微生物基礎(chǔ)實驗技術(shù)回顧

微生物基礎(chǔ)實驗技術(shù)回顧第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日2023/2/71第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日消毒與滅菌消毒（disinfectant）

是指殺滅或清除傳播媒介上的病原微生物，使之達到無害化的處理。（不一定包括芽孢）滅菌(sterilant)是指殺滅或清除傳播媒介上的所有微生物（包括芽胞），使之達到無菌程度。第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日常見的消毒滅菌方法化學(xué)消毒滅菌通過液體化學(xué)試劑殺滅微生物繁殖體或芽孢。消毒對象：物體表面、空氣、污染物品等。消毒方式：擦洗、熏蒸、浸泡等。物理消毒滅菌包括高壓蒸汽、紫外線、焚燒、HEPA過濾除菌等。第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日化學(xué)消毒滅菌一、含氯消毒劑常用含氯消毒劑：次氯酸鈉、二氯、三氯等常用劑型：粉劑、片劑、液體殺菌能力：高水平消毒；1000-5000mg/L濃度。適用范圍：飲用水、餐飲具、果蔬、環(huán)境、物表、污水、污物、排泄物、分泌物注意事項：密閉干燥保存；消毒后去除殘留；使用液不穩(wěn)定，加蓋，有效期；對織物漂白，對金屬腐蝕用；操作時應(yīng)做好個人防護。第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日化學(xué)消毒滅菌二、過氧乙酸

酸性透明液體，易揮發(fā)易分解，爆炸危險。殺菌能力：滅菌，高水平消毒適用范圍：餐飲具、果蔬、環(huán)境、物表、空氣。薰蒸消毒：18-20%過氧乙酸5-6ml（1g）/m3，放瓷或玻璃容器中，加熱密閉薰蒸1-2h。噴霧消毒：0.1-0.5%，20ml/m3，作用1h。注意事項：性質(zhì)不穩(wěn)，用前配，有蓋塑料容器；對金屬腐蝕，對織物漂白作用；操作時應(yīng)做好個人防護；消毒完成后用清水去除殘留。第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日化學(xué)消毒滅菌三、乙醇

別名酒精，無色透明液體，易揮發(fā)，易燃燒。殺菌能力：中水平消毒適用范圍：手、皮膚、小面積物表、醫(yī)療器械使用方法：手與皮膚用75%溶液擦拭1min

物表用75%溶液浸泡或擦拭10min以上注意事項：乙醇易燃，忌明火；可使蛋白質(zhì)變性凝固形成

保護層，消毒前應(yīng)將物品表面的有機物清除，

不宜用于被血、膿、糞便等污染表面消毒；破

壞儀器膠粘物與鏡頭，橡膠塑料變硬膨脹。第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日物理消毒滅菌一、熱力消毒和滅菌

是最可靠、首選的消毒滅菌方法。分為濕熱消毒和滅菌以及干熱消毒和滅菌。適用范圍：耐熱物品的消毒和滅菌。常見類型：濕熱消毒滅菌主要采用高壓蒸汽滅菌。E.g.：手提式高壓蒸汽滅菌器。用于微生物實驗

和少量培養(yǎng)基滅菌，一般0.105MPa在25

到30分鐘即可。

干熱消毒滅菌，一般用于破璃儀器如試管、三角

瓶、培養(yǎng)皿等,滅菌溫度在160℃,維持60分鐘。

第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日物理消毒滅菌二、紫外線輻射滅菌

可達高水平消毒，使用方便；但由于對人皮膚黏膜有刺激作用，并產(chǎn)生臭氧，在有人情況下使用受到限制。適用范圍：室內(nèi)空氣消毒、水的消毒、能直接照射到的光滑物體表面的消毒。紫外線在水中穿透力隨著深度的增加而降低第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日物理消毒滅菌三、高效過濾除菌

高效過濾除菌技術(shù)，對空氣中≤0.3μm顆粒與微生物的阻留率能達到99.97%以上。適用范圍：主要用于生物安全柜與生物安全實驗室的空氣凈化除菌。注意事項：*必須定期更換高效過濾器（HEPA），*更換前應(yīng)先用甲醛或過氧乙酸進行熏蒸消毒，*更換時嚴格做好工作人員防護；*換下的過濾裝置裝入密封袋內(nèi)由具有資質(zhì)的單位焚燒處

理。第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日消毒與滅菌的區(qū)別消毒只要求場所與物品達到無害化水平，而滅菌則要求達到?jīng)]有一個活菌存在。兩者選用的處理方法不同。滅菌與消毒相比，要求更高，處理更難。應(yīng)用的場所與處理的物品也不同。第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)：指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。無菌操作目的：保證待檢物品不被環(huán)境中微生物污染；防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀無菌操作材料：接種工具第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)無菌操作材料：材料器械和用品：酒精燈、記號筆、標簽、火柴、滅菌培養(yǎng)皿、無菌水、試管架菌種培養(yǎng)基：第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)（1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作；（2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3）在火焰上方操作；（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5）在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應(yīng)輕、準。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。無菌操作的要求：第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日無菌操作技術(shù)第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物接種、分離純化與培養(yǎng)

接種（inoculate/vaccinate）

是指按無菌操作技術(shù)要求將目的微生物移接到培養(yǎng)基質(zhì)中的過程。

微生物的分離純化（

isolationandpurificationof

microorganisms）將特定的微生物個體從群體中或從混雜的微生物群體中分離出來的技術(shù)叫作分離；在特定環(huán)境中只讓一種來自同一祖先的微生物群體生存的技術(shù)叫作純化。

微生物培養(yǎng)（microculture)是生物培養(yǎng)的中的一種。所培養(yǎng)的微生物主要有病毒、細菌、放線菌、真菌等。第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法接種的基本程序滅菌接種環(huán)沾取標本接種滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境操作需在無菌室或超凈工作臺內(nèi)進行無菌室、超凈工作臺使用前后需進行消毒。實驗使用的物品使用前后需嚴格滅菌第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法一、斜面接種

將已長好微生物移接到另一斜面管的方法。此法用于好氣性微生物的接種。左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平。用右手先將塞擰轉(zhuǎn)松動，再拿接種環(huán)，用右手的小指、無名指和手掌撥下塞并夾緊，同時將管口在火焰上燃燒一圈，接種環(huán)灼燒滅菌后插入管內(nèi)，冷卻、挑菌，立即轉(zhuǎn)入斜面管底部，沿斜面劃曲線或直線。第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法一、斜面接種1.兩支試管呈“V”字形

2.拔下試管塞3.火焰上微燒一周

4.接種環(huán)灼燒、冷卻5.接種、劃線

6.塞上塞子，灼燒接種環(huán)第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法二、液體接種將菌接種到液體培養(yǎng)基（試管、三角瓶等）中的方法。操作與上法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，然后塞上棉塞，再輕輕搖動均勻，即可培養(yǎng)。如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時，一般用移液管或接種環(huán)接種。第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法三、穿刺接種用接種針以無菌操作挑取少許菌體穿刺與半固體培養(yǎng)基中間，刺至管底，再按原途退出。穿刺時要做到手穩(wěn)、動作輕巧、快速；塞緊棉塞后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時觀察結(jié)果。此法用于厭氣性細菌接種、檢查細菌的運動能力。

第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法四、劃線接種目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌、活菌計數(shù)。方法：★分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標本★連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標本第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法四、劃線接種第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法四、劃線接種分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的接種方法四、劃線接種連續(xù)劃線法第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化原理是將待分離的樣品進行一定的稀釋，使之分散，在固體培養(yǎng)基上形成單個菌落，再轉(zhuǎn)接到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，就認為是純種。

分離培養(yǎng)成純種菌的方法有平板劃線法、傾注平板法和動物接種分離法等，其中以平板劃線法最為常用。第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化一、平板劃線法倒平板挑取菌落劃線注意：劃線完畢，將瓊脂平板培養(yǎng)基倒置，并在培養(yǎng)皿底玻璃上，用記號筆注明接種菌名、接種者姓名及班級、日期等，將培養(yǎng)皿倒置放在恒溫箱培養(yǎng)，以避免培養(yǎng)過程中凝結(jié)水自皿蓋滴下。判定合格標準：如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化一、平板劃線法平板劃線法的示意圖見圖1：AB是最常使用的、最基本的方法，其中圖B常用于含菌量較少的標本。第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化一、平板劃線法圖2分區(qū)劃線法示意圖

三段分區(qū)法四段分區(qū)法第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化一、平板劃線法

五段分區(qū)法培養(yǎng)后情況第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化一、平板劃線法

單菌落（clone)菌落（R型）菌苔(lawn)細菌的群體形態(tài)第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化二、稀釋分離法第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的分離純化二、稀釋分離法1.取無菌生理鹽水（NaCl0.85%)試管三支（每支4.5ml)，編號Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；2.無菌操作取混合菌液一環(huán)于Ⅰ中，搖勻；3.同法自Ⅰ管至Ⅱ，自Ⅱ管至Ⅲ；4.用1ml無菌吸管，分別從Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ管中吸取0.2ml于三個無菌培養(yǎng)皿中，編號；5.倒入熔化冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15ml左右，輕輕搖勻，待凝后倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時觀察結(jié)果。第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的培養(yǎng)一、培養(yǎng)基人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基的基本成分一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無機鹽和水等第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的培養(yǎng)二、培養(yǎng)基的種類第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的培養(yǎng)物理狀態(tài)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基適用范圍廣，用于菌種的分離純化、鑒定、活菌計數(shù)、檢驗雜菌、選種及菌種保藏等。在實驗室及微生物大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中用途廣泛。用于細菌運動狀態(tài)的觀察、趨化性研究、厭氧菌的培養(yǎng)以及細菌和酵母菌的菌種保藏等。第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的培養(yǎng)功能選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。幾種細菌由于對培養(yǎng)基中某一成分的分解能力不同,其菌落通過指示劑顯示不同的顏色而被區(qū)分開。在培養(yǎng)基中加入有利于某種微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，使這類微生物的增殖速度比其他微生物快。第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物的培養(yǎng)成分合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基復(fù)合培養(yǎng)基成分精確，價格較貴，通常適用于營養(yǎng)、代謝、菌種鑒定或生物測定等對定量要求較高的工作中。營養(yǎng)豐富，配制方便，培養(yǎng)效果好。但是成分不明確，實驗可重復(fù)性差。一類既有已知的化學(xué)組成物質(zhì)，同時還加有某些天然成分而配置的培養(yǎng)基。第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌種的保藏第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌種的保藏一、斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此循環(huán)?！襁m用范圍：細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。●優(yōu)缺點：優(yōu)點是簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和

生產(chǎn)上對經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點是

菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，

菌種較容易發(fā)生變異和被污染。第四十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌種的保藏二、冷凍真空干燥保藏法通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)?！襁m用范圍：除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法?！駜?yōu)缺點：優(yōu)點是保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低。缺點是該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設(shè)備。第四十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌種的保藏三、液氮超低溫保藏法它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細胞損傷。●適用范圍：適用于各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏?！駜?yōu)缺點：優(yōu)點是操作簡便、高效、保藏期一般可達到15年以上，可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏，無論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。其缺點是需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費用較高。第四十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌種的保藏四、石蠟油封藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此循環(huán)。●適用范圍：霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好?！駜?yōu)缺點：優(yōu)點是操作簡單；缺點是對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種第四十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌種的保藏