shí)，也不會(huì)發(fā)生這類鹽的共沉淀。一般只要粘多糖濃度不太低，并有足夠的鹽存在，加人4~5倍乙醇后，粘多糖可完全沉淀?？梢允褂脤掖我掖汲恋矸ㄊ苟嗵敲擕}，也可以用超濾法或分子篩法(SephadexG-10或G-15)進(jìn)行多糖脫鹽。加完酒精，攪拌數(shù)小時(shí)，以保證多糖完全沉淀。沉淀物可用無水乙醇、丙酮、乙醚脫水，真空枯燥，即可得疏松粉末狀產(chǎn)品。172.分級(jí)沉淀法不同多糖在不同濃度的甲醇、乙醇或丙酮中的溶解度不同，因此可用不同濃度的有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀分子大小不同的粘多糖。在Ca2+、Zn2+等二價(jià)金屬離子的存在下，采用乙醇分級(jí)別離粘多糖可以獲得最正確效果。183.季胺鹽絡(luò)合法粘多糖與一些陽離子外表活性劑如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和十六烷基氯化吡啶(CPC)等能形成季胺鹽絡(luò)合物。這些絡(luò)合物在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶解，在離子強(qiáng)度大時(shí)，這種絡(luò)合物可以解離，溶解，釋放。使其溶解度發(fā)生明顯改變時(shí)的無機(jī)鹽濃度，主要取決于聚陰離子的電荷密度。粘多糖的硫酸化程度影響其電荷密度，根據(jù)其臨界鹽濃度的差異可以將粘多糖分為假設(shè)干組〔表8-1P191〕。降低pH可抑制羧基的電離，有利于增強(qiáng)硫酸粘多糖的選擇性沉淀。季胺鹽的沉淀能力受其烷基鏈中的“-CH2-〞基數(shù)的影響，還可以用不同種季胺鹽的混合物作為酸性粘多糖的別離沉淀劑，如Cetavlon和Arguadl6等。應(yīng)用季胺鹽沉淀多糖是分級(jí)別離復(fù)雜粘多糖與從稀溶液中回收粘多糖的最有用方法之一。194.離子交換層析法粘多糖由于具有酸性基團(tuán)如糖醛酸和各種硫酸基，在溶液中以聚陰離子形式存在，因而可用陰離子交換劑進(jìn)行交換吸附。常用的陰離子交換劑有D254，Dowex-X2，ECTEOIA-纖維素，DEAE-C，DEAE-SephadexA-25和DeaciditeFF。吸附時(shí)可以使用低鹽濃度樣液，洗脫時(shí)可以逐步提高鹽濃度如梯度洗脫或分步階梯洗脫。以DowexⅠ進(jìn)行別離時(shí)，分別有0.5，1.25，1.5，2.0和3.0mol/LNaCl洗脫，可以別離透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、肝素和硫酸角質(zhì)素。以DEAE-sephadexA-25層析時(shí)，分別用0.5，1.25，1.5和2.0mol/LNaCl洗脫，可以依次別離透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素與硫酸角質(zhì)素和肝素。20多糖別離純化的一般方法脫脂三種方法黏多糖乙醇沉淀分級(jí)沉淀21斷開與蛋白相連的結(jié)合鍵試劑〔氯仿：戊醇5：1〕，作用是使蛋白質(zhì)變性，缺點(diǎn)多糖損失較多黏多糖在溶液中以聚陰離子形式存在，故采用陰離子交換劑吸附。最常用手段22第二節(jié)糖類藥物生產(chǎn)工藝糖類藥物品種繁多，開展迅速，現(xiàn)根據(jù)其來源、性質(zhì)及工藝特點(diǎn)不同，主要介紹具有代表性的幾個(gè)重要品種的生產(chǎn)工藝。一、D-甘露醇的制備。二、肝素的制備三、硫酸軟骨素的制備四、透明質(zhì)酸的制備23一、D-甘露醇〔D-Mannitol〕的制備〔一〕結(jié)構(gòu)與性質(zhì)甘露醇又名己六醇，白色針狀結(jié)晶，無臭，略有甜味，不潮解。易溶于水〔15.6g18℃〕溶于熱乙醇，微溶于低級(jí)醇類和低級(jí)胺類，微溶于吡啶，不溶于有機(jī)溶劑。在無菌溶液中較穩(wěn)定，不易為空氣所氧化。溶點(diǎn)166℃，[α]20D+28.6°(硼砂溶液)。24〔二〕生產(chǎn)工藝甘露醇在海藻、海帶中含量較高。海藻洗滌液和海帶洗滌液中甘露醇的含量分別為2%與1.5%，是提取甘露醇的重要資源。以葡萄糖為原料，經(jīng)電解、脫鹽、精制即可制得，電解轉(zhuǎn)化率為98~99.6%，也可以用發(fā)酵法生產(chǎn)。1.提取法2.發(fā)酵法3.制劑25

1.提取法〔1〕工藝路線20倍量自來水，室溫浸泡2~3h，浸泡液套用4批

甘露醇在醫(yī)藥上是良好的利尿劑，降低顱內(nèi)壓、眼內(nèi)壓及治療腎藥、脫水劑、食糖代用品、也用作藥片的賦形劑及固體、液體的稀釋劑。

甘露醇注射液作為高滲透降壓藥，是臨床搶救特別是腦部疾患搶救常用的一種藥物，具有降低顱內(nèi)壓藥物所要求的降壓快、療效準(zhǔn)確的特點(diǎn)。26二、肝素〔Heparin〕的制備〔一〕結(jié)構(gòu)與性質(zhì)肝素首先從肝臟發(fā)現(xiàn)而得名，天然操作于肥大細(xì)胞，現(xiàn)在主要從牛肺或豬小腸黏膜提取。肝素是天然抗凝劑,是一種含硫酸基的酸性粘多糖。三硫酸雙糖與二硫酸雙糖以2：1比例在分子中連結(jié)。三硫酸雙糖中是L-艾杜糖醛酸,二硫酸雙糖中是D-葡萄糖醛酸27肝素的性質(zhì)分子量不均一，有高中低三類不同分子量組成，平均分子量12000±6000，從3000-37500。易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，其游離酸在乙醚中有一定溶解性。含硫酸基和羧基，呈強(qiáng)酸性，為聚陰離子。N-硫酸基對(duì)酸敏感，在堿性條件穩(wěn)定。28〔二〕生產(chǎn)工藝肝素廣泛分布于哺乳動(dòng)物的肝、肺、心、脾、腎、胸腺、腸粘膜、肌肉和血液里。因此肝素可由豬腸粘膜、牛肺、豬肺提取。其生產(chǎn)工藝主要有鹽解—季胺鹽沉淀法，鹽解-離子交換法和酶解-離子交換法。肝素在組織內(nèi)和其他粘多糖一起與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，因此肝素制備過程包括肝素蛋白質(zhì)復(fù)合物的提取，解離和肝素的別離純化兩個(gè)步驟。提取肝素多采用鈉鹽的堿性熱水或沸水浸提，然后用酶如胰蛋白酶、胰酶(胰臟)、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和細(xì)菌蛋白酶等水解與肝素結(jié)合的蛋白質(zhì)，使肝素解離釋放。也可以用堿性食鹽水提取，再經(jīng)熱變性并結(jié)合凝結(jié)劑如明礬、硫酸鋁等除去雜蛋白。所得的粗提液，仍含有未除盡的雜蛋白、核酸類物質(zhì)和其他粘多糖，需經(jīng)陰離子交換劑或長鏈季胺鹽別離，再經(jīng)乙醇沉淀和氧化劑處理等純化操作，即得精品肝素。29肝素生產(chǎn)工藝P19695℃，10min堿性食鹽水，加熱提取95％堿性，陰離子吸附劑先用水洗至澄清，再用2倍量30肝素生產(chǎn)工藝2.酶解-離子交換生產(chǎn)工藝豬腸粘膜【酶解】胰漿、NaCl、Ph8.5、40－45℃Ph6.5、90℃濾液【吸附】D-254樹脂Ph7.0、5h樹脂吸附物【洗滌】2mol/LNaCl1.2mol/LNaCl【洗脫】洗脫液樹脂吸附物5mol/LNaCl3mol/LNaCl【沉淀】沉淀物乙醇【脫水、枯燥】肝素粗品無水乙醇、丙酮【溶解】【脫色】2％NaClKMnO4Ph8.0、80℃/2.5h濾液【沉淀】沉淀物乙醇、Ph6.4【溶解】2％NaCl溶液【沉淀】沉淀物乙醇【脫水、枯燥】無水乙醇、丙酮、乙醚精品肝鈉素31肝素的藥理作用肝素的藥理作用：

1、抗凝血。

2、抑制血小板，增加血管壁的通透性，并可調(diào)控血管新生。

3、具有調(diào)血脂的作用。

4、可作用于補(bǔ)體系統(tǒng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，以抑制系統(tǒng)過度激活。與此相關(guān)，肝素還具有抗炎、抗過敏的作用。肝素的不良反響：肝素的主要不良反響是易引起自發(fā)性出血，表現(xiàn)為各種黏膜出血、關(guān)節(jié)腔積血和傷口出血等，而肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥是一種藥物誘導(dǎo)的血小板減少癥，是肝素治療中的一種嚴(yán)重并發(fā)癥。肝素的特效解毒劑：魚精蛋白。32三、硫酸軟骨素的制備(一)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)硫酸軟骨素(CS)的藥用商品名為康得靈，是從動(dòng)物軟骨中提取制備的酸性粘多糖，主要是硫酸軟骨素A、C及各種硫酸軟骨素的混合物。硫酸軟骨素一般含有50~70個(gè)雙糖單位，鏈長不均一，分子量在1~3萬。易溶于水而成粘度大的溶液，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑中，其鹽對(duì)熱較穩(wěn)定，受熱80℃亦不破壞。具有調(diào)脂、抗炎及弱的抗凝血、抗血栓生物活性，對(duì)維持細(xì)胞環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定性和正常功能具有重要作用。33(二)生產(chǎn)工藝硫酸軟骨素廣泛存在于動(dòng)物的軟骨、喉骨、鼻骨，牛、馬鼻中隔和氣管中，在骨腱、韌帶、皮膚、角膜等組織中也有。魚類軟骨中含量也很高，如鯊魚骨中含50~60%。在軟骨中，硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)結(jié)合成蛋白多糖，并與膠原蛋白結(jié)合在一起。其提取別離方法有稀堿-酶解法、濃堿水解法、稀堿-濃鹽法、酶解-樹脂法。341.稀堿-濃鹽法

2.稀堿-酶解法35四、透明質(zhì)酸(HyaluronicAcid)的制備(一)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)透明質(zhì)酸是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖-(1→4)-O-β-D-葡萄糖醛酸的雙糖重復(fù)單位所組成的酸性多糖，分子量50~200萬。溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，具有較高的粘度特性。對(duì)骨關(guān)節(jié)具有潤滑作用。還能促進(jìn)物質(zhì)在皮膚中的擴(kuò)散率、調(diào)節(jié)細(xì)胞外表和細(xì)胞周圍的Ca2+，Mg2+，K+，Na+離子運(yùn)動(dòng)。在組織中的強(qiáng)力保水作用是其最重要的生理功能之一，故被稱為理想的天然保濕因子。36(二)生產(chǎn)工藝制備透明質(zhì)酸的常用原料有公雞冠、眼球玻璃體、人臍帶、豬皮、兔皮等。工藝過程包括提取，除蛋白等雜質(zhì)，分級(jí)別離，有機(jī)溶劑沉淀等。純化方法有離子交換層析法、制備電泳法、凝膠過濾法和吸附法等。第九章37糖類簡介介紹：糖類是自然界中廣泛分布的一類重要的有機(jī)化合物。日常食用的蔗糖、糧食中的淀粉、植物體中的纖維素、人體血液中的葡萄糖等均屬糖類。糖類在生命活動(dòng)過程中起著重要的作用，是一切生命體維持生命活動(dòng)所需能量的主要來源。

構(gòu)成：主要由碳、氫、氧三種元素構(gòu)成。

糖類化合物包括單糖、單糖的聚合物及衍生物。

分子通式：Cm(H2O)n

然而，符合這一通式的不一定都是糖類，是糖類也不一定都符合這一通式。

這只是表示大多數(shù)糖的通式。

碳水化合物只是糖類的大多數(shù)形式。我們把糖類狹義的理解為碳水化合物。