一液相色譜基礎(chǔ)

液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜的發(fā)明人俄國(guó)科學(xué)家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻(xiàn)一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱經(jīng)典液相色譜色譜法簡(jiǎn)介色譜法（Chromatography）溯源俄國(guó)科學(xué)加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開(kāi)創(chuàng)了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法并見(jiàn)諸于俄文的文獻(xiàn)1906年正式命名（見(jiàn)諸文獻(xiàn)）色譜法；Chromatography50年代開(kāi)始廣泛研究和應(yīng)用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于70年代色譜分離的機(jī)理色譜是一種分離技術(shù)色譜分離是一個(gè)物理過(guò)程流動(dòng)相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）樣品（溶解于流動(dòng)相中的溶質(zhì)）液相色譜分離機(jī)理

高效液相色譜是一種以液體作流動(dòng)相和固體微粒作固定相，待測(cè)組分在柱內(nèi)的兩相之間進(jìn)行高速分配和高效分離的柱液體色譜方法。樣品溶液中的各組分，因其物理化學(xué)性質(zhì)的微小差異，當(dāng)其隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，便在柱的兩相之間產(chǎn)生不同的相互作用力，從而導(dǎo)致柱上遷移速率的微小差異。隨著流動(dòng)相的連續(xù)推移，這種微小的差異被不斷擴(kuò)大，直至柱內(nèi)出現(xiàn)明顯不同的遷移距離，使最終達(dá)到組分完全分離。什么是液相色譜氣相色譜：流動(dòng)相是氣相液相色譜：流動(dòng)相是液相什么是高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)：HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測(cè)器……廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……在技術(shù)，理論及應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段液相色譜的基本流程圖流動(dòng)相

泵色譜柱檢測(cè)器

泵輸液分離

檢測(cè)

記錄AEGBCDF進(jìn)樣閥進(jìn)樣HPLC的儀器配置色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑高效液相色譜基本概念＊色譜峰或色譜譜帶＊基線噪音＊基線漂移＊檢測(cè)限（敏感度）＊色譜峰對(duì)稱(chēng)性＊色譜定性參數(shù)＊色譜柱效能參數(shù)液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜峰－Peak色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線峰底－PeakBase峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬－PeakWidth在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離半（高）峰寬－PeakWidthatHalfHeight通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)峰面積－PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱(chēng)響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差；σ－StandardError0.607倍峰高處所對(duì)應(yīng)峰寬的一半拖尾峰－TailingPeak后沿較前沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰前伸峰－LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對(duì)稱(chēng)峰鬼峰－GhostPeak并非由試樣所產(chǎn)生的峰；亦稱(chēng)假峰液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)基線－Baseline在正常操作條件下，僅由流動(dòng)相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的曲線基線飄移－BaselineDrift基線隨時(shí)間定向的緩慢變化基線噪聲；N－BaselineNoise由各種因素所引起的基線波動(dòng)譜帶擴(kuò)展－BandBroadening由于縱向擴(kuò)散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動(dòng)過(guò)程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象液相色譜圖相關(guān)術(shù)語(yǔ)死時(shí)間，t0

－Deadtime不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間保留時(shí)間，tR

－Retentiontime組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間死體積，V0

－Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積保留體積，VR

－Retentionvolume組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動(dòng)相體積液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù)

液相色譜實(shí)驗(yàn)所需的基本參數(shù)流動(dòng)相：種類(lèi)及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類(lèi)型及內(nèi)徑、長(zhǎng)短流動(dòng)相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測(cè)器參數(shù)：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)，靈敏度等溫度控制進(jìn)樣量以上參數(shù)即構(gòu)成一個(gè)具體的HPLC方法，亦稱(chēng)色譜條件色譜圖：HPLC圖形結(jié)果

（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為保留時(shí)間?！V峰保留時(shí)間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值色譜峰或色譜譜帶流出曲線上的突起部分稱(chēng)為色譜峰正常色譜峰為對(duì)稱(chēng)形正態(tài)分布曲線不對(duì)稱(chēng)色譜峰有兩種：前延峰和拖尾峰色譜流出曲線圖及相關(guān)參數(shù)

樣品進(jìn)入色譜柱，經(jīng)流動(dòng)相沖洗，由檢測(cè)器測(cè)得的信號(hào)-洗脫時(shí)間曲線，即色譜圖。檢測(cè)限（敏感度）常用基線噪音的二倍表示：D=2·N/S

式中：

N

為噪音（mV)

S

為靈敏度(mV·ml/g)對(duì)稱(chēng)因子計(jì)算示意圖色譜峰的對(duì)稱(chēng)性—對(duì)稱(chēng)因子：

a.

拖尾因子

b.

不對(duì)稱(chēng)因子峰對(duì)稱(chēng)因子計(jì)算公式對(duì)稱(chēng)因子(fs)：式中：

fs=0.95~1.05為正常峰

fs＜0.95為前延峰

fs＞1.05為拖尾峰色譜柱效能參數(shù)計(jì)算示意圖色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5s理論板數(shù)(n)計(jì)算公式或（通常用）：若應(yīng)用調(diào)整保留時(shí)間tR′計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱(chēng)為有效理論塔板數(shù)(

n有效或neff

)液相色譜中的相平衡參數(shù)

分配系數(shù)（K）

容量因子（k）

選擇性因子（）分配系數(shù)(K)計(jì)算公式在一定溫度下，系統(tǒng)達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相中的濃度（Cs

)與在流動(dòng)相中的濃度（Cm)之比：容量因子(k)計(jì)算公式

容量因子亦指系統(tǒng)在達(dá)到分配平衡后，組分在固定相中的量（Ws）與在流動(dòng)相中的量（Wm）之比，k=tR-t0／t0

k值

k項(xiàng)

k對(duì)分離度影響

00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95容量因子k與分離度的關(guān)系與R的關(guān)系容量因子k

與峰高的關(guān)系改變k’

值的方法：調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性（比例）、pH、離子強(qiáng)度等梯度淋洗選擇性因子()計(jì)算公式

兩相鄰組分的分配系數(shù)之比或容量因子之比稱(chēng)為選擇性因子（）。要使兩組分獲得分離，≠1。否則，兩相鄰組分沒(méi)有分離。或把

k=tR′／t0代入得：選擇性系數(shù)a定義∶

a=1時(shí)兩組分分不開(kāi)，改變a的途徑改變固定相改變流動(dòng)相（組成）改變溫度改變樣品的本身性質(zhì)分離度(R）計(jì)算方法示意圖分離度(R）計(jì)算公式⑴

R=1，稱(chēng)為4

分離，(峰尖間距為4)，兩相鄰峰基本分離，達(dá)95.4%。⑵

R=1.5,為6

分離，分