第二章連接酶及其他(二)

第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶的基本性質1.修復雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵432.修復與RNA鏈結合的DNA鏈上切口處的磷酸二酯鍵一、DNA連接酶的基本性質44一、DNA連接酶的基本性質3.連接多個平頭雙鏈DNA分子：注意：（1）DNA連接酶只能連接相鄰核苷酸之間的切口（nick）；（2）如果是缺少一個或幾個核苷酸的裂口（gap），DNA連接酶是無法連接的；46（3）DNA連接酶不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA連接酶催化的連接反應是需要能量的：在大腸桿菌或其他細菌中，利用NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），在動物細胞中及噬菌體中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注意：47

T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶

T4噬菌體RNA連接酶二、DNA連接酶的種類

T4噬菌體DNA連接酶該酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，是T4噬菌體基因30編碼的產物，分子量為68ku，需要ATP作為輔助因子。兩個帶有互補粘性末端的雙鏈DNA分子一條帶有切口的雙鏈DNA分子兩個帶有平頭末端的雙鏈DNA分子DNA-RNA雜合體分子中切口該酶可連接49

大腸桿菌DNA連接酶該酶是從正常的大腸桿菌中提取的，由大腸桿菌基因組中l(wèi)ig基因編碼，分子量為75ku，需要NAD+作為輔助因子。具有同源互補粘性末端的不同DNA分子一條帶有切口的雙鏈DNA分子該酶可連接但,該酶幾乎不能催化兩個平頭末端DNA分子的連接T4噬菌體DNA連接酶該酶在DNA體外重組中比大腸桿菌DNA連接酶應用廣泛(既能連接粘性末端,也能連接平頭末端).兩種酶各自的優(yōu)點大腸桿菌DNA連接酶:該酶的連接產物轉化細菌后,假陽性背景低(由于它對DNA末端的要求比較嚴格-----互補粘性末端).52

T4噬菌體RNA連接酶T4噬菌體RNA連接酶由T4噬菌體基因63編碼,需要ATP作為輔助因子.連接反應:主要用途:

對RNA進行3′末端標記,即將32P標記的3′,5′-二磷酸單核苷加到RNA的3′端.該酶可催化單鏈DNA或RNA的5′磷酸與相鄰的3′羥基、單核苷酸共價連接.53第三節(jié)DNA聚合酶一、DNA聚合酶的分類根據(jù)DNA聚合酶所使用模板的不同,可分為:依賴于DNA的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow大片段酶T4噬菌體DNA聚合酶T7噬菌體DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆轉錄酶55

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.DNA聚合酶的分類目前,從大腸桿菌中已分離出3種DNA聚合酶,分別為:DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ:與DNA復制有關主要參與DNA的修復分子克隆中常用DNA聚合酶Ⅰ2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ是Kronberg等1956年發(fā)現(xiàn)的第一個DNA聚合酶,故也稱為Kronberg酶.①

5′3′DNA聚合酶活性

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)發(fā)揮聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。572.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質②

3′5′核酸外切酶活性

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ該活性識別單鏈，能將復制過程中3′端的錯配堿基切除，從而保證DNA復制的高保真度，也稱為校對功能。DNApolⅠ5′3′5′58③

5′3′核酸外切酶活性

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質5'3'5'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'

-P5'3'5'3'5'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'

-P5′3′外切核酸酶活性的水解作用有3個特征：

待切除的核酸分子必須具有5′端磷酸基團。核苷酸分子被切除前位于已配對的DNA雙螺旋區(qū)段上。

被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是RNA.③

5′3′核酸外切酶活性2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的性質2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的用途合成ds-cDNA第二鏈（Doublestranded)

雜交探針的制備

DNA序列分析在DNA聚合反應體系中，如果加入放射性核素標記的核苷酸，則這些標記的核苷酸將取代原來的核苷酸殘基，產生帶標記的DNA分子，這就是所謂的DNA分子雜交探針(書P36）。雜交探針的制備過程:3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′************5′5′3′*****DNAaseⅠE.ColiDNApolⅠ*dNTP圖切口平移反應原理62

Klenow片段1.Klenow片段的由來E.coliDNApolⅠ蛋白酶較小片段較大片段(Klenow片段)5′3′3′5′聚外合切酶酶活活性性性質5′3′外切酶活性

Klenow

片段的由來通常所用的Klenow片段是由枯草桿菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成,或是經過克隆產生的一條多肽鏈。

Klenow片段

Klenow片段2.Klenow片段的用途填補由DNA限制酶反應產生的凹陷3′末端。用[32P]dNTP填補凹陷的3′末端，即DNA分子的末端標記（書P32）。在cDNA克隆出來后，合成cDNA第二條鏈。用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進行DNA序列分析等。65

T4DNA聚合酶1.T4DNA聚合酶的性質T4DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow片段高100~1000倍與Klenow片段不同具有5′3′聚合酶活性具有3′5′外切酶活性與Klenow片段相同不具有5′3′外切酶活性66

T4DNA聚合酶2.T4DNA聚合酶的用途填補或標記由限制酶切割DNA后產生的凹陷3′末端，標記反應時需要高濃度的dNTP，以保證聚合反應（填補）大于3′5′核酸外切酶活性。進行3′突出末端的DNA末端標記。67

T4DNA聚合酶2.T4DNA聚合酶的用途標記用作雜交探針的DNA片段。

由3′5′核酸外切酶活性部分酶切雙鏈DNA，得到凹缺3′末端用[32P]dNTP填補（取代合成）。

將雙鏈DNA的末端轉化成平頭末端。

利用T4DNA聚合酶的3′5′核酸外切酶活性從雙鏈DNA上切除突出3′末端，在高濃度dNTP中模板上雙鏈區(qū)的降解與合成達到平衡。68

TaqDNA聚合酶1.來源TaqDNA聚合酶最初是從耐熱細菌Thermusaqraticus中純化而得，因此是一種單亞基耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶，現(xiàn)已廣泛用于基因工程的操作中。69

TaqDNA聚合酶702.性質

具有5′3′聚合酶活性最適反應溫度為75℃~80℃（據(jù)目的序列不同而不同）

TaqDNA聚合酶在60℃時其聚合酶活性下降2倍，在37℃時下降10倍。

TaqDNA聚合酶3.用途TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶鏈式反應（PCR），在體外擴增特定的DNA片段，DNA或單鏈cDNA都可作為起始模板。但在使用中應注意：①TaqDNA聚合酶需要Mg2+。②磷酸緩沖液抑制該酶活性，應避免使用。71

逆轉錄酶一、一般知識

依賴于RNA的DNA聚合酶或RNA指導的DNA聚合酶。分子量約為16萬，由分子量分別為6.2萬和9.5萬的兩個結構相關的亞單位組成。72

逆轉錄酶二、來源逆轉錄酶最主要的來源是鳥類成髓細胞性白血病病毒（AMV）。三、特性AMV逆轉錄酶的活性首先表現(xiàn)為DNA聚合酶的活性.

模板既可以是DNA,也可以是RNA.在以RNA為模板是稱為RNA指導的DNA聚合酶活性,而以DNA為模板是則叫做DNA為指導的DNA聚合酶.73

逆轉錄酶三、特性

AMV逆轉錄酶的活性其次表現(xiàn)為RNaseH活性。此酶可以特異性降解RNA-DNA雜種雙鏈中的RNA部分。另外，還具有DNA內切酶活性和核酸結合活性。74

逆轉錄酶四、用途逆轉錄酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可將任何真核基因的mRNA經反轉錄形成cDNA拷貝,然后構建克隆,大量擴增,并表達這種基因,從而為真核基因的研究與其核遺傳工程提供了一項必不可少的手段。75一、性質末端轉移酶催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3′-OH末端。這很像DNA聚合酶通過5′3′聚合5′-脫氧核苷三磷酸合成一條DNA鏈。所不同的是末端轉移酶不需要模板。第四節(jié)末端轉移酶76二、用途主要用途是給載體和外源DNA分別加上互補的同聚物尾巴，以便二者在體外連接。進行DNA3′-OH末端標記。標記物可以是放射性的，如α-32P-dNTP,也可以是非放射性的,如生物素-11-dUTP（生物素和親和素）,它們可用于DNA序列分析、DNaseⅠ足跡分析、分子雜交等實驗中。77二、用途進行同聚物接尾

用末端轉移酶給一群DNA分子3′-OH末端接上oligo（dA）或（dG）,給另一群DNA分子3′-OH末端接上oligo（dT）或（dC）,混合這兩群分子,就能使末端轉移酶接上的同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。這種方法稱為同聚物接尾法。78第五節(jié)核酸酶核酸酶是一類能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中應用非常廣泛。根據(jù)核酸酶對底物作用的專一性，可將其分為三類：核糖核酸酶（RNase）：只作用于RNA。脫氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于DNA。核酸酶（nuclease）：既作用于DNA，又作用于RNA。79一、核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ

）

exoⅦ是一種的單鏈核酸外切酶，它能夠從5′末端或3′末端降解DNA分子，產生出寡核苷酸短片段，且不需要Mg2+的參與。二、核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ

）

該酶可以從雙鏈DNA的3′-OH末端起逐一切去5′單核酸,其作用底物為含切口或缺口的線性雙鏈DNA和開環(huán)DNA。作用后在雙鏈DNA上形成一條長的單鏈區(qū),這種外切酶不能降解單鏈DNA和帶突出3′末端的雙鏈DNA。81二、核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ

）三、核酸酶S1

1.基本知識核酸酶S1是從米粉狀曲菌（Aspergillusoryzae）提取帶的一種金屬蛋白，分子量32000（32ku），相對耐熱，催化反應通常需要Zn2+和酸性條件，產生帶5′磷酸的寡核苷酸。832.特性降解單鏈DNA或RNA,包括雙鏈分子中的單鏈區(qū)域(如發(fā)夾結構),這種單鏈區(qū)域甚至可以小到1個堿基對的程度。降解單鏈DNA的速度比RNA的速度快10倍。降解發(fā)應的方式為內切和外切。降解發(fā)應的最適pH為4.0～4.5。酶量過大時，伴有雙鏈核酸的降解，該酶的雙鏈降解活性僅為單鏈的1/750