微生物的遺傳

第一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第八章微生物的遺傳變異與育種理想的工業(yè)發(fā)酵菌種應(yīng)符合以下要求①遺傳性狀穩(wěn)定；②生長(zhǎng)速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；③目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率；④目標(biāo)產(chǎn)物最好能分泌到細(xì)胞外，以降低產(chǎn)物抑制并利于分離；⑤盡可能減少產(chǎn)物類似物的產(chǎn)量，以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量并利于分離；⑥培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、來(lái)源廣、價(jià)格低廉；⑦對(duì)溫度、pH、離子強(qiáng)度、剪切力等環(huán)境因素不敏感；⑧對(duì)溶氧的要求低，便于培養(yǎng)及降低能耗。第二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日微生物的獨(dú)特生物學(xué)特性（1） 個(gè)體的體制極其簡(jiǎn)單；（2） 營(yíng)養(yǎng)體一般都是單倍體；（3） 易于在成分簡(jiǎn)單的組合培養(yǎng)基上大量生長(zhǎng)繁殖；（4） 繁殖速度快；（5） 易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物；（6） 菌落形態(tài)特征的可見(jiàn)性和多樣性；（7） 環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)個(gè)體作用的直接性和均一性；（8） 易于形成營(yíng)養(yǎng)缺陷型；（9） 各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒；（10） 存在多種處于進(jìn)化過(guò)程中的原始有性生殖方式；第三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多主要的生物學(xué)基本理論問(wèn)題中最熱衷的研究對(duì)象。對(duì)微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進(jìn)了現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程學(xué)的發(fā)展，而且為育種工作提供了豐富的理論基礎(chǔ)，促使育種工作從不自覺(jué)到自覺(jué)、從低效到高效、從隨機(jī)到定向、從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展。研究微生物遺傳學(xué)的意義第四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日遺傳與變異的概念遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一。遺傳(heredity)：親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實(shí)現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。特點(diǎn)：具穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個(gè)體所含有的全部基因的總和；------是一種內(nèi)在可能性或潛力。

遺傳型+環(huán)境條件表型表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和;------是一種現(xiàn)實(shí)存在，是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。代謝發(fā)育第五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日變異(variation):生物體在外因或內(nèi)因的作用下，遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變。變異的特點(diǎn)：a.在群體中以極低的幾率出現(xiàn)，（一般為10-6～10-10）；b.形狀變化的幅度大；c.變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。飾變（modification）：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點(diǎn)是：a.幾乎整個(gè)群體中的每一個(gè)個(gè)體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度?。籧.因遺傳物質(zhì)不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復(fù)。例如：粘質(zhì)沙雷氏菌：在25℃下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在37℃下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；如果重新將溫度降到25℃，又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力。遺傳與變異的概念第六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)種質(zhì)連續(xù)理論：1883~1889年間Weissmann提出。認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物。基因?qū)W說(shuō)：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因?qū)W說(shuō)，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長(zhǎng)鏈高分子組成。20多種氨基酸經(jīng)過(guò)不同排列組合，可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達(dá)到一個(gè)天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡(jiǎn)單得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過(guò)排列核組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當(dāng)時(shí)認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行的三個(gè)著名實(shí)驗(yàn)的論證（肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、噬菌體感染試驗(yàn)、病毒的拆開(kāi)與重建試驗(yàn)），才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì)。第七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日1928年，Griffith進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn)：（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

對(duì)小鼠注射活RII菌或死SIII菌————小鼠存活

對(duì)小鼠注射活SIII菌————————小鼠死亡

對(duì)小鼠注射活RII菌和熱死SIII菌———小鼠死亡

抽取心血分離

活的SIII菌一、證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象：Streptococcuspneumoniae（肺炎雙球菌）

SIII型菌株：有莢膜，菌落表面光滑，有致病性

RII型菌株：無(wú)莢膜，菌落表面粗糙，無(wú)致病性（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（transformation）第八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日混合培養(yǎng)RII型活菌SIII型活菌SIII型熱死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死Griffith轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示意

第九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（3）S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：加熱殺死的SIII型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過(guò)某種方式進(jìn)入RII型細(xì)胞并使RII型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)镾III型細(xì)胞。熱死SIII菌—————不生長(zhǎng)

活RII菌—————長(zhǎng)出RII菌

熱死SIII菌—————長(zhǎng)出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌無(wú)細(xì)胞抽提液——長(zhǎng)出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培養(yǎng)第十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖活R菌長(zhǎng)出S菌只有R菌

1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，并在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：只有S型細(xì)菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說(shuō)明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子。第十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性第十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日沉淀中含25%放射性以32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性第十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分離。分離后的RNA在沒(méi)有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子。第十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日MTV HRVHRV MTV（1）RNA（TMV）-蛋白質(zhì)（HRV）（2）RNA（HRV）-蛋白質(zhì)（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。

上述結(jié)果說(shuō)明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對(duì)方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：第十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（一）核酸存在的七個(gè)水平及質(zhì)粒細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核細(xì)胞核水平:原與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長(zhǎng)度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平： 信息單位,起始和終止,核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式第十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日三、原核生物的質(zhì)粒定義：是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋DNA分子，能獨(dú)立于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制。大?。杭s為2-100×106Dalton，上面攜帶有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因。性質(zhì)：①可以在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體之外獨(dú)立存在（游離態(tài)），也可以通過(guò)交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；②質(zhì)粒是一種復(fù)制子（replicon），根據(jù)自我復(fù)制能力的不同，可把質(zhì)粒復(fù)制的控制形式分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細(xì)胞核控制，與染色體DNA復(fù)制相伴隨,一般一個(gè)寄主細(xì)胞內(nèi)只有少數(shù)幾個(gè)（1-5）個(gè)拷貝；松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細(xì)胞核控制，在染色體DNA復(fù)制停止的情況下仍可以進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到10-200個(gè)或更多。第十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日③可以通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)菌細(xì)胞中，使兩個(gè)細(xì)胞都成為帶有質(zhì)粒的細(xì)胞；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。④對(duì)于細(xì)菌的生存并不是必要的⑤功能多樣化功能：進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。存在范圍：很多細(xì)菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis、根癌土壤桿菌等制備：包括增殖、裂解細(xì)胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除RNA和蛋白質(zhì)等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法三、原核生物的質(zhì)粒第十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日幾種代表性質(zhì)粒Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibioticresistantgenes.1.F–因子（fertilityfactor）：又稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相當(dāng)于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個(gè)中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。存在于腸細(xì)菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細(xì)菌中，決定性別。第十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（Shigelladysenteriae），后來(lái)發(fā)現(xiàn)還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個(gè)DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性決定R因子（r-determinant），RTF為分子量約為11×106Dalton，控制質(zhì)粒copy數(shù)及復(fù)制，抗性決定質(zhì)粒大小不固定，從幾百萬(wàn)到100×106Dalton以上。其上帶有其它抗生素的抗性基因。R-因子在細(xì)胞內(nèi)的copy數(shù)可從1~2個(gè)到幾十個(gè)，分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_(dá)2000~3000個(gè)/細(xì)胞。2.R因子（resistancefactor）第二十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的細(xì)菌素，能通過(guò)抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細(xì)菌。其分子量約4×104-8×104Dalton。大腸桿菌素都是由Col因子編碼的。Col因子可分為兩類，分別以ColE1和ColIb為代表。ColE1分子量約為5×106Dalton，無(wú)接合作用，是多copy的；ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。ColIb分子量約為80×106Dalton，它與F因子相似，具有通過(guò)接合作用轉(zhuǎn)移的功能，屬于嚴(yán)緊型控制，只有1-2個(gè)copy。凡帶Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對(duì)大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。3.Col因子（colicinogenicfactor）第二十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日4.Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）即誘癌質(zhì)粒。存在于根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）中,可引起許多雙子葉植物的根癌。當(dāng)細(xì)菌侵入植物細(xì)胞中后，在其細(xì)胞中溶解，把細(xì)菌的DNA釋放到植物細(xì)胞中。這時(shí)，含有復(fù)制基因的Ti質(zhì)粒的小片段與植物細(xì)胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞。Ti質(zhì)粒長(zhǎng)200kb，是一個(gè)大型質(zhì)粒。當(dāng)前，Ti質(zhì)粒已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到Ti質(zhì)粒中，并進(jìn)一步使之整合到植物染色體上，以改變?cè)撝参锏倪z傳性，達(dá)到培育植物優(yōu)良品種的目的。第二十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日是近年來(lái)在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分子量為200~300×106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。6.巨大質(zhì)粒（mega質(zhì)粒）5.降解性質(zhì)粒降解性質(zhì)粒只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質(zhì)粒可為一系列能降解復(fù)雜物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細(xì)菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質(zhì)粒，XYL（二甲苯）質(zhì)粒，SAL（水楊酸）質(zhì)粒，MDL（扁桃酸）質(zhì)粒，，NAP（奈）質(zhì)粒和TOL（甲苯）質(zhì)粒等。第二十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日基因原核生物基因系統(tǒng)：

啟動(dòng)子（基因） 操縱子 操縱子（基因）基因調(diào)控系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因

調(diào)節(jié)基因基因是能夠表達(dá)和產(chǎn)生基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或RNA）的DNA序列。第二十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞水平：大部分或全部DNA都集中于細(xì)胞核或核質(zhì)體中，不同種類微

生物或同種不同細(xì)胞中細(xì)胞核的數(shù)目不同；

染色體水平：真核微生物的每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)含有一定數(shù)量的染色體；而原核微生物中一個(gè)核質(zhì)體就是一個(gè)裸露的、光學(xué)顯微鏡下不能看到的環(huán)狀染色體。一些真核生物和原核生物基因組的比較

生物單倍體的分子量核苷酸已知染色體數(shù)約數(shù)（Da）對(duì)數(shù)基因數(shù)人 32 3~5×10125~7×109~4000黑腹果蠅4 7.9×10108.0×1075000~6000粗糙脈孢菌7 2.8×10104.5×107>500大腸桿菌1 2.5×1093.8×106 ~1027噬菌體T41 1.1×1082.0×105 ~135噬菌體1 3.2×107

4.8×104~35噬菌體MS21 1.1×1063.5×1033 第二十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日密碼子（coden）：由3個(gè)核苷酸順序決定，負(fù)載遺傳信息的基本單位不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：只有DNA雙鏈的一股才作為有意義鏈被轉(zhuǎn)錄，這種現(xiàn)象又稱不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。起始密碼子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸終止密碼子：UAA、UGA、UAG遺傳密碼指DNA鏈上各個(gè)核苷酸的特定排列順序第二十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日核外DNA的種類核外染色體真核生物的“質(zhì)粒”原核生物的質(zhì)粒 線粒體細(xì)胞質(zhì)基因 葉綠體（質(zhì)體） 中心體 動(dòng)體共生生物： 卡巴顆粒酵母菌的2m質(zhì)粒F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒第二十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)基因突變和誘變育種突變（mutation）指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。染色體畸變——細(xì)胞學(xué)上可以看到染色體的變化基因突變——細(xì)胞學(xué)上看不到遺傳物質(zhì)的變化突變體（mutant）發(fā)生了突變的微生物細(xì)胞或菌株野生型（wildtype）從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株第二十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日★依表型的改變分為：形態(tài)突變型——營(yíng)養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變類型。發(fā)酵突變型——喪失產(chǎn)生某種生物合成酶能力的突變型抗性突變型——因突變而產(chǎn)生了對(duì)某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長(zhǎng)繁殖，而在另一條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)繁殖的突變型抗原突變型——因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)量突變型——

（一）基因突變的類型第二十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日★按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細(xì)胞來(lái)分：選擇性突變株（selectivemutant）：具有選擇標(biāo)記（如營(yíng)養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-selectivemutant）：無(wú)選擇標(biāo)記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。第三十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第三十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（二）突變率定義：每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率為10–8是指該細(xì)胞在一億次細(xì)胞分裂中，會(huì)發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來(lái)表示。如一個(gè)含108個(gè)細(xì)胞的群體，當(dāng)其分裂為2×108個(gè)細(xì)胞時(shí)，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10–8。突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù)突變是獨(dú)立的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其它基因的突變率。在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因突變的幾率是極低的，因?yàn)殡p重突變型的幾率只是各個(gè)突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用檢出選擇性突變株的手段，尤其是采用檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型的恢復(fù)突變株（backmutant或reversemutant）或抗性突變株特別是抗藥性突變株的方法來(lái)加以確定。第三十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日若干細(xì)菌某一性狀的自發(fā)突變率菌名 突變性狀變率E.coli 抗T1噬菌體 3×10–8E.coli 抗T3噬菌體 1×10–7

E.coli 不發(fā)酵乳糖 1×10–10E.coli 抗紫外線 1×10–5Staphylococcusaureus 抗青霉素 1×10–7S.aureus 抗鏈霉素 1×10–9

Salmonellatyphi 抗25g/L鏈霉素 1×10–6

Bacillusmegaterium 抗異煙肼 5

×10–5

第三十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（三）突變的特點(diǎn)適用于整個(gè)生物界，以細(xì)菌的抗藥性為例。不對(duì)應(yīng)性：突變的性狀與突變?cè)蛑g無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。自發(fā)性：突變可以在沒(méi)有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨(dú)立性：各種突變獨(dú)立發(fā)生，不會(huì)互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突 變（forwardmutation），從突變株回到野生型的過(guò)程則稱為回復(fù)突變或回變（backmutation或reversemutation）。第三十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（四）基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明在各種基因突變中，抗性突變最為常見(jiàn)。但在過(guò)去相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)這種抗性產(chǎn)生的原因爭(zhēng)論十分激烈。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，突變是通過(guò)適應(yīng)而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對(duì)象）誘發(fā)出來(lái)的，突變的原因和突變的性狀間是相對(duì)應(yīng)的，并認(rèn)為這就是“定向變異”，也有人稱它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認(rèn)為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對(duì)的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯(cuò)綜在一起，所以難以探究問(wèn)題的實(shí)質(zhì)。從1943年起，經(jīng)過(guò)幾個(gè)嚴(yán)密而巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要攻克了檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場(chǎng)紛爭(zhēng)。第三十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日變量試驗(yàn)又稱波動(dòng)試驗(yàn)或彷徨試驗(yàn)。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，設(shè)計(jì)了左方的實(shí)驗(yàn)。1.變量試驗(yàn)fluctuationtest第三十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日2.涂布試驗(yàn)原理與變量試驗(yàn)相同，方法更為簡(jiǎn)便，且可計(jì)算突變率。第三十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日涂布試驗(yàn)中突變率的計(jì)算初始接種量：5×104個(gè)/皿培養(yǎng)5小時(shí)，繁殖了12.3代，每個(gè)微菌落約含5100個(gè)細(xì)菌這時(shí)，每個(gè)平皿上的細(xì)胞數(shù)為：5100×5×104≈2.6×108個(gè)/皿在6個(gè)平板上，比接種時(shí)增加的細(xì)胞數(shù)為： 6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個(gè)突變，故突變率=28/15.6×108=1.8×108第三十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日3.平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦的論文《平板影印培養(yǎng)法和細(xì)菌突變株的間接選擇》，更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的，這一突變與相應(yīng)藥物環(huán)境毫不相干。平板影印培養(yǎng)法，是一種能達(dá)到在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種培養(yǎng)方法：把長(zhǎng)有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有滅菌絲絨布的木質(zhì)圓柱印章上，使其沾上來(lái)自平板上的菌落。然后可把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上。待這些平板培養(yǎng)后，對(duì)各平板相同位置上的菌落作對(duì)比后，就可選出適當(dāng)?shù)耐蛔冃途?。?jù)報(bào)道，用此法可把母平板上10~20%量的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到絲絨布上，并可利用這一“印章”接種8個(gè)子培養(yǎng)皿。因此，通過(guò)影印培養(yǎng)法，就可以從在非選擇性條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌群體中，分離出各種類型的突變。第三十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第四十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日平板影印培養(yǎng)法在根本未接觸過(guò)任何一點(diǎn)鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說(shuō)明了突變是自發(fā)產(chǎn)生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。平板影印培養(yǎng)不僅在微生物遺傳理論的研究中有重要應(yīng)用，而且在育種時(shí)間和其它研究中均有應(yīng)用，值得很好地領(lǐng)會(huì)。第四十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（五）基因突變的機(jī)制基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點(diǎn)突變和畸變。具體類型可歸納如下：第四十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日1.誘變機(jī)制誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑.種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。按照遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的特點(diǎn)討論幾種有代表性的誘變劑的作用機(jī)制。第四十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（1）堿基置換（substitution）定義：對(duì)DNA來(lái)說(shuō)，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點(diǎn)突變（pointmutation）。它只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換。分類：轉(zhuǎn)換（transition），即DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換；

顛換（transversion），即一個(gè)嘌呤被一個(gè)嘧啶,或是一個(gè)嘧啶被一個(gè)嘌呤所置換。對(duì)某一具體誘變劑來(lái)說(shuō)，即可同時(shí)引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學(xué)誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機(jī)制分成以下兩類來(lái)討論。第四十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第四十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日直接引起置換的誘變劑定義：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑，不論在機(jī)體內(nèi)或是在離體條件下均有作用。種類：很多。例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個(gè)或幾個(gè)核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)一步使微生物發(fā)生變異。羥胺只引起G┇C→A:T，其余都是可使G┇C=A:T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有（參見(jiàn)下表）。第四十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日若干誘變劑的作用機(jī)制及誘變功能誘變因素在DNA上的初級(jí)效應(yīng)遺傳效應(yīng)堿基類似物摻入作用AT=GC雙向轉(zhuǎn)換羥胺與胞嘧啶起反應(yīng)GC→AT的轉(zhuǎn)換亞硝酸 A、G、C的氧化脫氨作用交聯(lián)AT=GC雙向轉(zhuǎn)換缺失烷化劑烷化堿基（主要是G）烷化磷酸基團(tuán)喪失烷化的嘌呤糖-磷酸骨架的斷裂AT=GC雙向轉(zhuǎn)換AT→TA的顛換GC→CG的顛換巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位）丫啶類堿基之間相互作用雙鏈變形碼組移動(dòng)（＋或－）紫外線嘧啶的水合物形成嘧啶的二聚體交聯(lián)GC→AT轉(zhuǎn)換碼組移動(dòng)（＋或－）電離輻射堿基的羥基化核降解DNA降解 糖-磷酸骨架的斷裂喪失嘌呤AT=GC雙向轉(zhuǎn)換碼組移動(dòng)（＋或－）巨大損傷（缺失、重復(fù)、倒位、易位）加熱C脫氨基CG→TA轉(zhuǎn)換Mu噬菌體結(jié)合到一個(gè)基因中間碼組移動(dòng) 第四十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（A）次黃嘌呤（H）HNO2鳥(niǎo)嘌呤（G）黃嘌呤（X）這些反應(yīng)及形成物均可在DNA復(fù)制中產(chǎn)生影響，主要是使堿基對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)換。堿基轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制——以亞硝酸為例第四十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第四十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

腺嘌呤（A）變成次黃嘌呤（H）后引起的轉(zhuǎn)換過(guò)程①腺嘌呤氧化脫氨后形成烯醇式次黃嘌呤（He）②He通過(guò)互變異構(gòu)效應(yīng)形成酮式次黃嘌呤（HK）③DNA復(fù)制時(shí)，HK與胞嘧啶（C）配對(duì)④DNA第二次復(fù)制時(shí)，C與G正常配對(duì)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換。第五十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日亞硝酸引起的AT-GC轉(zhuǎn)換細(xì)節(jié)第五十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日這類誘變劑主要是一些堿基類似物,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、疊氮胸腺嘧啶（AIT）等等；

作用方式：通過(guò)活細(xì)胞的代謝活動(dòng)參入到DNA分子中，主要是在DNA復(fù)制時(shí)堿基類似物插入DNA中，引起堿基對(duì)配對(duì)錯(cuò)誤，造成堿基置換。以5-溴尿嘧啶(5-BU)為例：5-BU是胸腺嘧啶（T）的類似物，酮式的5-BU可以和A配對(duì)，烯醇式的5-BU可以和G配對(duì)，在DNA分子復(fù)制的過(guò)程中，由于5-BU的插入和互變異構(gòu)導(dǎo)致堿基置換。間接引起置換的誘變劑第五十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第五十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日5-BU引起的轉(zhuǎn)換第五十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日5-BU引起的轉(zhuǎn)換從上圖中，還可以看到5-BU的摻入引起的G┇C回復(fù)到A?T的過(guò)程。通過(guò)這兩個(gè)圖示，就很容易理解為什么同一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產(chǎn)生回復(fù)突變的原因了。也可以知道，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對(duì)正在進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對(duì)休止細(xì)胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。第五十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第五十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（2）移碼突變frame-shiftmutation或phase-shiftmutation，指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shiftmutant）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。第五十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日?qǐng)D8-14——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物引起移碼突變的誘變劑：主要是吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤—嘧啶對(duì)十分相似。第五十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日丫啶類化合物的誘變機(jī)制至今還不很清楚。有人認(rèn)為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤–嘧啶對(duì)十分相似，故能嵌入兩個(gè)相鄰DNA堿基對(duì)之間，造成雙螺旋的部分解開(kāi)（兩個(gè)堿基對(duì)原來(lái)相距0.34nm，當(dāng)嵌入一個(gè)丫啶分子時(shí)，就變成0.68nm），從而在DNA復(fù)制過(guò)程中，會(huì)使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。第五十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示第六十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第六十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（3）染色體畸變（chromosomalaberration）某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點(diǎn)突變外，還會(huì)引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，它包括：染色體結(jié)構(gòu)上的變化：缺失（deletion）重復(fù)（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色體數(shù)目的變化第六十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日染色體結(jié)構(gòu)上的變化分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類。染色體內(nèi)畸變：只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復(fù)時(shí)，其結(jié)果可造成基因的減少或增加；如發(fā)生倒位或易位時(shí)，則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。倒位--------是指斷裂下來(lái)的一段染色體旋轉(zhuǎn)180后，重新插入到原來(lái)染色體的原位置上，從而使其基因順序與其它的基因順序相反；易位--------是指斷裂下來(lái)的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變：指非同源染色體間的易位。第六十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日染色體畸變第六十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement）由40年代B.McClintock對(duì)的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，自1967年以來(lái)，已在微生物和其它生物中得到普遍證實(shí)，并已成為分子遺傳學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。舊概念：基因是固定在染色體DNA上的一些不可移動(dòng)的核苷酸片段。新發(fā)現(xiàn)：有些DNA片段不但可在染色體上移動(dòng)，還可從一個(gè)染色體跳到另一個(gè)染色體，從一個(gè)質(zhì)粒跳到另一個(gè)質(zhì)?；蛉旧w，甚至還從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。在這些DNA順序的跳躍過(guò)程中，往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動(dòng)或關(guān)閉，結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生。轉(zhuǎn)座因子（transposibleelement）：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。也稱作跳躍基因（jumpinggene）或可移動(dòng)基因（movablegene）。第六十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)座因子的種類（1）插入序列（IS，insertionsequence）：特點(diǎn)是分子量最?。▋H0.7~1.4kb），只能引起轉(zhuǎn)座（transposition）效應(yīng)而不含其它基因?？梢栽谌旧w、F因子等質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)它們。已知的IS有5種，即IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E.coli的F因子和核染色體組上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通過(guò)這些同源序列間的重組，就可使F因子插入到E.coli的核染色體組上，從而使后者成為Hfr菌株。因IS在染色體組上插入的位置和方向的不同，其引起的突變效應(yīng)也不同。IS引起的突變可以回復(fù)，其原因可能是IS被切離，如果因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列，就會(huì)在插入部位造成缺失，從而發(fā)生新的突變。第六十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)座因子的種類（2）轉(zhuǎn)座子（Tn，transposon，又稱轉(zhuǎn)位子，易位子）：IS和Mu噬菌體相比，Tn的分子量是居中的（一般為2~25kb）。它含有幾個(gè)至十幾個(gè)基因，其中除了與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外，還含有抗藥基因或乳糖發(fā)酵基因等其它基因。Tn雖能插到受體DNA分子的許多位點(diǎn)上，但這些位點(diǎn)似乎也不完全是隨機(jī)的，其中某些區(qū)域更易插入。第六十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)座因子的種類（3）Mu噬菌體（即mutatorphage，誘變噬菌體）：它是E.coli的一種溫和噬菌體。與必須整合到宿主染色體特定位置上的一般溫和噬菌體不同，Mu噬菌體并沒(méi)有一定的整合位置。與以上的IS和Tn兩種轉(zhuǎn)座因子相比，Mu噬菌體的分子量最大（37kb），它含有20多個(gè)基因。Mu噬菌體引起的轉(zhuǎn)座可以引起插入突變，其中約有2%是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變。第六十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日2.自發(fā)突變機(jī)制自發(fā)突變是指在沒(méi)有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)過(guò)氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。它對(duì)Neurospora（脈孢菌）有誘變作用，這種作用可因同時(shí)加入過(guò)氧化氫酶而降低，如果在加入該酶的同時(shí)又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。這就說(shuō)明，過(guò)氧化氫很可能是“自發(fā)突變”中一種內(nèi)源性誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因。第六十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日互變異構(gòu)效應(yīng)堿基T、G的第六位上是酮基，會(huì)以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)C、A的第六位上是氨基，會(huì)以氨基式或亞氨基式兩種互變異構(gòu)的狀態(tài)出現(xiàn)平衡一般趨向于酮式或氨基式，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以A︰T和G┇C堿基配對(duì)的形式出現(xiàn)在偶然情況下，在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，在T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時(shí)，其相對(duì)位置上就出現(xiàn)G同樣，如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在DNA復(fù)制到達(dá)這一位置的瞬間，則在新合成DNA單鏈中與C相對(duì)應(yīng)的位置上就將是A。這可能就是發(fā)生相應(yīng)的自發(fā)突變的原因。要預(yù)言在某一時(shí)間、某一基因發(fā)生自發(fā)突變是不可能的。在運(yùn)用數(shù)學(xué)方法對(duì)這些偶然事件做大量統(tǒng)計(jì)分析后，可以發(fā)現(xiàn)并掌握其中的規(guī)律。例如，據(jù)統(tǒng)計(jì)，堿基對(duì)發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10–8~10–9。第七十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日環(huán)出效應(yīng)即環(huán)狀突出效應(yīng)。有人提出，在DNA的復(fù)制過(guò)程中，如果其中某一單鏈上偶然產(chǎn)生一個(gè)小環(huán)，則會(huì)因其上的基因越過(guò)復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。下圖就是環(huán)出效應(yīng)的設(shè)想機(jī)制。在上鏈中，標(biāo)記B處發(fā)生“環(huán)出”，故只有A及C能獲得復(fù)制，從而發(fā)生自發(fā)突變。而在下鏈中，復(fù)制仍正常進(jìn)行第七十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)已知的DNA損傷類型很多，機(jī)體對(duì)其修復(fù)的方式也各異。發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線（U.V.，ultravioletray）的作用。嘧啶對(duì)紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起突變或死亡。在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少。但一旦形成，就會(huì)妨礙雙鏈的解開(kāi)，因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細(xì)胞死亡。第七十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第七十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日光復(fù)活作用（photoreactivation）定義：經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見(jiàn)光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。這一現(xiàn)象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomycesgriseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來(lái)，在許多微生物中都得到了證實(shí)。最明顯的是在E.coli的實(shí)驗(yàn)中：對(duì)照：8×106個(gè)/mlE.coliU.V. 100個(gè)/mlE.coli試驗(yàn)：8×106個(gè)/mlE.coliU.V.360~490nm2×106個(gè)/mlE.coli

可見(jiàn)光，30分經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會(huì)被一種光激活酶（photoreactivatingenzyme）即光裂合酶（photolyase）結(jié)合，當(dāng)形成的復(fù)合物暴露在可見(jiàn)光（300~500nm）下時(shí)，此酶會(huì)因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。與此同時(shí)，光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來(lái)，以便重新執(zhí)行功能。每一E.coli細(xì)胞中約含有25個(gè)光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。第七十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日?qǐng)D:光復(fù)活作用第七十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日暗修復(fù)作用（darkrepair）又稱切除修復(fù)（excisionrepair）。是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機(jī)制。這種修復(fù)作用與光無(wú)關(guān)。有四種酶參與——①內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側(cè)切開(kāi)一個(gè)3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起逐個(gè)延長(zhǎng)，重新合成一段缺失的DNA鏈；④通過(guò)連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端與原鏈的5’-P末端相連接，從而完成了修復(fù)作用。第七十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日暗修復(fù)作用（darkrepair）1、由核酸內(nèi)切酶切開(kāi)二聚體的5’末端，形成3’-OH和5’-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、連接酶將新合成的3’-OH與原有的5’-P相連接。第七十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第七十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日紫外誘變方法設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長(zhǎng)為253、7nm,功率是15W處理時(shí)的照射距離：20cm—30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過(guò)3mm照射時(shí)，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時(shí)間或死亡率作為相對(duì)劑量。第七十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時(shí)間、菌液濃度、菌液厚度、細(xì)胞本身特性等因素有關(guān)，所以單純用時(shí)間表示照射劑量并不完全可靠。一定的死亡率必定對(duì)應(yīng)一定的照射劑量，所以，在實(shí)際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。通常先繪制照射時(shí)間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量：死亡率為70%——80%左右。第八十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日重組修復(fù)必須在DNA復(fù)制的情況下進(jìn)行，所以又叫復(fù)制后修復(fù)。細(xì)胞在不切除二聚體的情況下，以帶有二聚體的這條鏈為模板合成互補(bǔ)單鏈，但在每個(gè)二聚體附近留有一空隙。通過(guò)染色體交換，空隙部位就不在面對(duì)著胸腺嘧啶二聚體，而是面對(duì)著正常的單鏈，在這種條件下，DNA聚合酶和連接酶起作用將空隙部位進(jìn)行修復(fù)，重組修復(fù)中的DNA損傷并沒(méi)有去除，但隨著微生物的傳代繁殖，損傷的比例逐漸降低。第八十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第八十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日誘變育種：是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過(guò)篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門(mén)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無(wú)例外地都是通過(guò)誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。（七）誘變育種第八十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

誘變育種的步驟原始菌種純化斜面/肉湯培養(yǎng)單孢子/單細(xì)胞懸液誘變劑處理平板分離移至斜面小試中試初篩復(fù)篩計(jì)算存活率觀察形態(tài)變異，挑單菌落良種保藏原菌種特性鑒定第八十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日誘變育種的基本過(guò)程選擇選擇合適的出發(fā)菌株↓制備待處理的菌懸液↓誘變處理↓篩選↓保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)第八十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

1.出發(fā)菌株的選擇

出發(fā)菌株———用來(lái)育種處理的起始菌株

◆出發(fā)菌株應(yīng)具備：

①對(duì)誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來(lái)源；

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株：

③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：第八十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日2.制備細(xì)胞懸液

要求：

①菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)；

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免表型遲延現(xiàn)象（phenotypiclag）;

方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾。

制備：

物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液

濃度：

細(xì)菌、放線菌108個(gè)/ml

霉菌、酵母菌106個(gè)/ml第八十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日表型遲延現(xiàn)象:指某一突變?cè)贒NA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出來(lái)，造成不純的菌落。產(chǎn)生原因：①分離性遲延現(xiàn)象;②生理性遲延現(xiàn)象

3.誘變處理

誘變劑的作用：①提高突變的頻率②擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度③使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動(dòng)

劑量的表示法：不同種類和不同生長(zhǎng)階段的微生物對(duì)誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對(duì)菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量?！滤缆适亲詈玫恼T變劑相對(duì)劑量的表示方法。

最適劑量的選擇：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70～80%）第八十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時(shí)，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。簡(jiǎn)便有效的誘變方法：紫外線的照射最為方便?；瘜W(xué)誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反映的方法很多，實(shí)際工作時(shí)可參看有關(guān)書(shū)籍。一種較有效的簡(jiǎn)易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長(zhǎng)出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個(gè)檢出法選出突變種。第八十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日誘變處理方式：

單一因子處理：復(fù)合因子處理：先后使用同時(shí)使用單一因子重復(fù)使用兩種以上因素第九十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日4.菌種篩選4.1篩選方案：實(shí)際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來(lái)，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；——因此，初篩工作以量為主，測(cè)定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡(jiǎn)單。復(fù)篩的目的：確認(rèn)符合要求的菌株；——復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.常用誘變劑的使用方法第九十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日可見(jiàn)，設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法極其重要以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下第九十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第一輪：一個(gè)出發(fā)菌株→→→選出200個(gè)菌株→→→選出50株→→→選出5株誘變處理初篩（每瓶一株）復(fù)篩（每瓶四株）第二輪：5個(gè)出發(fā)菌株→→→→→→選出50株→→→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復(fù)篩（每瓶一株）（每瓶四株）第九十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日4.2變異菌的一般篩選方法4.2.1平皿快速檢測(cè)法變色圈法透明圈法生長(zhǎng)圈法抑菌圈法梯度平板法4.2.2搖瓶培養(yǎng)法第九十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日以溫度敏感突變?yōu)槔汉Y選方法：用途：常用于提高代謝物產(chǎn)量原因：是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后，在高溫下活力喪失重要性：如果此酶為蛋白質(zhì)、核酸合成途徑中所需的酶，則此變異株在高溫下的表型就是營(yíng)養(yǎng)缺陷型。4.3.1條件抗性突變型的篩選4.3特殊變異菌的篩選方法第九十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日在富含生物素的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)：先在30℃（允許條件）中進(jìn)行培養(yǎng)以得到大量菌細(xì)胞，適當(dāng)時(shí)間后提高溫度（40℃，非允許條件），即能獲得谷氨酸的過(guò)量生產(chǎn)。應(yīng)用舉例由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌2256，經(jīng)誘變處理得到溫度敏感變異株Ts88:30℃培養(yǎng)時(shí)能正常生長(zhǎng)40℃是死亡，但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸（而野生型卻受生物素的反饋抑制）。第九十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日方法：梯度平板法（gradientplate）4.3.2抗藥性突變株的篩選抗藥性突變株的應(yīng)用：作為菌株的遺傳標(biāo)記作為生產(chǎn)菌種（結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株）第九十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日4.3.3抗生素抗性變異株的篩選第九十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

★與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體：營(yíng)養(yǎng)缺陷型：經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長(zhǎng)的變異菌株。如：lys-，bio-

野生型：自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。

如：lys+;bio+;原養(yǎng)型：指營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。

4.3.4營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選第九十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的天然或半合成培養(yǎng)基。

補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基。第一百頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日營(yíng)養(yǎng)缺陷型誘變篩選步驟及方法auxo的鑒定

誘變處理auxo的濃縮auxo的檢出第一百零一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日缺陷型的濃縮①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長(zhǎng)著的微生物細(xì)胞，對(duì)休止態(tài)細(xì)胞無(wú)作用。方法：將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中第一百零二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日②菌絲過(guò)濾法適用于：絲狀（放線菌、霉菌）原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過(guò)濾膜，野生型菌絲不能通過(guò)。第一百零三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日①逐個(gè)檢出法缺陷型的檢出第一百零四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

②影印平板培養(yǎng)法第一百零五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日③夾層培養(yǎng)法第一百零六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日①生長(zhǎng)譜法方法簡(jiǎn)便；回變和污染不影響結(jié)果測(cè)定物質(zhì)可為粉末或紙片

缺陷型的鑒定測(cè)定一般應(yīng)分兩階段：第一階段：測(cè)定是哪類物質(zhì)的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進(jìn)一步確定是哪種具體化合物的缺陷型；第一百零七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日組合營(yíng)養(yǎng)物法步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a.將多種營(yíng)養(yǎng)因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c.結(jié)果分析；一組：1

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二組：26

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五組：59121415營(yíng)養(yǎng)因子分組編排時(shí)注意；1）每組內(nèi)無(wú)重復(fù)的營(yíng)養(yǎng)因子2）每組中應(yīng)包含只出現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應(yīng)分別出現(xiàn)二次如：第一百零八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日一組：1

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五組：59121415第一百零九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日②組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法將待測(cè)的菌點(diǎn)種到各種補(bǔ)充培養(yǎng)基上，逐個(gè)分析各菌的缺陷類型，或快速分離出所需缺陷類型的菌株。ABFEDCHG第一百一十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日缺陷型的應(yīng)用作為菌株的遺傳標(biāo)記：進(jìn)行基因工程、誘變育種、研究代謝過(guò)程時(shí)用作親本標(biāo)記；作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種；作為aa、維生素、堿基的測(cè)定菌株。第一百一十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日Amestest：對(duì)化學(xué)誘變劑做檢測(cè)菌種：鼠傷寒沙門(mén)氏菌his-；原理：his-在基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)；而發(fā)生回復(fù)突變則長(zhǎng)。第一百一十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日Amestest方法示意圖第一百一十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)基因重組定義：凡把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳型個(gè)體的方式，稱為基因重組（generecombination）或遺傳重組。作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個(gè)體。重組與雜交的關(guān)系：重組是分子水平上的一個(gè)概念，可以理解成是遺傳物質(zhì)分子水平上的雜交而一般所說(shuō)的雜交（hybridization）則是細(xì)胞水平上的一個(gè)概念。雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。真核微生物中的有性雜交、準(zhǔn)性雜交（parasexualhybridization）等及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映。第一百一十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日微生物中各種形式基因重組的比較重組范圍供體和受體的關(guān)系 整套染色體局部雜合高頻率低頻率部分染色體個(gè)別或少數(shù)基因細(xì)胞融合或聯(lián)結(jié)性細(xì)胞真菌的有性生殖體細(xì)胞真菌的準(zhǔn)性生殖細(xì)胞間暫時(shí)溝通細(xì)菌的接合性導(dǎo)細(xì)胞間不接觸吸收游離DNA片段轉(zhuǎn)化噬菌體攜帶DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體提供遺傳物質(zhì)完整噬菌體溶源轉(zhuǎn)變噬菌體DNA轉(zhuǎn)染第一百一十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日基因重組的意義基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。雜交育種的優(yōu)點(diǎn)：①由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺(jué)性方面，均比誘變育種前進(jìn)了一大步。②利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。雜交育種的缺點(diǎn)：由于雜交育種的方法較復(fù)雜，工作進(jìn)展較慢，還很難像誘變育種技術(shù)那樣得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領(lǐng)域中，應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來(lái)培育可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見(jiàn)。到了70年代后期，由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后，才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。第一百一十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高基因重組生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高第一百一十七頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日一、原核微生物的基因重組基因重組的方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)接合原生質(zhì)體融合第一百一十八頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

R型活菌+S型死菌→→S型活菌定義：受體菌自然或在人工技術(shù)作用下直接攝取來(lái)自供體菌的游離DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。有關(guān)名詞：受體菌：recipient/receptor，轉(zhuǎn)化基因的接受者供體菌：donor，轉(zhuǎn)化基因的提供者轉(zhuǎn)化因子：來(lái)自供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)化子：transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進(jìn)入自身染色體組的重組子（一）轉(zhuǎn)化（transformation）1、轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn)第一百一十九頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

①受體細(xì)胞要處于感受態(tài).感受態(tài)：competence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)②供體DNA片段（轉(zhuǎn)化因子）大小適宜，分子量一般為1×107

D左右③菌株間的親緣關(guān)系密切2、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件

3、轉(zhuǎn)化的類型根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為：①自然遺傳轉(zhuǎn)化naturalgenetictransformation②人工轉(zhuǎn)化artificialtransformation第一百二十頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日

感受態(tài)出現(xiàn)時(shí)間：只在細(xì)菌生長(zhǎng)的某一時(shí)期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長(zhǎng)時(shí)期Streptococcuspneumoniae的感受態(tài)出現(xiàn)在生長(zhǎng)曲線中的指數(shù)期的中期，Bacillus的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。感受態(tài)由細(xì)胞的遺傳性決定，但同時(shí)也受環(huán)境因子的影響：cAMP、Ca2+等最明顯。如用CaCl2處理E.coli可以誘發(fā)其產(chǎn)生感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞的比例：當(dāng)處于感受態(tài)高峰時(shí)，群體中呈感受態(tài)的細(xì)胞因菌種而不同.Bacillussubtilis不超過(guò)10~15%Streptococcuspneumonia和Haemophilusinfluenzae（流感嗜血桿菌）達(dá)到100%轉(zhuǎn)化DNA的最低濃度：在群體中含有15%感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，0.1gDNA/ml細(xì)胞懸液即可有效發(fā)生轉(zhuǎn)化第一百二十一頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日感受態(tài)因子：細(xì)胞外蛋白，Streptococcuspneumonia和Bacillus中分離的分子量為5,000~10,000Dalton，可能存在于細(xì)胞膜上，可催化外來(lái)DNA分子的吸收或降解細(xì)胞表面某種成分，以讓細(xì)胞表面的DNA受體顯露出來(lái)；也可能是一種自溶酶。對(duì)不同細(xì)菌，每個(gè)細(xì)胞上的DNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)不同。有人計(jì)算，在H.Influenzae上有4~10個(gè)，而在S.Pneumonia上則有30~80個(gè)。S.Pneumonia的感受態(tài)細(xì)胞中提取的感受態(tài)因子可使同菌株的非感受態(tài)細(xì)胞變成感受態(tài)的，而B(niǎo)acillussubtilis的感受態(tài)因子則無(wú)此功能。第一百二十二頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子：本質(zhì)是供體DNA片段一般的轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA；也有少數(shù)報(bào)道認(rèn)為線狀單鏈DNA也有轉(zhuǎn)化作用。大小：經(jīng)過(guò)多次提純操作后，每一轉(zhuǎn)化DNA片段的分子量都小于1×107，即約占細(xì)菌核染色體組的0.3%，其上平均約含15個(gè)基因。而粗制的DNA則分子量較大。吸收數(shù)量：每個(gè)感受態(tài)細(xì)胞約可摻入10個(gè)轉(zhuǎn)化因子。轉(zhuǎn)化頻率：一般只有0.1~1%，最高時(shí)亦達(dá)10%左右。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高（因?yàn)樗M(jìn)入受體菌中后，可不必與受體染色體進(jìn)行交換、整合即可進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)）。第一百二十三頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化的過(guò)程以S.Pneumoniastrr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段：吸附：雙鏈DNA片段與細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)（主要在新形成細(xì)胞壁的赤道區(qū)）結(jié)合，此時(shí)，細(xì)胞膜上的膽堿可促進(jìn)這一過(guò)程。在吸附過(guò)程的前階段，如外界加入DNA酶，就會(huì)減少轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。稍后，DNA酶即無(wú)影響，說(shuō)明此時(shí)該轉(zhuǎn)化因子已進(jìn)入細(xì)胞；切割：在吸附位點(diǎn)上的DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成平均分子量為4~5×106的DNA片段；入胞：DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞，這是一個(gè)耗能的過(guò)程。分子量小于5×105的DNA片段不能進(jìn)入細(xì)胞。這時(shí)如用低濃度溶菌酶處理，因它提高了細(xì)胞壁的通透性，故可提高轉(zhuǎn)化頻率；重組：來(lái)自供體菌的單鏈DNA片段在細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)配對(duì)，接著受體染色體組上的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來(lái)的單鏈DNA交換、整合和取代，于是形成了一個(gè)雜合DNA區(qū)段（heterozygousregion）。在這一過(guò)程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA連接酶的參與；復(fù)制：受體菌的染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個(gè)，其中之一獲得了供體菌的轉(zhuǎn)化基因，另一個(gè)未獲供體基因；轉(zhuǎn)化子形成：當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂后，一個(gè)子細(xì)胞含供體基因，這就是轉(zhuǎn)化子；另一個(gè)細(xì)胞與原始受體菌一樣。第一百二十四頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日降解吸附切割成4~5×106單鏈入胞同源部分配對(duì)、整合復(fù)制分裂，只有一個(gè)子代DNA分子獲得供體基因非轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子第一百二十五頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化的過(guò)程strrstrr第一百二十六頁(yè)，共一百九十頁(yè)，2022年，8月28日自然轉(zhuǎn)化的普遍性到目前為止，已發(fā)現(xiàn)能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用的菌屬主要有：Streptococcuspneumoniae、Haemophilus（嗜血桿菌屬）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌屬）、Rhizobium（