生物芯片技術(shù)76706課件

生物芯片技術(shù)

(BIOCHIPTECHNOLOGY)

研究歷史(Researchhistory)1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻與光化學(xué)技術(shù)、多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNAChip概念Stanford大學(xué)Brown實(shí)驗(yàn)室：預(yù)先合成，機(jī)械手陣列1995Schena等：基因表達(dá)譜1996Cheeetal：DNA測序1996Croninetal：突變檢測1996Sapolsley&Lipshutz：基因圖克隆1996Shalonetal：復(fù)雜DNA樣本分析1996Shoemakeretal：缺省突變定量表型分析第十章生物芯片技術(shù)生物芯片（biochip）的概念指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細(xì)胞或組織的微點(diǎn)陣(microarray）。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。第十章生物芯片技術(shù)生物芯片的主要特點(diǎn)：高通量、微型化和自動化常用的生物芯片的分類：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片及芯片實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)高度并行性：提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。多樣性：可進(jìn)行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。微型化：減少試劑用量和反應(yīng)液體積，提高樣品濃度和反應(yīng)速率。自動化：降低成本，保證質(zhì)量。第十章生物芯片技術(shù)2.

蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)利用抗體與抗原特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)的原理，將蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）結(jié)合到固相支持物上，形成蛋白質(zhì)微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。第十章生物芯片技術(shù)芯片實(shí)驗(yàn)室(labs-on-chip)高度集成化的集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)。實(shí)現(xiàn)生化分析全過程集成在一片芯片上完成，從而使生物分析過程自動化、連續(xù)化和微縮化。芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。其他分類方法（根據(jù)應(yīng)用）基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結(jié)核桿菌)法醫(yī)鑒定(如DNA指紋圖譜)表達(dá)譜芯片腫瘤相關(guān)基因(正常與腫瘤組織表達(dá)差異)藥物篩選(培養(yǎng)細(xì)胞藥物刺激前后表達(dá)差異)發(fā)育(同一組織不同發(fā)育時期基因表達(dá)差異)組織發(fā)生(不同組織或器官的基因表達(dá)差異)2.DNA微矩陣法：成本低，易操作，點(diǎn)樣密度通常能滿足需要。芯片的載體需表面緊質(zhì)、光滑的固體，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩陣芯片常用玻片為載體。根據(jù)DNA成分寡聚核苷酸或DNA片段：約2025個核苷酸堿基，常用于基因類型的分析，如突變、正常變異（多態(tài)性）。全部或部分cDNA：約5005000個核苷酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的相關(guān)基因表達(dá)分析?；蛐酒姆N類ScienceChip：生物分析和診斷NutriChip：食物分析、轉(zhuǎn)基因、污染檢測LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析AquaChip：水質(zhì)分析SecureChip：含DNA的物質(zhì)鑒定ChromoChip：基因分析和染色體序列ProkaryoChip：原核生物、獸醫(yī)、環(huán)保等第一節(jié)DNA芯片第一節(jié)DNA芯片DNA芯片技術(shù)包括四個主要步驟芯片的設(shè)計與制備樣品制備雜交反應(yīng)和信號檢測結(jié)果分析生物芯片技術(shù)主要環(huán)節(jié)芯片制備：微點(diǎn)陣樣本制備：DNA提純、擴(kuò)增、標(biāo)記雜交：樣本與互補(bǔ)模板形成雙鏈檢測：共聚焦掃描，雙色激光數(shù)據(jù)處理：定量軟件，數(shù)據(jù)庫檢索，RNA印跡等。結(jié)果

第一節(jié)DNA芯片二、樣品的制備三、雜交與結(jié)果分析四、基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一、芯片制備一、芯片制備基因芯片制備主要包括兩個方面探針的設(shè)計：根據(jù)應(yīng)用目的不同，設(shè)計不同的固定于芯片上的探針。探針在芯片上的布局：選擇合適的方式將探針排布在芯片上。一、芯片制備（二）DNA芯片的制備

（一）探針的設(shè)計一、芯片制備

圖10－2（二）DNA芯片的制備

1．載體選擇與預(yù)處理載體：用于連接、吸附或包埋各種生物分子并使其以固相化狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)的固相材料。載體材料：玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和聚丙烯膜等。載體的化學(xué)處理：活化劑——多聚賴氨酸氨基硅烷偶聯(lián)劑一、芯片制備芯片制備原位合成法（insitusynthesis):又可分為原位光控合成法和原位標(biāo)準(zhǔn)試劑合成法。適用于寡核苷酸，使用光引導(dǎo)化學(xué)原位合成技術(shù)。是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法。一、芯片制備

圖10－3合成后交聯(lián)（post-syntheticattachment):利用手工或自動點(diǎn)樣裝置將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA樣品點(diǎn)在經(jīng)特殊處理過的玻片或其他材料上。主要用于診斷、檢測病原體及其他特殊要求的中、低密度芯片的制備。兩種制備方法比較原位合成：測序、查明點(diǎn)突變高密度、根據(jù)已知的DNA編制程序制作復(fù)雜、價格昂貴、不能測定未知DNA序列合成后交聯(lián)：比較分析制備方式直接和簡單，點(diǎn)樣的樣品可事先純化，交聯(lián)方式多樣，可設(shè)計和制備符合自己需要的芯片。中、低密度，樣品浪費(fèi)較多且制備前需儲存大量樣品。二、樣品的制備樣品的制備過程包括核酸分子的純化、擴(kuò)增和標(biāo)記樣本制備制備高質(zhì)量樣本是困難的但又是極其重要的。制備細(xì)胞、組織或整個器官樣本應(yīng)特別小心。溫度、激素和營養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景、組織成分等輕微改變都會使基因表達(dá)的結(jié)果發(fā)生明顯變化。用于基因類型分析的樣本是DNA，用于表達(dá)研究的樣本是cDNA。樣本制備后應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，通常為酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和核素標(biāo)記。三、雜交與結(jié)果分析（一）雜交反應(yīng)：與傳統(tǒng)的雜交方法類似（二）雜交信號的檢測：最常用熒光法（三）數(shù)據(jù)分析：芯片雜交圖譜的處理與存儲由專門設(shè)計的軟件來完成。雜交是芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步液相中探針與DNA片段按堿基配對規(guī)則形成雙鏈反應(yīng)。選擇雜交條件時，必須滿足檢測時的靈敏度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補(bǔ)模板雜交。合適長度的DNA有利于與探針雜交。溫度、非特異性本底等均會影響雜交結(jié)果。最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐。結(jié)果分析

芯片與標(biāo)記的靶DNA或RNA雜交后，或與標(biāo)記的靶抗原或抗體結(jié)合后，可采用下列方法分析處理數(shù)據(jù)：共聚焦掃描儀：應(yīng)用最廣，重復(fù)性好但靈敏度較低。質(zhì)譜法：快速、精確，可準(zhǔn)確判斷是否存在基因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針合成較復(fù)雜。化學(xué)發(fā)光、光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測、直接電荷變化檢測等。芯片掃讀裝置根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD型。根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光。應(yīng)用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好的定位功能，可定量，應(yīng)用廣泛。圖象分析復(fù)雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件來完成。分析軟件的功能：鑒定每個點(diǎn)陣、最大限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏色圖象、可標(biāo)記或排除假陽性、識別和分析對照實(shí)驗(yàn)是否成功、可將信號標(biāo)準(zhǔn)化等。圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數(shù)據(jù)庫的能力。四、基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用基因表達(dá)分析

基因型、基因突變和多態(tài)性分析疾病診斷：遺傳性、感染性、腫瘤藥物篩選指導(dǎo)用藥及治療方案預(yù)防醫(yī)學(xué)四、基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用生物芯片分析原則1、測定過程應(yīng)包括五個基本步驟：需解決的生物學(xué)問題樣本制備生物化學(xué)反應(yīng)檢測數(shù)據(jù)分析2、生物學(xué)系統(tǒng)控制必須精確地與檢測目的相匹配。

3、生物學(xué)樣本必須精確地與生物學(xué)種類相匹配。

4、所有基因分析必須平行處理。

5、基因分析技術(shù)必須適合微型化和自動化。

6、平行格式必須精確的依據(jù)生物學(xué)樣本的次序。

7、檢測系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù)。

8、檢測系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復(fù)。9、兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應(yīng)受到單

個實(shí)驗(yàn)所固有特性的限制。

10、絕對比例關(guān)系只存在于組合實(shí)驗(yàn)的平

行數(shù)據(jù)組內(nèi)。

11、平行格式包括內(nèi)在和外部的整個系統(tǒng)

誤差的分析因素。

12、在每個系統(tǒng)模塊中采集到該系統(tǒng)所有

變量的四維數(shù)據(jù)時，才能稱為完成生

物系統(tǒng)平行基因分析。

生物芯片技術(shù)的12條原則只是一個基本框架。其術(shù)語的詳細(xì)定義和有關(guān)理論可參見

質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)對照：體外轉(zhuǎn)錄從cDNA合成mRNA，參入標(biāo)本中作為對照。此mRNA不與點(diǎn)陣的核酸雜交。將不同濃度的不同基因參入標(biāo)本中，可作為標(biāo)本間標(biāo)準(zhǔn)化的參照。用兩種不同吸收光譜的熒光素同時分析兩個標(biāo)本，如果兩種熒光強(qiáng)度一致，可排除標(biāo)本間變異因素。用單一堿基錯配的寡核苷酸做對照可排除交叉雜交。

結(jié)果有效性的證實(shí)在表達(dá)矩陣上，有時難于區(qū)分極其相似的序列，如基因族成員，亞類或異類的存在。比較兩種不同DNA序列表達(dá)水平時，有些參數(shù)如核苷酸的成分、二級結(jié)構(gòu)的存在和矩陣上DNA的長度都會影響雜交。證實(shí)矩陣分析的結(jié)果可用RT-PCR(區(qū)別基因族成員,比較不同DNA種系表達(dá),證實(shí)基因變異或突變和精確測定DNA表達(dá)水平)、NorthernBlot(證實(shí)某一基因的相對表達(dá)水平)、WesternBlot(RNA表達(dá)是否達(dá)到細(xì)胞中的蛋白水平)、質(zhì)譜儀(證實(shí)矩陣結(jié)果是否在蛋白水平)等。第二節(jié)蛋白質(zhì)芯片第二節(jié)蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）,又稱蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)或多肽作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其它分子之間的相互作用關(guān)系。

第二節(jié)蛋白質(zhì)芯片根據(jù)制作方法和應(yīng)用的不同，蛋白質(zhì)芯片分為兩種蛋白質(zhì)功能芯片細(xì)胞中的每一種蛋白質(zhì)占據(jù)芯片上一個確定的點(diǎn)，主要是高度平行地檢測天然蛋白質(zhì)活性。蛋白質(zhì)檢測芯片將能夠識別復(fù)雜生物溶液（如細(xì)胞提取液）中靶多肽的高度特異性配體進(jìn)行點(diǎn)陣。這種芯片能夠高度并行的檢測生物樣品中的蛋白質(zhì)。第二節(jié)蛋白質(zhì)芯片第二節(jié)蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用特異性抗原抗體的檢測生化反應(yīng)的檢測疾病診斷對疾病分子機(jī)制的研究藥物篩選及新藥的研制開發(fā)抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)(protiomics)的興起，促進(jìn)了抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的發(fā)展。PareickBrown使用特異性抗體微矩陣，測定了細(xì)胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。Leuking等采用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)，測定了10pg的微量蛋白質(zhì)，并證實(shí)假陽性極低。乳腺癌基因芯片Stanford乳腺癌微矩陣(Perouetal.1999)每種基因的數(shù)據(jù)以行表示，每個實(shí)驗(yàn)用列表示。顏色強(qiáng)度表示對照和實(shí)驗(yàn)cDNA的比率。比率相同時為1。結(jié)果為紅色表示mRNA增加，綠色表示減少，灰白色表示缺乏。兩種基因的相似性用Pearson相關(guān)公式或Euclidian測距公式計算。DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達(dá)

KavineMaillardetal(1999)cDNAs進(jìn)行DNA表達(dá)矩陣，PCR產(chǎn)物包被在經(jīng)賴氨酸處理的玻片上，用Cys3-和Cys5-標(biāo)記的cDNA進(jìn)行雜交，洗滌后用Scanarray3000掃描儀測定矩陣，表達(dá)數(shù)據(jù)儲存在ACeDB數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)數(shù)據(jù)表達(dá)類型區(qū)分不同的基因。微矩陣分析DNA和蛋白表達(dá)

HolgerEickhoffetal.(1999)根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù)，組合800000人類EST序列，已重矩陣了38000克隆用于RNA表達(dá)分析，克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增后共價結(jié)合于玻片上，每張玻片固定19200個基因片段，標(biāo)記人組織RNAs與被選的38000人基因片段的矩陣進(jìn)行雜交，比較健康與疾病組織的圖象，用軟件分析點(diǎn)識別和點(diǎn)定量。使用寡聚核苷酸鑒定新的cDNA克隆，和進(jìn)入表達(dá)載體，使相應(yīng)蛋白能直接表達(dá)，矩陣后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的關(guān)系。生物芯片相關(guān)儀器點(diǎn)陣儀：制備芯片。點(diǎn)樣針分為實(shí)心和空心兩種，點(diǎn)樣方式有非接觸噴點(diǎn)和接觸點(diǎn)樣兩種。雜交儀：全自動完成調(diào)節(jié)、加探針、漂洗和熱循環(huán)的雜交過程。掃描儀：激光共聚焦或CCD直接成像分析結(jié)果。微矩陣儀器介紹QBotQPixQArrayQPetQSoft2000QBot超高解析基因篩選暨排列分析儀?；蚓浜Y選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(diǎn)(Gridding)：100000/h基因復(fù)制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復(fù)制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片全自動液體分注系統(tǒng)(LiquidHandling):96針，注液量1200l，適合PCR產(chǎn)物。分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)。環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁板QPix半敞開式基因篩選暨排列分析儀(經(jīng)濟(jì)型)基因菌落篩選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(diǎn)(Gridding)：100000/h基因復(fù)制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復(fù)制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁板QArray第三代半敞開式基因微矩陣排列儀?；蛭⒕仃嚺帕?Microarrying)：同時處理84片玻片，每一打點(diǎn)玻片分4個區(qū)域，可安排不同的矩陣排列?？蛇x16或24針座。儀器容量：玻片84片，玻片架6個，384孔板5盤。分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)。環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁板。自動液體處理系統(tǒng)。雜交儀Affymetrix640雜交儀：溫度范圍：0100C探針用量：l流速：10ml/min樣本區(qū)：2.46.4cm掃描儀GenearrayTM掃描儀：激光：氬離子,488nm適用染料：熒光素、藻紅素單掃描時間：<4分鐘分辨率：3、6、9或24微米生物芯片技術(shù)的發(fā)展發(fā)展趨勢微型化：DNA矩陣越來越小。集成化：矩陣上的基因組越來越大。多樣化：測定范圍越來越廣。微量化：測定所需樣本越來越少。全自動化：樣品制備到結(jié)果顯示全部