體外受精技術(shù)

（優(yōu)選）體外受精技術(shù)第一頁，共七十頁。體外受精的概念狹義：將動物受精過程中的精卵結(jié)合在體外環(huán)境下完成的現(xiàn)象。包括自然條件下的體外受精(兩棲類和魚類)，和人為培養(yǎng)條件下的體外受精(哺乳動物)。廣義：經(jīng)過特殊處理的精子在體外使卵母細(xì)胞受精的技術(shù)，所以體外受精的胚胎移植后所生嬰兒又稱為“試管嬰兒”。包括卵母細(xì)胞的體外成熟和受精卵的體外培養(yǎng)兩項配套技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：與體內(nèi)受精相比，所需精子數(shù)減少，提高精液利用率。Example:

流式細(xì)胞含儀分離的性控精子只能用于體外受精。第二頁，共七十頁。

國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1878年，Schenk(Germany)將體內(nèi)成熟的家兔和豚鼠卵子與附睪精子放入子宮液中培養(yǎng)，觀察到第二極體的排出和卵裂現(xiàn)象；

1945年，張明覺(華裔)偶然獲得兔體外受精卵，但無重復(fù)性，且無試管動物出生；

1951，張明覺與Austin(澳)同時發(fā)現(xiàn)精子獲能現(xiàn)象；1959年，他首次獲得體外受精兔；

80年代以來，對胚胎需求量的加大，促進(jìn)了家畜體外受精的研究，牛、綿羊、山羊、豬等體處胚相繼獲得了成功，國內(nèi)90年代在家畜上也獲得了成功；

現(xiàn)已將卵母細(xì)胞體外成熟--體外受精--早期胚體外發(fā)育--冷凍保存結(jié)合在一起，建立工廠化胚胎生產(chǎn)。第三頁，共七十頁。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀世界體外受精的首創(chuàng)紀(jì)錄

動物種類首創(chuàng)紀(jì)錄文獻(xiàn)兔Thibault(1954)

敘利亞倉鼠Yanaginmachi,chang(1963)

小鼠Whittingham(1968)

中國倉鼠Pickworth,Chang(1969)

貓Hammer(1970)

土撥鼠Yanagimachi(1972)

大鼠Miyamoto,Chang(1973)

狗Mahi,Yanagimachi(1976)

牛Brackett(1978)

豬Iritani,Niwa(1977)

綿羊Bondioli,Wright(1980)

山羊花田章(1985)

第四頁，共七十頁。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀我國體外受精的首創(chuàng)紀(jì)錄

動物種類首創(chuàng)紀(jì)錄文獻(xiàn)小鼠陳秀蘭(1986)

兔范必勤(1987)

綿羊旭日干(1989)

牛旭日干(1989)

山羊錢菊汾(1990)

豬范必勤(1990)

水牛蔣和生(1993)

第五頁，共七十頁。體外受精技術(shù)流程

卵母細(xì)胞的體外成熟精子的體外獲能卵母細(xì)胞的體外受精受精卵的體外發(fā)育配子的冷凍保存第六頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)1.離體采集：30min內(nèi)取卵巢，置生理鹽水或PBS（25℃-35℃），3h內(nèi)回收。⑴卵泡抽吸法：針頭穿刺，一次進(jìn)針可抽吸卵巢皮質(zhì)的多個卵泡優(yōu)點(diǎn)：回收速度快，不易造成卵母細(xì)胞的污染；缺點(diǎn)：容易損傷卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞，影響其隨后的成熟。第七頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集⑵卵巢解剖法：卵巢切為兩半，去掉中間的髓質(zhì)部分，刀片劃破卵泡，在培養(yǎng)液中反復(fù)沖洗優(yōu)點(diǎn)：能保持卵母細(xì)胞周圍卵泡細(xì)胞的完整性，回收率也相對較高；缺點(diǎn)：回收的速度相對較慢，容易造成污染。

第八頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集2.活體采集(OvumPick-Up,OPU)

⑴腔鏡法：腹壁切開一小口，插入腹腔鏡，操作桿和穿刺針，配合將卵母細(xì)胞抽吸出來優(yōu)點(diǎn)：比較直觀，容易掌握；缺點(diǎn)：工作量大，對母牛有損傷，不能頻繁手術(shù)。第九頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的采集⑵B型超聲波法：超聲波探頭和采卵器插入到陰道子宮頸的一側(cè)穹隆處。術(shù)者通過直腸將卵巢貼在探頭上，根據(jù)B超屏幕上所顯示的卵泡位置進(jìn)行穿刺而將卵母細(xì)胞抽出優(yōu)點(diǎn)：不用手術(shù)，操作速度快，對母牛損傷小，可頻繁采卵，且亦可對妊娠母牛采卵；缺點(diǎn)：操作技術(shù)較難掌握，并需要昂貴的超聲設(shè)備。第十頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的篩選

只有周圍包被著完整卵丘（A級）或部分卵丘脫落（B級）(1層以上卵丘細(xì)胞）、胞漿均質(zhì)并充滿于透明帶內(nèi)的卵母細(xì)胞才能進(jìn)行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。

A級：卵丘細(xì)胞致密，至少有5層以上；

B級：卵丘細(xì)胞為2-4層；

C級：卵母細(xì)胞大部分被包裹；

D級：卵母細(xì)胞少量被包裹；

E級：裸卵。

A、B級可用于培養(yǎng)，C、D級成熟率低。第十一頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟卵母細(xì)胞成熟目的：提供可利用的卵母細(xì)胞用于體外受精、克隆等；研究其體內(nèi)成熟的模型。卵母細(xì)胞體外成熟的特征生發(fā)泡破裂；染色體凝集；紡綞體形成；極體排出；透明帶軟化；卵丘細(xì)胞擴(kuò)展。第十二頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液以TCM-199較好，可使牛、羊、豬的卵母細(xì)胞體外成熟率高達(dá)80%以上。添加成分：促性腺激素：FSH、LH

FCS、BSA：有認(rèn)為FCS比BSA好，而發(fā)情牛血清或發(fā)情羊血清比FCS好?？股氐谑?，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)OocyteCollectionMedium(OCM)

最常用的是碳酸氫鈉或Hepe’s緩沖的TCM-199;

2.OocyteMaturationMedium

（1)Bovinesteerserum

(2)Folltropin

(3)Estradiol

(4)NaPyruvate

(5)Glutamine第十四頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)2.成熟培養(yǎng)時間

一般22h-24h，但豬40h-44h，馬30h-36h，兔僅12h-15h3.成熟培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境

人和嚙齒類動物：37℃

牛、豬、羊和馬等：38℃~39℃。

pH：7.7好于7.1，7.4，8.0

滲透壓：330Osm/kg好于300，320

氣相：5%CO2

5%CO2＋5%O2＋90%N2

第十五頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)4.IVM系統(tǒng)⑴開放培養(yǎng)系統(tǒng)

1ml-2ml成熟培養(yǎng)液直接置于平皿內(nèi)或培養(yǎng)板內(nèi)，放入50枚-200枚卵母細(xì)胞培養(yǎng)，上面不蓋石蠟油。優(yōu)點(diǎn)：簡單，對培養(yǎng)液中的脂溶性物質(zhì)沒有若影響，能同時培養(yǎng)大量細(xì)胞缺點(diǎn)：滲透壓變化較大，容易污染第十六頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)⑵微滴培養(yǎng)系統(tǒng)將成熟培養(yǎng)液在做成50-500l的微滴，覆石蠟油，將卵母細(xì)胞置于其中培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：滲透壓比較穩(wěn)定，不易污染；缺點(diǎn)：對脂溶性物質(zhì)有稀釋作用，成本高，培養(yǎng)結(jié)果易受石蠟油質(zhì)量的影響。

⑶密閉培養(yǎng)系統(tǒng)置1～2ml培養(yǎng)液的試管中，膠塞，在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；若采用培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入密閉的塑料袋內(nèi)。優(yōu)點(diǎn)：不要CO2培養(yǎng)箱，方便運(yùn)輸缺點(diǎn)：pH不如前者穩(wěn)定。第十七頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志第一極體的排出、卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展可作為成熟的標(biāo)志，而生發(fā)泡破裂(GVBD)是卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂的主要標(biāo)準(zhǔn)，因此常用地衣紅染色才可判斷。牛卵母細(xì)胞體外成熟標(biāo)準(zhǔn)：1級成熟卵：卵丘細(xì)胞完全擴(kuò)展，卵丘細(xì)胞至少向外擴(kuò)展3倍于裸卵直徑；2級成熟卵：卵丘細(xì)胞中等擴(kuò)展，卵丘細(xì)胞至少向外擴(kuò)展2倍于裸卵直徑；3級成熟卵：卵丘細(xì)胞輕度假擴(kuò)展，卵丘細(xì)胞仍緊緊粘附于透明帶上。

1級和2級卵通常均已排出第一極體。第十八頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞體外成熟的質(zhì)量評定⑴形態(tài)觀察：細(xì)胞質(zhì)均勻、沒有空泡

⑵固定染色法：0.1%透明質(zhì)酸酶醋酸酒精或醋酸甲醇（1:3）固定24h～48h1%間苯二酚蘭（Lacmoid）或1%地衣紅（Orcein）的40%醋酸溶液染色⑶受精和胚胎發(fā)育潛能的評定

第十九頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟影響卵母細(xì)胞成熟的因素卵母細(xì)胞的來源：不同種類的動物、不同生理階段的動物(小牛低于成年牛)、卵母細(xì)胞的質(zhì)量等；（1）動物種類與年齡：牛、羊效果較好，而馬、豬較差。小牛卵母細(xì)胞的平均直徑（118.04±1.15μm）比成年母牛的（122.84±0.74μm）小。體外成熟的小牛卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育潛力也低于成年卵母細(xì)胞第二十頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟（2）卵母細(xì)胞的形態(tài)

A、76.2%；B、67%；

C、22%；D、11.4%（3）卵巢貯存時間與溫度

<30oC對成熟和胚胎發(fā)育不利(First&Parrish）綿羊的卵巢貯存在22oC數(shù)小時對成熟無明顯影響，但體溫條件下則會使卵母細(xì)胞的質(zhì)量下降(Moodie&Graham)第二十一頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟2.激素

目前大多數(shù)都離不開FSH或LH或兩者的混合物，但仍有爭議

GH能顯著提高精子的受精率，促進(jìn)卵裂及胚泡的形成甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）胰島素激活素第二十二頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外成熟3.生長因子

目前已經(jīng)證實(shí)與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)的生長因子有：上皮細(xì)胞生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子α和β（TGF-α，β）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、胰島素類生長因子Ⅰ和（IGFⅡ-Ⅰ，Ⅱ）4.血清胎牛血清（FBS）、發(fā)情牛血清（OCS）、發(fā)情前期母牛血清（POS）、超排母牛血清（SCS）、公牛血清（SS）。第二十三頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外保存1.37℃保存

應(yīng)考慮保存時間與卵老化2.低溫保存

0℃-10℃

兔:<10℃24h，受精率78％，78h仍可保持受精能力；>10℃，受精能力顯著降低。

第二十四頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)卵母細(xì)胞的體外保存3.冷凍保存

借鑒胚胎冷凍方法，現(xiàn)已建立了幾種卵母細(xì)胞冷凍程序：

A慢速冷凍、慢速解凍法

B慢速冷凍、快速解凍法

C快速冷凍、快速解凍法

D一步冷凍法

E玻璃化法

F超快速冷凍法第二十五頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)影響卵母細(xì)胞成熟的因素培養(yǎng)條件：溫度：37C較好，但各種動物最適溫度不同，如兔子低于體溫3C較好，牛35-39C都可，但38-39C最合適；培養(yǎng)基：水、血清（無血清、有血清)、無血清時添加BSA等；有血清時如胎牛血清、發(fā)情牛血清、公牛血清、超排牛血清等；第二十六頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離與洗滌洗滌的目的：去掉精漿中抑制精子獲能的因子和死精子，或洗去防凍劑及卵黃等成分，以獲得活力好的精子。精子分離及洗滌方法懸浮法(Swim-up)：利用精子上游的特性將高活力的精子與死精子及精漿成分分開。將精液置于獲能液或受精液中，培養(yǎng)箱中孵育齡10-30分鐘，吸取上層液體，再離心洗滌1-2次即可。精子的分離、洗滌與體外獲能第二十七頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能

離心洗滌法：對于活力好的精子直接將其放入獲能液或受精液中，離心洗滌若干次便可。

BSA/Percoll密度梯度離心法：利用形態(tài)正常精子密度高于異常精子的原理。如將BSA制成不連續(xù)的密度梯度或?qū)ercoll制成30-40%或45-90%梯度，經(jīng)平衡離心從而得到高受精力的精子。

玻璃棉過濾法：采作小玻璃珠過濾除去死精子。因其成本高，較少采用。第二十八頁，共七十頁。（二）精子獲能處理方法

1.血清白蛋白法

將精子與血清白蛋白溶液進(jìn)行長時間孵育。該法由于需要的時間較長，且誘發(fā)精子獲能的作用不強(qiáng)，故僅在IVF技術(shù)研究的初期進(jìn)行過嘗試，具有一定作用，目前僅作為精子獲能的一種輔助手段。2.高滲鹽法

精子表面含有許多被膜蛋白，即所謂的“去能因子”。當(dāng)用高離子強(qiáng)度溶液處理精子時，這些被膜蛋白將從精子的表面脫落，從而導(dǎo)致精子獲能。由于高離子強(qiáng)度溶液對精子具有滲透打擊作用，會影響精子的活力，故目前已廢除不用。

第二十九頁，共七十頁。（二）精子獲能處理方法3.卵泡液孵育法卵泡液含有來自血清的大分子物質(zhì)，并含有誘發(fā)精子獲能和頂體反應(yīng)的因子，故在精液中添加一定濃度的卵泡液可誘發(fā)精子獲能。

10%卵泡液，牛受精分裂率（40.3%Vs87.5%）和囊胚發(fā)育率（8.3%Vs40.4%）均顯著下降，但加入50%的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞條件液則能。卵泡液可以用于精子的獲能處理，但不能用于IVF系統(tǒng)。第三十頁，共七十頁。（二）精子獲能處理方法4.鈣離子載體法鈣離子載體A23187能直接誘發(fā)Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而導(dǎo)致獲能。

0.5mol/L~1.0mol/LA23187溶液處理精子5min，然后加入等量含1%BSA的BO溶液終止A23187的作用，即可將獲能精子加到含卵母細(xì)胞的受精滴中進(jìn)行IVF。注意控制A23187的工作濃度和作用時間，否則會導(dǎo)致精子的活力下降和死亡。

第三十一頁，共七十頁。（二）精子獲能處理方法

5.肝素法肝素是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，與精子結(jié)合后，能引起Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部而導(dǎo)致精子獲能。

最初，制備好的精子常用含有肝素（100mg/L）的獲能液預(yù)處理15min，然后加到受精滴中進(jìn)行IVF?，F(xiàn)直接將肝素（50mg/L）添加到受精液中進(jìn)行受精。

第三十二頁，共七十頁。（三）精子獲能的檢測

1.精子形態(tài)及運(yùn)動方式的觀察頭部膨大，活力增強(qiáng)，超活化

2.頂體反應(yīng)的檢測

（1）雙重染色法

優(yōu)點(diǎn)：無需昂貴設(shè)備，簡單易行；缺點(diǎn)：易發(fā)生誤判

（2）透射電鏡觀察

成本高，制片繁瑣，可操作性不強(qiáng)。

第三十三頁，共七十頁。三、IVF培養(yǎng)系統(tǒng)（一）微滴系統(tǒng)

20-40l微滴受精液，覆石蠟油，每滴放入IVM的卵母細(xì)胞10-20枚及獲能處理的精子（）×106個/ml，孵育6-24h

優(yōu)點(diǎn)：受精液及精液的用量均較少，IVF的效果亦較好；缺點(diǎn)：結(jié)果易受石蠟油質(zhì)量影響，操作繁瑣，成本較高。第三十四頁，共七十頁。

（二）四孔培養(yǎng)板系統(tǒng)

每孔加入500ml受精液和100-150枚IVM的卵母細(xì)胞，然后加入獲能處理的精子（）×106個/ml，孵育6h-24h。優(yōu)點(diǎn)：操作相對比較簡單，受精結(jié)果不受石蠟油質(zhì)量的影響；

缺點(diǎn)：精子的利用率相對較低，IVF效果不如微滴法穩(wěn)定。三、IVF培養(yǎng)系統(tǒng)第三十五頁，共七十頁。

通常以精子穿透率、原核形成率、受精分裂率和囊胚發(fā)育率來衡量。其中，囊胚發(fā)育率最為可靠。（一）固定染色法

受精8~10h精子穿透率和多精子受精率；受精18~20h雙原核形成率（二）體外培養(yǎng)

受精48h2-8細(xì)胞比例，7d囊胚發(fā)育率，9d囊胚的孵化率三、IVF質(zhì)量評定第三十六頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能

SpermSwim-upItisslowerthanthePercollprocedure,sometimesitdoesnotgivebetterresults.

1.Thaw6to8strawsoffrozensemeninthecyto-thawfor60seconds.

Ifpossible,usesemenfromdifferentbulls.2.Combinecontentsofstrawsin5mlSp-TALP.

Placesampleintotheincubator(38.5°C)for5minutes.

3.Centrifugesemen(200xg;5min)anddiscardallbutthebottom1mlofsupernatant.4.Prepare4to5testtubescontaining1mlSp-TALP.

Addapproximately250mlofspermsuspensionveryslowlytothebottomofeachtubeusinga20gaugeneedleand1mlsyringe.

Placetubesinincubator(38.5°C)for1h.5Attheendofspermswim-up,aspiratethetop800mlfromeachtubeandcombinesamples.

Centrifuge(1000rpm)thecombinedsamplefor5minutes.

Discardallbutthebottom500mlofsupernate.第三十七頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能

Glass-woolFiltrationThisfiltrationprocedureusuallyrequires10-15minutesandgenerallyyieldsnearly100%viablesperm.

1.Prepareinadvance0.2mlglasswoolcolumnsin1mlsyringesthatarerinsed10XwithMilli-Qwaterandautoclaved.2.

Immediatelybeforestartingpurification,rinsecolumnseveraltimeswithHepes-TALPandfinallywithSperm-TALPtoequilibratecolumn.3.Frozen-thawedsemen(3-5straws)iswashedtwicewith10-15mlSperm-TALPbycentrifugationat200xg(10min)andthenresuspendedin0.6-0.8mlIVF-TALP.4.Spermsuspensionisthenlayeredoverthewetcolumnandallowedtofilterbygravity.5.Thenumberandviabilityoffilteredspermisdetermined.第三十八頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能第三十九頁，共七十頁。

ThawstrawLayeringofspermontoPercoll.

Aftercuttingthetipofthestraw(Leftpanel),thecontentsofthestrawareexpelledontothetopofthePercollgradient(rightpanel).

Here,removalofthesemenisfacilitatedbyusingahomemadeplunger.Percollgradient:uptobottom45-90%第四十頁，共七十頁。RemovalofspermfromthebottomofthePercollgradient.WashingsperminSp-TALP.

Theleftpanelshowsthewashedandcentrifugedsperm.

Therightpanelshowsthepelletofspermremaininginthetubeafteraspirationofthesupernatant.Percollmethod第四十一頁，共七十頁。Hemacytometerusedforcountingsperm.

第四十二頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能2.精子的體外獲能(1)卵泡液孵育法：卵泡液含有來自血清的大分子物質(zhì)，并含有誘發(fā)精子獲能和頂體反應(yīng)的因子，故在精液中添加一定濃度的卵泡液可使精子獲能。但不能用于體外受精(卵裂率和囊胚率下降)。(2)鈣離子載體法：鈣離子載體A23187能誘發(fā)Ca進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)精子的超活化和頂體反應(yīng)，從而導(dǎo)致獲能。但其作用時間和濃度對于獲能非常關(guān)鍵。第四十三頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能(3)肝素法：它與精子孵育后，能引起Ca進(jìn)入精子內(nèi)，導(dǎo)致獲能。這是被廣泛采用的獲能法。原來將肝素(100mg/ml)獲能液預(yù)處理精液，再受精，現(xiàn)在直接將肝素(50mg/ml)添加到受精液中受精。實(shí)際操作時，常將多種因素共同使用，如咖啡因-肝素-BSA系統(tǒng)。第四十四頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的分離、洗滌與體外獲能3.精子獲能的檢測(1)精子形態(tài)及運(yùn)動方式改變(常用)：獲能后的精子頭部膨大，運(yùn)動增強(qiáng)。(2)頂體反應(yīng)的檢測：

雙重染色法：取樣—固定—染色(快綠FCF和曙紅)—涂片—干燥—觀察—若頭部有厚的藍(lán)綠區(qū)為無獲能，若出現(xiàn)粉經(jīng)為獲能。電鏡法：第四十五頁，共七十頁。2.體外授精

授精通常在覆蓋下的微滴中進(jìn)行，微滴以50-100ul，一般每滴中加5-10個卵母細(xì)胞，精子最終濃度為1X106個/ML。

培養(yǎng)條件：5%CO2、39C培養(yǎng)，BO液中6-8h，TALP液中18-24h。

體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)精子的體外獲能與體外受精(牛)第四十六頁，共七十頁。1.

Removeplatescontainingmaturedoocytesfromtheincubatorandplaceontheslidewarmer.2.Add25mlspermpreparationand25mlPHEmixintoeachwell.

Whenpipettingthesperm,placethepipetteinthemiddleofthespermsuspensionratherthanonthebottomtoavoidgrabbingdebristhatcansettletothebottomofthetube.

3.

Return4-wellplatetoincubatorfor8-10h.Manypeopledofertilizationfor18-20h.WhenwewereestablishingIVFinourlab,8-10hgavebetterresultsthanlongerincubationtimes.Recently,however,wehavegottengoodresultswith18-20hfertilizationtimes.Inaddition,longerfertilizationtimesmakeiteasiertoremovecumuluscellsafterfertilization.

Todeterminetheincidenceofparthenogenesis,onewellshouldbepreparedwithoutsperm,butwithPHE.

After8–10h,placetheseoocytesintoaseparateculturemediumdropandculturefor2daysbeforelookingatrateofparthenogenesis.體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)體外受精第四十七頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)早期胚胎的體外發(fā)育阻滯期：

各種動物的早期胚胎體外發(fā)育時都存在阻斷期，因此可通過改善培養(yǎng)條件和在培養(yǎng)液中添加生長因子(TGF-或bFGF等)或細(xì)胞外基質(zhì)因子克服阻斷。但目前的發(fā)育率仍然比較低，約為40%，是限制體外受精應(yīng)用的一個突出問題。

各種動物阻斷期：

牛：

豬：

羊：

第四十八頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)早期胚胎的體外發(fā)育

培養(yǎng)液添加的成分：(1)丙酮酸鈉和乳酸鈉：作為能量底物。(2)生物體液和蛋白質(zhì)：FCS、NCS、發(fā)情母畜血清、BSA等。(3)激素：PMSG、FSH、胰島素、雌激素等，提高囊胚率。(4)生長因子及多肽：IGF，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟、受精和早期胚胎發(fā)育；EGF促進(jìn)胚胎的分化和囊胚的形成；TGF促使牛的胚胎通過早期阻斷；LIF(白血病抑制因子)提高孵化囊胚發(fā)育率，并抑制胚胎干細(xì)胞的體外分化。第四十九頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)早期胚胎的體外發(fā)育

2.胚胎的體外培養(yǎng)系統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)：微滴法和培養(yǎng)板法。輸卵管離體培養(yǎng)法：克服阻斷，但因繁瑣不常用。與體細(xì)胞共培養(yǎng)：如輸卵管上皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等。第五十頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)胚胎的冷凍保存常規(guī)的慢速冷凍法

冷凍液:

1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP

1.5M乙二醇+0.25蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP

冷凍方法：

①在室溫下，先將牛胚胎放入防凍液中平衡一段時間；

②裝管；

③以每分鐘1℃的速度降溫至–7℃；

④植冰；

⑤以每分鐘0.5℃的速度降溫至–35℃；平衡10分鐘后，投入液氮中保存。第五十一頁，共七十頁。體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)要點(diǎn)胚胎冷凍保存2.玻璃化冷凍

冷凍液：

EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS

冷凍步驟：

首先將胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min；

用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min；

裝管，封口；

將細(xì)管投入液氮冷凍保存。第五十二頁，共七十頁。影響體外受精的因素卵母細(xì)胞的成熟精子的體外獲能第五十三頁，共七十頁。（一）卵母細(xì)胞的成熟度第五十四頁，共七十頁。（二）精子體外獲能第五十五頁，共七十頁。

（三）公畜的影響第五十六頁，共七十頁。Someinstrumentsusedtopickupembryosandoocytes.

Fromlefttorightarea1ccsyringewithanextensionofrubbertubingconnectedtoaUnopette,

awiretrol(fromDrummondScientific),thesamedeviceas#1withouttherubbertubingextensionanda5mlDrummondMicrodispenser.第五十七頁，共七十頁。Useofthewiretrolusingtwohands(leftpanel)oronehand(rightpanel).第五十八頁，共七十頁。TwomethodsforusingtheUnopettetip.

ThedeviceontheleftpanelhasbeenmodifiedtoincludeapieceofrubbertubingbetweentheUnopetteandsyringetogivethetechniciangreatercontroloverthevolumeaspirated.第五十九頁，共七十頁。

(A)

OnaPetri-dish(i.e.Intergridplate)place3microdropsof70lholdingmediumsidebyside.

(B)Placeoneblastocystintothemiddledrop(C(C-D)Insertthecottonplugsideofa0.25mlFrenchstrawintothewideendofthepipettip.D((E)Aspirateoneemptydrop.A(E)Aspirateairtocreatea~0.5cmcolumnA(F)Aspiratethemicrodropcontainingembryo(makesurethattheembryoisaspiratedbyobservingunderthemicroscope;A(F)Aspirateairtocreatea~0.5cmcolumnh(G)Aspiratetheremainingemptydropuntilthecottonplugiswet.R(H)Removetransferstrawfromsyringeandplaceonslidewarmeruntiluse.第六十頁，共七十頁。Whoshouldbetreatedwithinvitrofertilization?

Invitrofertilizationcanbeusedasaneffectivetreatmentforinfertilityofallcausesexceptforwomenwithinfertilitycausedbyananatomicproblemwiththeuterus,suchassevereintrauterineadhesions.

Itisgenerallyusedincoupleswhohavefailedtoconceiveafteratleastoneyearoftryingwhoalsohaveoneormoreofthefollowing:1.Blockedfallopiantubesorpelvicadhesionswithdistortedpelvicanatomy.WomenthathavehadtuballigationandareconsideringtubalreversalsurgeryaswellasmenthatareconsideringvasectomyreversalsurgerymightalsoconsiderIVF.

2.Severemalefactorinfertility(lowspermcountorlowmotility)

3.Failed2-6cyclesofovarianstimulationwithintrauterineinsemination

第六十一頁，共七十頁。Whoshouldbetreatedwithinvitrofertilization?4.Advancedfemaleage-over38

5.Reducedovarianreserve,whichmeanslowerquantity(andsometimesquantity)ofeggs.Aday3FSHandestradioltestandantralfolliclecountsareoftendoneasscreeningtestsforeggquantity(andquality).ReducedeggquantityandqualityisusuallytreatedwitheitherIVF,orwithIVFusingeggdonationfromanotherwoman.

6.Severeendometriosis第六十二頁，共七十頁。Thegraphshowslivebirthratesforall23reportingIllinoisIVFcentersfor2002

Theseclinicsreportedlivebirthratesrangingfrom13.5%to47.4%pereggretrievalforwomenunder35

FiveIllinoisIVFprogramsfailedtoreporttheiroutcomedatatothegovernment(USlawrequiresreportingannually)第六十三頁，共七十頁。Howisinvitrofertilizationperformed?1.BasicscreeningtestsareperformedonbothpartnersatallIVFclinics.Ingeneral,sometestingof"ovarianreserve"shouldbedoneonthefemalepriortostartingtheinjections.Weuseday3FSHtestingaswellasantralfolliclecountsforthispurpose.Theresultsofthesetestsgiveussomeabilitytopredictwhetherherovarieswillrespondwelltothedrugs(makesufficientfolliclesandeggs).ThenumberofeggsretrievedcorrelatesstronglywithIVFsuccessrates.

2.Consentsaresignedbyallparties.3.Thewomanisstimulatedwithinjectedmedicationstodevelopmultipleeggdevelopment.Theseinjectionscontinueforabout8-10days.第六十四頁，共七十頁。Howisinvitrofertilizationperformed?4.Bloodandultrasoundtestingisdoneevery1-3daystomonitorthedevelopmentofthefollicles(egg-containingstructures)intheovaries.Weneedtogetaminimumnumberof3folliclestodeveloptomaturityinordertobeabletoproceedwiththeeggretrieval.About90%ofwomenunder40withanormalFSHandnormalantralfolliclecountswilldevelopatleastthisminimumnumberoffollicles.Ifthismanymaturefolliclescannotbeobtainedfromthestimulationprocess-wewill"cancel"thecycle(notproceedtoeggretrieval).第六十五頁，共七十頁。Howisinvitrofertilizationperformed?5.Whenthewoman'sfolliclesaremature,atransvaginalultrasound-guidedeggretrieval(eggaspiration)procedureisperformedtoremovetheeggsfromthefollicles.Theaverage

durationofthisprocedureis5-6minutes(atourfacility).6.Theembryosareculturedinthelaboratoryfor2-6days.7.Theembryotransferprocedureisdonewhichplacestheembryosinthewoman'suteruswheretheywillhopefullyimplantanddeveloptoresultinalivebirth.ThisislikeaPapsmearfor