杏鮑菇多糖分離純化及純度鑒定張麗霞2015

杏鮑菇多糖的分離、純化及純度鑒定

主講人：張麗霞教務(wù)處

2016.3.4生物技術(shù)綜合大實驗之三內(nèi)容提要一、多糖純化的目的與意義二、材料與設(shè)備三、實驗方法步驟四、實驗考核一、多糖純化的目的與意義多糖純化實質(zhì)：將粗多糖中的雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、色素、低聚糖、無機(jī)鹽）除去而獲得分子量和極性均一的多糖組分。

多糖純品實質(zhì)：一定分子量范圍內(nèi)的均一組分。

多糖的純度是研究平菇多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的基礎(chǔ)。本實驗首先采用三氯乙酸法對提取的平菇粗多糖進(jìn)行脫蛋白，然后利用過氧化氫對其脫色素；再根據(jù)多糖所帶電荷性質(zhì)及分子量的不同，采用DEAE-纖維素和SepharoseCL-6B凝膠柱層析相結(jié)合的方法，對平菇多糖進(jìn)行分級純化，采用旋光法對得到的級分進(jìn)行純度鑒定，為后續(xù)研究平菇多糖的結(jié)構(gòu)特征和生物活性奠定基礎(chǔ)。以最簡單的技術(shù)，最少的步驟，最高的收率，最低的成本，獲得純度樣品。多糖純化的目的二、材料與設(shè)備

1.材料：已提取的杏鮑菇粗多糖，常規(guī)干燥，備用。

2.設(shè)備：

低速離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、自動數(shù)顯旋光儀、電熱恒溫水浴鍋、蘭格蠕動泵、自動部分收集器、梯度混合器、磁力攪拌器、電子天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、紫外可見分光光度計、干燥器。3.試劑三氯乙酸、30%過氧化氫、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、DEAE-纖維素、SepharoseCL-6B、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、95%乙醇。三、實驗方法步驟

1.杏鮑菇多糖的分離純化流程

杏鮑菇粗多糖脫蛋白脫色素透析濃縮冷凍干燥得水溶多糖精品DEAE-纖維素收集中性多糖組分SephadeG-100柱層析收集最大組分透析濃縮醇沉過夜離心沉淀經(jīng)無水乙醇、乙醚洗滌常規(guī)干燥純度鑒定純多糖。2.脫蛋白

由于粗多糖中含有一定量游離的和結(jié)合的蛋白，為保證多糖的純度，必須將蛋白質(zhì)脫去。常用的脫蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸法和蛋白酶法（鏈蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）等。三氯乙酸法脫蛋白

將粗多糖配成5%的糖液，加入30%三氯乙酸溶液，使三氯乙酸終濃度為15%，在4℃冰箱中放置過夜；離心，棄去沉淀，得無蛋白的多糖溶液，再用1mol/LNaOH溶液中和至PH為7。3.脫色過氧化氫法脫色素將脫蛋白后的多糖溶液，用濃氨水調(diào)至pH為8.0，逐滴滴加20%H2O2至溶液為淺黃色，50℃水浴，保溫2h后過濾。4.透析脫鹽

將脫蛋白、脫色后多糖配成5%溶液，置于透析袋中，先用自來水逆向流水透析72h后，再用蒸餾水透析24h，每4h換水一次。5.干燥

將脫蛋白、脫色、脫鹽后的杏鮑菇多糖溶液，水浴80℃濃縮至10mL,加三倍體積的無水乙醇過夜，離心取沉淀，經(jīng)無水乙醇、乙醚洗滌后，常規(guī)干燥得平菇去蛋白除色素多糖。6.多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定樣品中的多糖含量。（1）測定原理為：游離的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在濃硫酸的作用下，脫水生成糠醛，再與苯酚作用起顯色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，吸收值與糖含量呈線性關(guān)系。且己糖在490nm處（戊糖及糖醛酸在480nm）有最大吸收，故用比色法測定多糖含量。該法簡單，快速，靈敏，對每種糖僅需制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，且顏色持久。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取105℃干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖50mg定容于500mL容量瓶中，加水至刻度，用移液管分別吸取0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL轉(zhuǎn)入試管中，各以蒸餾水補(bǔ)至1.0mL，每個濃度重復(fù)三個平行。然后分別向每支試管中加入6%苯酚試劑0.5mL及濃硫酸2.5mL，搖勻，沸水浴中煮沸10min，冷卻至室溫，放置10min后在λ490nm處測定吸光值A(chǔ)。以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，糖含量C為橫坐標(biāo)，得糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線A=kC。（3）樣品溶液制備：精密稱取杏鮑菇多糖5mg，先加10mL蒸餾水溶解，然后定容至50mL。（4）樣品含量測定：用移液管吸取樣品液1.0mL，加入6%苯酚溶液0.5mL及濃硫酸2.5mL，按上述方法進(jìn)行操作，測其吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品糖含量。7.分級

通過熱水煮提方法提取的多糖，通常是混合物，且分子量不均一，其單糖組成、分子結(jié)構(gòu)和聚合度往往不同，可通過柱層析的方法，對其進(jìn)行分級以達(dá)純化的目的。本實驗中，采用DEAE-纖維素和瓊脂糖凝膠SepharoseCL-6B柱層析相結(jié)合的方法對平菇多糖進(jìn)行分級，分離純化出各級分多糖。（1）DEAE-纖維素的預(yù)處理和裝柱將DEAE-纖維素用蒸餾水充分浸泡溶脹后，傾倒除去水分，再用0.5MNaOH溶液浸泡1h，用蒸餾水反復(fù)洗滌至PH等于7。再用0.5M的HCl溶液浸泡1h，用蒸餾水洗至中性，真空清除氣泡，備用。裝柱時，先將DEAE-纖維素沿著玻璃棒緩慢倒入，以防產(chǎn)生氣泡。柱子裝好后，依次用5倍柱體積的蒸餾水、3倍柱體積的NaCl和5倍柱體積的蒸餾水進(jìn)行平衡，流速設(shè)定為20cmh-1。（2）杏鮑菇多糖的離子交換柱層析的線性梯度洗脫稱取50mg杏鮑菇多糖，溶于5mL蒸餾水中，在已平衡好的DEAE-纖維素離子交換柱(1.5×14cm，Cl-型)上進(jìn)行上樣，先用100mL蒸餾水做流動相進(jìn)行洗脫，再用0~1.0MNaCl溶液300mL進(jìn)行線形梯度洗脫，流速1.0mL/min，每個試管收集3mL洗脫液，苯酚-硫酸法測定洗脫液中相對的糖含量分布。（3）杏鮑菇多糖的凝膠柱層析分析

取5mg杏鮑菇多糖樣品，溶于1mL的0.15MNaCl（生理鹽水）溶液中，離心（3000rpm/min，5min），取上清上樣于SepharoseCL-6B凝膠層析分析柱(1.5×90cm)，洗脫液為0.15MNaCl溶液，流速為0.18mL/min，每管收集2.2mL，苯酚-硫酸法檢測洗脫液中相對糖含量分布。8.純度鑒定

旋光儀鑒定多糖純度：不同的多糖具有不同的比旋度，它們在不同濃度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如多糖水溶液經(jīng)不同濃度的乙醇沉淀所得的沉淀物，具有相同比旋度，則證明該多糖為均一組分。將杏鮑菇多糖樣品溶于水，成為近似半飽和溶液，置于磁力攪拌器上，在攪拌下滴加乙醇，使溶液中乙醇濃度達(dá)到20%，攪拌片刻，使沉淀完全，離心得沉淀。上清液中再繼續(xù)滴加乙醇，使溶液中乙醇濃度達(dá)40%，所產(chǎn)生的沉淀再經(jīng)離心。前后兩次沉淀，分別干燥后在相同條件下測定其水溶液的比旋度。將10mL5%飽和糖液用國產(chǎn)WXG6型自動旋光儀，鈉燈光源，以蒸餾水調(diào)零點，1dm管室溫下測定。四、實驗考核

根據(jù)實驗內(nèi)容撰寫小論文；要求：格式按照“大慶師范學(xué)院學(xué)報自然科學(xué)版模板”格式撰寫，3000字左右。附錄：學(xué)生自學(xué)內(nèi)容層析原理與操作層析技術(shù)

IonExchange(IEX)－離子交換電荷–可用于層析的任何步驟，根據(jù)純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細(xì)純化SizeExclusion(SEC)－分子篩（或凝膠過濾）分子大小–用于中間純化、脫鹽和緩沖液交換、最后精細(xì)純化原理與操作層析的5個操作步驟裝柱并平衡上樣平衡洗脫再生上樣裝填有層析介質(zhì)的層析柱分離分離組分流出原理與操作層析圖原理與操作第一峰,外水體積,Vo,不與柱中填料相互作用直接從柱中流出。這是樣品中的未結(jié)合物質(zhì)VoVeVt蛋白質(zhì)含量(A280),由UV檢測器讀出，y軸基線洗脫峰，有些可以很好的分離，有些分得不是很好，有部分交叉有時這里也顯示梯度濃度等檢測值時間或體積，x軸層析介質(zhì)及其技術(shù)凝膠過濾層析離子交換層析凝膠過濾層析分離純化原理柱長的選擇

分離：80－120cm

脫鹽：30cm以下

洗脫液

離子強(qiáng)度低高離子作用排阻作用（0.05-0.2M)疏水作用pH——中性流速，根據(jù)層析介質(zhì)的說明，一般很低樣品容量：1－3％CV凝膠過濾層析操作參數(shù)選擇cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQQuaternaryamineCMCarboxy-methylSSulfonate離子交換層析離子交換層析類型及其選擇-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-Products:UNOsphere?Q&S,Macro-Prep?HighQ&S,CM,DEAE,AG?resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration--++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++-----++++++++++++++++++++++++++++++------------++++++++++++++++++++++++++++++離子交換層析離子交換層析原理離子強(qiáng)度洗脫時多采用離子濃度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.

在不同鹽濃度（離子強(qiáng)度）及其不同變化率（梯度）條件下保留行為不同，需對該條件進(jìn)行摸索。一般的，隨離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)保留值減小。緩沖液與pH

選擇適當(dāng)?shù)木彌_體系，起始濃度要盡可能低些(0.0