血清學(xué)實驗技術(shù)學(xué)習(xí)資料

血清學(xué)實驗技術(shù)血清學(xué)反應(yīng)的一般特點特異性與交叉性:抗原抗體結(jié)合的特異性是抗原分析和疾病診斷的基礎(chǔ)；但不同微生物的部分共同抗原或不同抗原的相同表位可出現(xiàn)交叉反應(yīng)，后者是區(qū)分血清型或亞型重要依據(jù)結(jié)合比例:抗原抗體結(jié)合在比例適當(dāng)時才出現(xiàn)明顯可見反應(yīng),抗原或抗體過多可抑制可見反應(yīng),稱為帶現(xiàn)象可逆性:抗原抗體結(jié)合力與非共價鍵性質(zhì)、數(shù)量和距離有關(guān),形成的復(fù)合物可以解離,離解常數(shù)(K)反映抗體與抗原之間的親合力,高親合力結(jié)合不易解離反應(yīng)的階段性:特異結(jié)合迅速(幾秒-幾分鐘),可見反應(yīng)階段較長在凝集試驗（顆粒性抗原）中，常因抗體過剩出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，故需固定抗原稀釋抗體；而在沉淀試驗（可溶性抗原）中，可因抗原過剩出現(xiàn)后帶現(xiàn)象，故需稀釋抗原影響血清學(xué)反應(yīng)的因素抗體:包括抗體動物來源、濃度(效價)、親和性等抗原:包括理化特性(可溶性，顆粒性)和抗原表位數(shù)目及種類電解質(zhì):無電解質(zhì)存在不出現(xiàn)可見反應(yīng)(沉淀或凝集),一般用生理鹽水作為抗體和抗原稀釋液,有時需特殊電解質(zhì),但鹽濃度過高會出現(xiàn)非特異性蛋白沉淀(鹽析)酸堿度:反應(yīng)一般在pH6-9范圍內(nèi)進行溫度:一般在37℃或室溫進行,較低溫度(如4℃)出現(xiàn)可見反應(yīng)慢,但特異性強,溫度過高會使已結(jié)合復(fù)合物解離時間:出現(xiàn)可見反應(yīng)需要一定時間,應(yīng)在一定時間內(nèi)觀察結(jié)果或終止反應(yīng)血清學(xué)試驗的優(yōu)點特異性強，敏感性高檢測樣品用量少，預(yù)處理較簡單試驗方法多，可擇優(yōu)選用方法簡易、快速可用于抗原或抗體的定性、定量、定位檢測血清學(xué)試驗的應(yīng)用抗原抗體定性檢測:疾病診斷血型鑒定病原微生物分型鑒定抗原抗體的定量檢測:抗原或抗體效價測定免疫效果跟蹤檢測流行病學(xué)調(diào)查其它生物活性物質(zhì)定量分析抗原定位檢測:借助光學(xué)和電子顯微鏡,在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平研究病原微生物及其表達產(chǎn)物與宿主細(xì)胞的關(guān)系凝聚性試驗定義：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，在電解質(zhì)存在下相互凝聚成肉眼可見的凝聚物或沉淀物分類凝集試驗：細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原或與顆粒性載體（紅細(xì)胞、乳膠等）結(jié)合的可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下形成肉眼可見的凝集團塊沉淀試驗：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下形成肉眼可見的沉淀物凝集試驗分類凝集性試驗直接凝集性試驗間接凝集性試驗玻片凝集性試驗試管凝集性試驗生長凝集性試驗正向間接凝集性試驗反向間接凝集性試驗協(xié)同凝集性試驗間接凝集抑制試驗抗球蛋白試驗直接法間接法玻片凝集試驗屬于直接凝集和定性試驗可用于未知(待測)抗原或抗體檢測快速簡便，1-3分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，出現(xiàn)凝集顆粒為陽性反應(yīng)主要用于細(xì)菌分型鑒定、疾病診斷（如布氏桿菌和雞白痢檢疫)和血型鑒定已知抗原陽性抗體對照陰性抗體對照待測抗體(陽性)待測抗體(陰性)試管凝集試驗多用已知抗原進行血清抗體的定性和定量（效價或滴度）檢測，可用于疾病診斷和流行病學(xué)調(diào)查常用生理鹽水將待測血清作倍比稀釋，與等量抗原混合，反應(yīng)溫度和時間視抗原種類決定判斷標(biāo)準(zhǔn):++++(100%凝集),+++(75%凝集),++(50%凝集),+(25%凝集),-(不凝集),出現(xiàn)50%以上凝集的血清最高稀釋倍數(shù)為該血清的凝集價(滴度)注意陽性和陰性對照,適當(dāng)稀釋待檢血清以避免前帶現(xiàn)象，有些細(xì)菌（如R型細(xì)菌）懸液不穩(wěn)定，易出現(xiàn)自凝現(xiàn)象根據(jù)凝集反應(yīng)原理可制備單因子血清間接凝集試驗定義：將可溶性抗原或抗體吸附在免疫無關(guān)的顆粒載體上，然后與相應(yīng)抗體或抗原進行的凝集反應(yīng)常用載體：紅血球(間接血凝試驗)和乳膠(乳膠凝集試驗)等，將可溶性抗原吸附在顆粒載體表面的過程稱為致敏分類：正向間接凝集試驗：將抗原吸附載體檢測抗體反向間接凝集試驗：將抗體吸附載體檢測抗原一般在微量反應(yīng)板上進行可用于抗原或抗體的效價測定，具有簡單、方便和較準(zhǔn)確等優(yōu)點協(xié)同凝集試驗葡萄球菌A蛋白(SPA)是大多數(shù)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種蛋白質(zhì)SPA能與人和動物(豬、犬、兔、猴、豚鼠)IgGFc片段非特異結(jié)合與抗體結(jié)合的SPA菌體稱為致敏菌體,可與抗原(細(xì)菌、病毒、毒素等)發(fā)生快速凝集,稱為協(xié)同凝集試驗主要用于傳染病的快速診斷,SPA菌體還可用于IgG純化葡萄球菌抗體抗原抗球蛋白(Coombs)試驗本質(zhì)：間接凝集試驗原理：不完全抗體(單價抗體)與顆?？乖Y(jié)合不出現(xiàn)可見凝集反應(yīng)，用單價抗體免疫動物,將獲得的抗抗體與結(jié)合有單價抗體的顆粒載體混合，出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)應(yīng)用：初生動物自身免疫溶血性貧血診斷，布氏桿菌病的不完全抗體檢測，抗組織細(xì)胞不完全抗體的檢測YYYYY不完全Ab顆粒性抗原如：RBCs+=Step1+=YYYYYYYYYYYYYYYYYYYAnti-AbFcStep2沉淀試驗分類絮狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗免疫濁度測定免疫擴散試驗免疫電泳對流免疫電泳火箭免疫電泳液體沉淀試驗沉淀試驗?zāi)z內(nèi)沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗在小口徑玻璃管內(nèi)進行主要用于抗原的定性檢測(如診斷炭疽病的Ascoli試驗、鏈球菌的血清型鑒定、血跡鑒定和沉淀素的效價滴定出現(xiàn)白色沉淀環(huán)的抗原最高稀釋倍數(shù)為該血清的沉淀價已知血清待測抗原沉淀環(huán)免疫濁度測定原理：抗原抗體復(fù)合物在特定的稀釋液中容易析出,從而發(fā)生濁度變化，當(dāng)抗體濃度固定時,在一定范圍內(nèi)抗原和抗體混合物的濁度與抗原的量呈正比儀器及要求：需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，現(xiàn)多與光學(xué)儀器和自動化檢測系統(tǒng)向結(jié)合應(yīng)用：可檢測微量的抗原或抗體單向單擴散試驗抗原在含陽性血清凝膠中單方向擴散形成沉淀線,隨擴散的進行,已形成沉淀線不斷溶解并形成新的沉淀線,導(dǎo)致沉淀線不斷前移,最終形成穩(wěn)定沉淀線沉淀線距離與抗原量呈正比主要用于抗原的定量測定含已知抗體凝膠待檢抗原沉淀線瓊脂凝膠擴散試驗定義：將可溶性抗原和抗體在半固體瓊脂凝膠中擴散，當(dāng)兩者相遇并達到比例適當(dāng)時出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線分類：單向單擴散單向雙擴散雙向單擴散雙向雙擴散（免疫擴散試驗）雙向單擴散試驗基本原理診斷雞馬立克氏病的羽囊瓊擴試驗病雞羽毛根免疫擴散試驗原理:不同孔中的抗原、抗體在凝膠中自由擴散,由近及遠形成濃度梯度,當(dāng)兩者相遇且比例適合時形成復(fù)合物(沉淀線)用途:主要用于復(fù)雜抗原分析免疫電泳本質(zhì)：電泳與雙向免疫擴散相結(jié)合原理：瓊脂的SO4--使溶液因靜電感應(yīng)產(chǎn)生正電荷,形成向負(fù)極的推力(電滲力),帶正電的分子在電滲力作用下加速向負(fù)極泳動,帶負(fù)電分子克服電滲力向正極泳動用途：血清蛋白的分析及疾病診斷對流電泳本質(zhì)：用電泳加速抗原抗體定向擴散原理：大部分抗原帶較強負(fù)電荷,能克服電滲力向陽極泳動,IgG帶弱負(fù)電荷，不能克服電滲力而向陰極移動，兩者相遇時形成沉淀線應(yīng)用：主要用于快速診斷火箭電泳原理：在含抗血清的瓊脂凝膠(pH8.2)中，加在陰極孔中的抗原在電泳力作用下向陽極泳動,形成濃度梯度,在與抗體比例適合處形成沉淀峰,峰的高度與抗原含量呈正比應(yīng)用：主要用于抗原定量分析免疫標(biāo)記技術(shù)用酶或熒光素等示蹤物標(biāo)記的抗體或抗原進行反應(yīng),借助光學(xué)或酶學(xué)儀器對結(jié)果進行直接觀察或自動化測定,在細(xì)胞及亞細(xì)胞水平上對抗原進行定性和定位分析免疫熒光技術(shù)原理：用熒光素標(biāo)記的抗體進行抗原抗體反應(yīng),然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果,進行抗原(如病毒感染細(xì)胞)的定性、定位研究分類：直接法：標(biāo)記第一抗體，特異性高，操作簡便，較快速，但一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差間接法：標(biāo)記抗抗體，既能檢查抗原，也能檢查抗體，一種標(biāo)記抗抗體能與同種所有動物的抗體結(jié)合，敏感性高，但參與加因素較多，判定結(jié)果有時較難，操作繁瑣常用的熒光素：異硫氰酸熒光素(FITC)等免疫酶技術(shù)將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的催化高效性相結(jié)合的一類技術(shù)可用于抗原和抗體的定性、定位或定量研究主要包括免疫酶組化染色技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbantassay,ELISA)免疫酶組化染色技術(shù)原理與免疫熒光相似,主要在病例切片或培養(yǎng)細(xì)胞上進行常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)分為直接法(標(biāo)記第一抗體)、標(biāo)記抗抗體)、抗抗體搭橋法和雜交抗體法酶聯(lián)免疫吸附試驗將抗原或抗體吸附于固相載體(如聚苯乙烯微孔板)上,然后與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng),酶底物顯色后用肉眼或酶聯(lián)免疫測定儀進行定性觀察或定量測定主要有間接法、競爭法和雙抗體夾心法應(yīng)用:用于抗原或抗體的測定,進行傳染病的診斷及流行病學(xué)調(diào)查;用于抗原或抗體的含量或效價測定ELISA的結(jié)果判定肉眼:根據(jù)反應(yīng)孔內(nèi)液體的顏色進行定性觀察儀器:P/N值判定法:被檢樣本(P)OD值與陰性樣本(N)OD值的比值(P/N)1.5為陽性樣本的平均OD值大于陰性樣本OD平均值+兩個標(biāo)準(zhǔn)差+0.2-0.4為陽性放射免疫技術(shù)將抗原抗體反應(yīng)的特異性與放射免疫測定的高度敏感性相結(jié)合主要有液相放射免疫測定法和固相競爭測定法主要用于微量抗原的定性和定量分析補體結(jié)合試驗包括反應(yīng)系統(tǒng)(抗原和抗體)、補體和指示系統(tǒng)(被溶血素致敏的紅血球)特別煩瑣,影響因素多,現(xiàn)很少用CCC反應(yīng)系統(tǒng)指示系統(tǒng)溶血反應(yīng)結(jié)果判定抗體抗原補體溶血素+紅細(xì)胞免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)以標(biāo)記抗體為探針的蛋白轉(zhuǎn)印雜交基本過程包括待測蛋白樣品的電泳分離、蛋白向雜交膜(硝酸纖維素膜)的轉(zhuǎn)移、雜交膜的封閉、用標(biāo)記抗體進行的雜交、洗滌和信號顯示E玫瑰花環(huán)試驗T細(xì)胞膜上有紅細(xì)胞受體,在一定條件下能與紅細(xì)胞(erythrocyte)結(jié)合,在顯