實(shí)驗(yàn)一顯微攝影技術(shù)

二、實(shí)驗(yàn)原理

顯微鏡的放大效能是由其照明系統(tǒng)所使用光的波長和透鏡系統(tǒng)的數(shù)值孔徑?jīng)Q定，縮短使用的光波長或增加數(shù)值孔徑可以提高分辨率?？梢姽獾墓獠ㄕ穹^窄，因此使用較短波長的紫外光作為光源系統(tǒng)，可以提高分辨率。而對(duì)于一臺(tái)普通光學(xué)顯微鏡，一般來說，提高其分辨率主要通過提高數(shù)值孔徑（選用鏡口角大的透鏡，提高介質(zhì)折射率）。第一頁，共二十八頁?；A(chǔ)知識(shí)顯微鏡概述：

顯微鏡是觀察細(xì)胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。1.光學(xué)顯微鏡普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(tái)(載物臺(tái))、調(diào)節(jié)器和、物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)等。

尼康E-600顯微鏡

第二頁，共二十八頁。光學(xué)顯微鏡基本結(jié)構(gòu)：1.照明燈(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.載物臺(tái)和切片夾(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.推進(jìn)器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.物鏡(Objectives)6.粗細(xì)螺旋(Courseandfinefocusknob)7.目鏡(Oculars)8.照相機(jī)等接口(Connectiontocamera,etc.)第三頁，共二十八頁。2.熒光顯微鏡

尼康E800熒光DIC顯微鏡

熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）

第四頁，共二十八頁。熒光顯微鏡(Fluorescencemicroscope)：

以紫外線為光源,用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。第五頁，共二十八頁。3.激光共聚焦掃描顯微鏡

LCSM照片藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管

第六頁，共二十八頁。

用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測量。

第七頁，共二十八頁。4.暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）的聚光鏡中央有當(dāng)光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。5.相差顯微鏡

一種介殼蟲的染色體

第八頁，共二十八頁。

相差顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞?；罴?xì)胞和未染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過時(shí)，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。第九頁，共二十八頁。6.偏光顯微鏡

將普通光改變?yōu)槠窆膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射（各向同行）或雙折射性（各向異性）。偏光顯微是鑒定物質(zhì)細(xì)微結(jié)構(gòu)光學(xué)性質(zhì)的一種顯微鏡。凡具有雙折射性的物質(zhì)，在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚，當(dāng)然這些物質(zhì)也可用染色法來進(jìn)行觀察，但有些則不可能，而必須利用偏光顯微鏡。雙折射性是晶體的基本特征。因此，偏光顯微鏡被廣泛地應(yīng)用在礦物、化學(xué)等領(lǐng)域。在生物學(xué)中，很多結(jié)構(gòu)也具有雙折射性，這就需要利用偏光顯微鏡加以區(qū)分。在植物學(xué)方面，如鑒別纖維、染色體、紡錘絲、淀粉粒、細(xì)胞壁以及細(xì)胞質(zhì)與組織中是否含有晶體等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起組織內(nèi)化學(xué)性質(zhì)的改變，可以偏光顯微術(shù)進(jìn)行鑒別。在人體及動(dòng)物學(xué)方面，常利用偏光顯微術(shù)來鑒別骨骷、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)等。

第十頁，共二十八頁。7.微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）第十一頁，共二十八頁。8.倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。第十二頁，共二十八頁。9.透射電子顯微鏡

JEM-1011透射電子顯微鏡

萊卡超薄切片機(jī)

第十三頁，共二十八頁。用透過樣品的電子束使其成像的電子顯微鏡。在光學(xué)顯微鏡下無法看清亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍

第十四頁，共二十八頁。要知道的幾個(gè)重要的分辨率

人眼：0.2mm光學(xué)顯微鏡：0.2um電子顯微鏡：0.2nm第十五頁，共二十八頁。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色）

冰凍蝕刻電鏡照片

第十六頁，共二十八頁。10.掃描電子顯微鏡

JEOL掃描電子顯微鏡人類血細(xì)胞SEM照片

第十七頁，共二十八頁。厚標(biāo)本和薄標(biāo)本4-5um2um基礎(chǔ)知識(shí)第十八頁，共二十八頁。顯微攝影裝置的安裝與調(diào)試↓顯微鏡的光路調(diào)整↓裝入膠片↓取景聚焦↓暴光:1/15sec(應(yīng)先測光:綠燈亮可以正確暴光)↓黑白膠片的沖洗:顯影3min→停顯10sec→定影15min→水洗:流水沖洗30min→晾干↓印相放大:取景聚焦→暴光→顯影→停顯10sec→定影15min→水洗:流水沖洗30min↓上光剪切三、傳統(tǒng)膠片顯微攝影過程第十九頁，共二十八頁。顯微攝影技術(shù)利用顯微攝影裝置拍攝顯微鏡(或解剖鏡)視野中物象的技術(shù)稱為顯微攝影。顯微攝影技術(shù)主要包括兩個(gè)方面：拍攝：需要一套完備的顯微攝影裝置洗印放大：需要一個(gè)較好的暗室和成套的洗印放大設(shè)備。第二十頁，共二十八頁。三、實(shí)驗(yàn)用品雙目顯微鏡，生物標(biāo)本，擦鏡紙等四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、雙目顯微鏡的操作規(guī)范：取送→放置→對(duì)光→低倍物鏡使用→高倍物鏡使用→油鏡使用→保養(yǎng)維護(hù)第二十一頁，共二十八頁。顯微鏡使用及繪圖（1）取、放顯微鏡的正確做法

一手握鏡臂，一手托鏡座，托在胸前。小心輕放，避免震動(dòng)。放在距離桌邊5-10cm左右為好。（2）對(duì)光先將低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)通光孔，調(diào)整反光鏡（外光源顯微鏡）或電源電壓（內(nèi)光源顯微鏡），使視野中的光線明亮而不刺眼。也可以改變孔徑光圈或改變聚光器的位置達(dá)到改變照明的目的，但反光鏡一定要調(diào)到最佳的角度。（3）放置標(biāo)本

將標(biāo)本放在載物臺(tái)上，固定好。將玻片中有標(biāo)本的地方移到通光孔的中央。如果位置不是在中央，因?yàn)槲镧R的觀察范圍有限，有可能觀察不到所要看到的內(nèi)容。

第二十二頁，共二十八頁。顯微鏡的正確使用方法（4）調(diào)整焦距眼睛不要看目鏡，要從側(cè)面注視低倍鏡與標(biāo)本。慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗準(zhǔn)焦距螺旋，使物鏡與玻片標(biāo)本接近。待目測低倍鏡與標(biāo)本蓋玻片之間的距離比低倍物鏡的工作距離（7.63mm）小一些時(shí)，即可注視目鏡，并向相反的方向調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋，使物鏡與標(biāo)本的距離增大，慢慢會(huì)看到視野中物像的出現(xiàn)。注意這一操作如果違章有可能會(huì)損壞儀器或標(biāo)本?。?）使用低倍鏡觀察移動(dòng)標(biāo)本，找到要觀察的位置。用細(xì)準(zhǔn)焦螺旋調(diào)清物像。（6）使用高倍鏡觀察將需觀察的位置移到顯微鏡視野的中央，將高倍鏡換入即可。使用高倍鏡前一定要用低倍鏡進(jìn)行觀察。不可直接用高倍鏡。第二十三頁，共二十八頁。顯微鏡的正確使用方法（7）使用油鏡觀察在觀察細(xì)小結(jié)構(gòu)時(shí)需要使用100倍的物鏡。100倍的物鏡需要在油的介質(zhì)中工作，故稱油鏡或油浸物鏡。油鏡需在物鏡與標(biāo)本之間充上一種折光率與玻璃一樣高的介質(zhì)，通常使用香柏油，才能使物像清晰。方法是先低倍，后高倍，再用油鏡。（8）顯微鏡用后應(yīng)先轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，將高倍物鏡或油鏡旋出通光孔的上方，再取下玻片標(biāo)本。一定要及時(shí)清除油鏡上的油。將反光鏡放在豎直的位置，以減少落上灰塵。保持清潔，罩好防塵罩。

第二十四頁，共二十八頁。生物繪圖方法（1）看清楚把正常的、一般的結(jié)構(gòu)與偶然的、人為的一些結(jié)構(gòu)區(qū)分開，然后選擇那些有代表性的典型的部位進(jìn)行繪圖。（2）定位置先確定要畫的圖在實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上的位置和大小，力求布局合理、美觀，不能任意的無計(jì)劃的畫圖，否則位置不適當(dāng)或偏在一角、或過大過小，影響注字和說明。考慮在左側(cè)一邊留一定邊緣，以備裝訂之用。（3）定大小一般盡可能的把圖畫大些。如果是細(xì)胞圖，為了清楚表明細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所畫細(xì)胞不宜過多，1～2個(gè)即可，但每個(gè)細(xì)胞的各個(gè)部分按同比例適當(dāng)放大，如畫輪廓圖或圖解圖，也不一定把全部切面（如根莖的橫切面圖）畫出，根據(jù)需要畫出1/2～1/8即可。第二十五頁，共二十八頁。（4）求真實(shí)須注意其科學(xué)性，精確性，不能任意臆造，加以美化，繪圖力求準(zhǔn)確。先用HB鉛筆起草，后用硬鉛筆畫出。（5）用點(diǎn)線圖只用點(diǎn)和線表示。生物繪圖法中除了輪廓線以外，其余表現(xiàn)物體立體感、大小、厚度、形態(tài)的唯一形式是打點(diǎn)，即使用HB鉛筆打點(diǎn)來表現(xiàn)光線明暗。切不可涂黑，細(xì)胞壁用平行的雙線表示，線條要細(xì)而圓滑，粗細(xì)均勻，原生質(zhì)體內(nèi)的結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等）要用疏密的點(diǎn)表示，點(diǎn)要細(xì)圓，不拖尾巴。細(xì)胞與其他細(xì)胞相連接處要畫出一些來，以表示所畫的細(xì)胞不是孤立的。（6）勤對(duì)照與顯微鏡下實(shí)物對(duì)照，檢查一下是否有無遺漏或錯(cuò)誤.（7）做注釋用直線從各部分引出并注出名稱。字最好在圖右側(cè)，字要端正、大小一致、排列整齊。每個(gè)圖的下方注明圖的名稱及所用材料，例如“洋蔥表皮細(xì)胞”、“小麥穎果縱切”等。生物繪圖方法第二十六頁，共二十八頁。生物繪圖要求（1）形態(tài)結(jié)構(gòu)要準(zhǔn)確，比例要正確，要求真實(shí)感，立體感，精美而美觀。圖中較暗部分用點(diǎn)表示,用點(diǎn)的稀疏稠密表示黑暗程度，不能使用橫線或者涂黑。（2）圖面要力求整潔，鉛筆要保