第7-13章高效液相部分-色譜應(yīng)用技術(shù)

LOGOHPLC應(yīng)用與操作技術(shù)藥物分析教研室鄭楓

樣品的性質(zhì)和分離目的HPLC方法建立的步驟樣品前處理方法的選擇檢測器的選擇選擇、優(yōu)化色譜分離條件定量分析定性分析純化物質(zhì)方法學(xué)確證常規(guī)樣品：色譜柱：正相、反相流動(dòng)相：改變流動(dòng)相組成：離子抑制、離子對(duì)

改變流動(dòng)相洗脫方式：等度、梯度洗脫

樣品：衍生化對(duì)映異構(gòu)體：手性高效液相色譜HPLC條件的選擇《PracticalHPLCMethodDevelopment》L.RSnyder，J.J.Kirkland《實(shí)用高效液相色譜方法建立》

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一、藥物衍生化的目的減小前處理難度或增加穩(wěn)定性；123改善色譜分離；提高檢測性能；改善色譜分離。有利于復(fù)雜樣品的衍生化分析。柱前衍生化柱后衍生化復(fù)雜樣品衍生化難度大。不改善色譜分離，反而可能造成峰展寬。特點(diǎn)限制二、衍生化方式1324反應(yīng)定量迅速易于分離檢測反應(yīng)選擇性高方便，通用性好三、衍生化反應(yīng)的要求氨基酸的紫外衍生化試劑+異硫氰酸苯酯茚三酮+紫外衍生化反應(yīng)熒光衍生化反應(yīng)衍生化試劑的基本結(jié)構(gòu)示意圖磺酰氯類試劑胺類和氨基酸的熒光衍生化試劑+丹酰氯，DNS-Cl激發(fā)波長：350-370nm發(fā)射波長：490-540nm含有羰基的試劑胺類和氨基酸的熒光衍生化試劑鄰苯二甲醛（OPA）

+特點(diǎn)：本身無熒光，產(chǎn)物有熒光；反應(yīng)迅速，適合柱后衍生化。激發(fā)波長：340nm發(fā)射波長：455nm福多斯坦衍生化示例福多司坦半胱氨酸+++氨基酸常用衍生化試劑的比較衍生化試劑優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)鄰苯二甲醛（OPA）反應(yīng)迅速；可檢測形式多；試劑不發(fā)熒光。不能與二級(jí)氨基酸直接反應(yīng)；衍生物不穩(wěn)定。異硫氰酸酯（PITC）與一、二級(jí)氨基酸都可以反應(yīng)；穩(wěn)定，衍生副產(chǎn)物對(duì)測定無干擾；紫外檢測。需除去衍生試劑；樣品制備需較長時(shí)間；PITC毒性大；靈敏度較低丹酰氯（DNSCl）反應(yīng)迅速；可檢測形式多；剩余衍生試劑不需除去；可與二級(jí)氨基酸反應(yīng)；衍生物較穩(wěn)定。DNSCl水解產(chǎn)物也可發(fā)射強(qiáng)熒光，干擾測定；反應(yīng)要在避光條件下進(jìn)行；專屬性差定量限：300ng/ml質(zhì)譜衍生化反應(yīng)增加色譜保留定量限：50ng/ml福多司坦測定方法的比較方法一方法二方法三方法四固定相

C18C18C18NH2流動(dòng)相乙腈-水(含0.02M戊烷磺酸鈉）乙腈-水甲醇-水甲醇-水檢測器紫外（210nm）直接測定熒光（FD）柱前衍生化質(zhì)譜（MS）柱前衍生化串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）直接測定定量限10μg/mL300ng/ml50ng/ml10ng/ml文獻(xiàn)中國新藥雜志2004藥學(xué)學(xué)報(bào)2005J.MassSpectrom.2006尚未發(fā)表分離：色譜柱：正相、反相流動(dòng)相：改變流動(dòng)相組成：離子對(duì)

檢測：換用靈敏度更高的檢測器衍生化：同時(shí)改善分離和檢測

HPLC條件的選擇羰基化合物的熒光衍生化試劑丹酰肼（DNSH）+羧酸的熒光衍生化試劑香豆素類試劑+4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC）激發(fā)波長：325nm發(fā)射波長：400nm電化學(xué)衍生化標(biāo)記反應(yīng)還原衍生試劑電化學(xué)衍生化標(biāo)記反應(yīng)氧化衍生試劑衍生化反應(yīng)選擇策略1.根據(jù)分析要求（基質(zhì)復(fù)雜性、靈敏度等）選擇衍生化反應(yīng)類別；靈敏度：質(zhì)譜>熒光>紫外2.根據(jù)被分析物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇相應(yīng)類別的衍生物試劑；3.進(jìn)一步優(yōu)化測定條件，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。梯度洗脫技術(shù)（gradientelution）

等度定義：色譜分離過程中，流動(dòng)相中有機(jī)相比例或離子強(qiáng)度、pH值不斷改變的洗脫方式。目的：適用于保留范圍寬的多組分復(fù)雜樣品。梯度流動(dòng)相洗脫方式isocraticelution梯度洗脫的應(yīng)用特點(diǎn)（1）解決組分k值差距過大對(duì)分離帶來的困難；（2）解決組分在色譜柱上殘留問題；（3）進(jìn)樣量體積較大時(shí)產(chǎn)生峰展寬方式：在開始一段時(shí)間內(nèi)，使用洗脫能力較弱的流動(dòng)相，隨著流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度增加，色譜保留較強(qiáng)的組分較快被洗脫，縮短分析時(shí)間。

（4）改善峰型常見洗脫方式應(yīng)用最多的是有機(jī)相比例隨著分離時(shí)間不斷發(fā)生變化，洗脫類型：方式選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)梯度范圍調(diào)整分離度1234梯度洗脫判斷各組分保留性質(zhì)確定是否需要梯度確定流動(dòng)相起始和最終比例改變流動(dòng)相比例變化速率混合物分離的梯度洗脫方法建立步驟時(shí)間（min）20%甲醇（0.5%甲酸）80%甲醇（0.5%甲酸）010001.0001004.0001004.0110006.001000梯度洗脫的不足（1）方法建立更為復(fù)雜、困難；（