高效液相色譜的特點(diǎn)與儀器

第二章

高效液相色譜法一、高效液相色譜儀instrumentof

HPLC二、高效液相色譜法的特點(diǎn)

featureofHPLC三、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC第一節(jié)

高效液相色譜的特點(diǎn)與儀器highperformanceliquid

chromatographfeatureandinstrumentof

HPLC2023/2/5一、液相色譜儀器（

highperformanceliquidchromatograph）2023/2/5WatersLC26952023/2/5IC4500i2023/2/51.分離效能高GC分離效能較高，n=103塔板/米，HPLC可達(dá)到5×103~3×104

塔板/米，可使用較短的柱子。二、高效液相色譜法的特點(diǎn)2.選擇性高HPLC柱效高，流動(dòng)相可以控制和改善分離的選擇性。3.檢測(cè)靈敏度高HPLC廣泛采用高靈敏度檢測(cè)器，如UV（10-9g/mL），熒光檢測(cè)器（10-11g/mL）。HPLC的優(yōu)點(diǎn)2023/2/52023/2/54.分析速度快HPLC載液流速可達(dá)1~10ml/min，完成一個(gè)樣品分析僅需幾分鐘到幾十分鐘。5.應(yīng)用范圍廣HPLC法不受樣品沸點(diǎn)、揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性限制，適于分析生物大分子、離子型化合物、不穩(wěn)定的天然物及各種高分子化合物。原則上相對(duì)分子量大于400的有機(jī)物都可用HPLC法分析。2023/2/5分析成本高，宜引起污染。缺少高靈敏度的通用型檢測(cè)器。不能替代GC完成沸程范圍寬的石油產(chǎn)品的分析。操作較GC復(fù)雜。HPLC的局限性2023/2/5實(shí)際應(yīng)用中，凡是能用GC分析的樣品一般不用HPLC，因?yàn)镚C更快，更靈敏，更方便，且耗費(fèi)較低。

HPLC與GC比較氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)幾乎可分析各種物質(zhì)不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析可用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效色譜柱不能很長(zhǎng)、柱效不會(huì)很高有很靈敏檢測(cè)器和較靈敏的通用檢測(cè)器沒(méi)有較靈敏的通用檢測(cè)器流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒、易于處理流動(dòng)相有毒、費(fèi)用較高運(yùn)行和操作容易運(yùn)行和操作較氣相難儀器制造難度較小儀器制造難度較大2023/2/52023/2/5三、流程及主要部件

高效液相色譜儀的主要部件：儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、進(jìn)樣裝置、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀和數(shù)據(jù)處理裝置。工作流程2023/2/52023/2/5一、儲(chǔ)液罐及流動(dòng)相的脫氣1.儲(chǔ)液罐溶劑在放人儲(chǔ)液罐之前必須經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾：除去溶劑中的機(jī)械雜質(zhì)，以防輸液管道或進(jìn)樣閥產(chǎn)生阻塞現(xiàn)象。儲(chǔ)液罐的材料應(yīng)耐腐蝕：常用玻璃、氟塑料或PEEK塑料，容積約為0.5~2.0L。儲(chǔ)液罐放置位置要高于泵體：以保持一定的輸液靜壓差。使用過(guò)程儲(chǔ)液罐應(yīng)密閉：防溶劑蒸發(fā)引起流動(dòng)相組成變化，還可防止空氣中O2、CO2重新溶于已脫氣的流動(dòng)相中。2023/2/52023/2/52．流動(dòng)相脫氣

除去其中溶解氣體，防止流動(dòng)相由柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡，而增加基線噪聲。使用熒光檢測(cè)器，溶解在流動(dòng)相中的氧氣，會(huì)造成熒光猝滅。還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組分被氧化或會(huì)使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理2023/2/52023/2/5吹氦脫氣法，在0.1MPa下，以約60mL/min流速通入流動(dòng)相10~15min。此法適用于所有的溶劑，脫氣效果較好，但價(jià)格較貴。加熱回流法，此法的脫氣效果較好。抽真空脫氣法，用微型真空泵除去溶解氣體，降壓至0.05~0.70MPa。

超聲波脫氣法，流動(dòng)相置放于超聲波清洗器中，用超聲波振蕩10~15min。脫氣效果最差。在線真空脫氣法，真空脫氣裝置串接到儲(chǔ)液系統(tǒng)中，使流動(dòng)相進(jìn)入輸液泵前連續(xù)真空脫氣。此法脫氣效果最好，適于多元溶劑體系。常用的脫氣方法2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5二、高壓輸液泵1.高壓泵性能有足夠的輸出壓力：壓力范圍250~400kg/cm2。輸出流量恒定：流量精密度應(yīng)在1%，無(wú)脈動(dòng)。流量范圍寬：分析儀器應(yīng)在0.1

~10.0ml/min。制備儀器1~100ml/min?？谷軇┑母g：常用不銹鋼和PEEK塑料。泵死體積要??；以便迅速更換溶劑和梯度洗提。2023/2/52023/2/5

2.高壓泵分類(lèi)：恒流泵：輸出流量恒定，與柱引起阻力無(wú)關(guān)。恒壓泵：輸出壓力恒定，與柱引起阻力無(wú)關(guān)。(1)恒流泵：常用往復(fù)式柱塞泵和注射泵。

特點(diǎn)：流量恒定，液腔體積?。?.1ml），更換溶劑和梯度洗提方便，但有脈動(dòng)，應(yīng)用廣泛。2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5(2)恒壓泵：常用氣動(dòng)泵根據(jù)壓力傳導(dǎo)原理設(shè)計(jì)的，即P1.SA=P2.SBP1低壓，推動(dòng)大面積SA，則在小面積SB活塞輸出大壓力P2。

特點(diǎn)：壓力恒定，無(wú)脈動(dòng)，液腔體積較大，更換流動(dòng)相不方便。當(dāng)泵的負(fù)荷阻力小時(shí)可提供大的輸出流量，適于勻槳法填裝柱子。2023/2/52023/2/53．梯度洗脫裝置梯度洗提：在分離過(guò)程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性。通過(guò)載液極性改變來(lái)改變分離因素，改善分離效果、縮短分析時(shí)間、改善峰形，提高分析精度。

高壓梯度（內(nèi)梯度）兩臺(tái)高壓泵，將兩種不同極性溶劑按一定比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5低壓梯度（外梯度）:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5三、進(jìn)樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)；通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置；特點(diǎn)：耐高壓，進(jìn)樣的重現(xiàn)性好，易于自動(dòng)化，易造成色譜峰柱前擴(kuò)寬。

2023/2/52023/2/5裝入狀態(tài)出口進(jìn)樣狀態(tài)采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱三、進(jìn)樣裝置2023/2/52023/2/5四、高效分離柱發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

柱材：一般采用不銹鋼管和PEEK塑料。柱型及尺寸：一般采用管內(nèi)徑1～6

mm，柱長(zhǎng)5～40

cm直型柱，標(biāo)準(zhǔn)柱型φ3.9或4.6mm，L15、30cm。填料粒度：5~10

μm，柱效5000～10000

，

3~5

μm，L5~10cm。

2023/2/52023/2/5五、液相色譜檢測(cè)器理想的HPLC檢測(cè)器應(yīng)具備的特性靈敏度高；對(duì)所有溶質(zhì)都有快速響應(yīng)；響應(yīng)對(duì)流動(dòng)相流量和溫度變化不敏感；線性范圍寬；不引起柱外擴(kuò)散。至今沒(méi)有一種檢測(cè)器完全具備。常用的檢測(cè)器UVD；RID；ECD；FLD。2023/2/52023/2/5⑴紫外檢測(cè)器

溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器。

構(gòu)造：2023/2/5特點(diǎn)：靈敏度高(10-9g/mL），線性范圍寬，易于操作，對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感，適用于梯度洗脫。應(yīng)用：HPLC中使用最為廣泛?；诒粶y(cè)組分對(duì)紫外光的選擇性吸收，其吸光度與試樣中組分濃度成正比，檢測(cè)原理：即

A∝C。2023/2/52023/2/5①

無(wú)組分進(jìn)入時(shí)，測(cè)量池和參比池只通過(guò)流動(dòng)相，光電管接受的輻射強(qiáng)度相等，無(wú)信號(hào)輸出。②組分進(jìn)入時(shí)，其吸收一定紫外光，光電管接受到輻射強(qiáng)度不等，有信號(hào)輸出。2023/2/52023/2/5（2）

光電二極管陣列檢測(cè)器（PDAD）二級(jí)管陣列檢測(cè)器是UV檢測(cè)器的重要進(jìn)展，光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理。與普通UVD的區(qū)別進(jìn)入檢測(cè)器流通池的不再是單色光；獲得的檢測(cè)信號(hào)不是單一波長(zhǎng)上的，而是全部紫外光波長(zhǎng)上的信號(hào)。可提供組分的光譜信息，利于定性分析。2023/2/52023/2/5檢測(cè)原理：光源發(fā)出的輻射（氘燈）→吸收池→光柵（全息）→二級(jí)管陣列檢測(cè)器，并用電子學(xué)方法和計(jì)算機(jī)技術(shù)采集數(shù)據(jù)→可得三維色譜圖－光譜圖2023/2/52023/2/52023/2/52023/2/52023/2/52023/2/5特點(diǎn)：最大優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)獲得吸收值是保留時(shí)間和波長(zhǎng)函數(shù)的三維圖?？衫蒙V保留值規(guī)律及光譜特征吸收曲線綜合進(jìn)行定性分析?？蓪?duì)每個(gè)色譜峰的指定位置（峰前沿、頂、尾）進(jìn)行光譜比較，以判斷色譜峰的純度及分離情況。目前靈敏度不及UVD。2023/2/52023/2/5

整體性質(zhì)檢測(cè)器，普及程度僅次于UVD。（3）示差折光檢測(cè)器（RID）

檢測(cè)原理：通過(guò)連續(xù)測(cè)定參比流通池中和樣品流通池中溶液折射率的差值方法，來(lái)測(cè)定試樣濃度。

折射率的差值與組分的濃度成正比2023/2/52023/2/5

特點(diǎn)：1.通用型檢測(cè)器，幾乎每種物質(zhì)都有各自的折射率都可用差示折光檢測(cè)器檢測(cè)；2.靈敏度低，可以達(dá)到10-7g/mL；3.對(duì)溫度、流量變化敏感；4.不能用于梯度洗脫。2023/2/52023/2/5

檢測(cè)原理：

光源發(fā)出紫外光→單色器1→吸收池（光被吸收，激發(fā)組分）產(chǎn)生熒光→單色器2→光電倍增管，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與組分濃度成正比。（4）熒光檢測(cè)器（FLD）

熒光檢測(cè)