普通微生物第十章微生物與基因工程

普通微生物第十章微生物與基因工程第一頁，共八十三頁，2022年，8月28日

在基因水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體DNA分子上，然后將重組DNA轉入受體細胞進行無性繁殖（稱為“克隆”）和行使正常功能（稱為“表達”），從而制備人類需要的基因、基因產物或創(chuàng)造出新的生物類型的分子生物學技術。

基因工程(geneticengineering)第二頁，共八十三頁，2022年，8月28日

。

載體（Vector）：能容忍外源DNA片段插入，可在細胞間轉移并在宿主細胞內自主復制的DNA分子。第三頁，共八十三頁，2022年，8月28日

不同來源的DNA片段共價連接、通過重新組合構成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新重組體DNA分子的過程。DNA重組（recombination)：第四頁，共八十三頁，2022年，8月28日轉化(transformation)：

以質粒為載體構建的載體DNA，在一定條件下引入受體細胞的過程?；蛑窪NA分子進入宿主細胞的過程。第五頁，共八十三頁，2022年，8月28日

基因工程核心是構建重組體DNA的技術，因此，基因工程和重組DNA技術(recombinantDNAtechnology)有時為同義詞

基因工程的出現(xiàn)使得生物科學迅猛發(fā)展，并帶動了生物技術產業(yè)的興起！第六頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因工程的特點可設計性穩(wěn)定性遠緣性風險性第七頁，共八十三頁，2022年，8月28日一、基因工程發(fā)展歷史基因工程三大理論基礎基因工程三大技術發(fā)現(xiàn)§1 基因工程概述第八頁，共八十三頁，2022年，8月28日20世紀40年代：證明了遺傳物質是DNA20世紀50年代：DNA雙螺旋結構20世紀60年代：確定了遺傳信息的傳遞方式

基因工程理論基礎

第九頁，共八十三頁，2022年，8月28日

(A)注射有莢膜（S型）的致病性肺炎雙球菌，小鼠死亡

(B)注射突變的（R型）非致病性肺炎雙球菌，小鼠存活。

(C)注射加熱殺死的S型，小鼠存活。

(D)注射活的R型與加熱殺死的S型的混合物，小鼠死亡。

圖1-1肺炎雙球菌轉化實驗第十頁，共八十三頁，2022年，8月28日

基因工程學重大的技術發(fā)現(xiàn)基因工程酶技術

1970年限制性核酸內切酶的分離和純化（HindIII）分子克隆

1972年Berg首次實現(xiàn)基因重組

1973年Cohen重組DNA轉化DNA測序

1975年Sanger實驗室建立酶法DNA測序技術

1977年Gilbert實驗室又建立化學法DNA測序技術

1980年諾貝爾化學獎授予Berg、Sanger、Gilbert

DNA的分子克隆+DNA測序

—使重組DNA技術系統(tǒng)得以產生第十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日相關理論的復習基因的概念和特性DNA的結構與性能DNA的復制與表達基因組第十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日

一基因的概念遺傳學概念：

基因:

是DNA分子中攜帶特定遺傳信息的最小功能單位，控制遺傳性狀分子生物學定義：編碼功能性蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列，負載特定的遺傳信息并在一定條件下調節(jié)、表達遺傳信息，指令蛋白質合成。

第十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因的功能分類結構基因（structuregene)：決定蛋白質/多肽鏈或酶分子結構的基因調控基因(regulatorygene)：調節(jié)控制結構基因表達功能第十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因的一般特性半保留自我復制決定生物表型或性狀基因突變新的生物性狀第十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日DNA的結構.兩條脫氧核苷酸鏈成反向平行排列，.一條呈5‘3’方向.另一條呈3‘5’方向。.以堿基配對形成氫鍵而形成雙螺旋結構.遵循互補配對原則即：

A＝TG≡C基本單位：核苷酸（堿基、五碳糖、磷酸）雙螺旋結構(A)腺嘌呤(G)鳥嘌呤(C)胞嘧啶(U)尿嘧啶(T)胸腺嘧啶第十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日第十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日DNA的三種構型：

-超螺旋：共價閉環(huán)（CCC）

-開環(huán)：單鏈缺口（OC）

-線型：雙鏈斷裂（L）LC

cccoc第十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日DNA的性能吸收光譜高峰為260nm

溴化乙啶（EB）嵌入DNA雙鏈配對堿基之間，紫外線照射，可顯示DNA位置在電場中的遷移率與分子量大小、構象有關DNA變性：在物理或化學因素作用下，氫鍵斷裂成單鏈的過程DNA復性：變性因素去除后在適當條件下恢復成雙鏈的過程。第十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日DNA變性(DNADenature)

指DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結構松解為無規(guī)則線性結構的現(xiàn)象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，均可引起核酸分子變性。解鏈溫度:TmTm=69.3＋0.41(%G+C)第二十頁，共八十三頁，2022年，8月28日DNA復性

(DNARenature)是DNA變性的一種逆轉過程。熱變性后的DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為退火(annealing)。最佳復性條件一般認為是比Tm低25℃左右的溫度復性時溫度下降必須緩慢，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復性幾乎是不可能的，核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。第二十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日DNA的復制與表達半保留復制（semi-conservativereplication）基因表達（geneexpression）mRNA蛋白

轉錄翻譯第二十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因組（genome)概念：細胞或生物體的全套遺傳物質常見基因組特點：病毒基因組原核生物基因組真核生物基因組第二十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日1.病毒基因組基因組小，基因數(shù)少帶有重疊基因大部分為編碼蛋白質的結構基因第二十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日HBV基因組第二十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日2原核生物基因與表達特點

——細菌基因表達

1）基因組較小2）基因是連續(xù)的3）沒有轉錄后加工過程和翻譯后加工過程。4）轉錄和翻譯偶聯(lián)，可同時進行。第二十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日

2.原核生物基因組細菌染色質質粒（plasmid）：

細菌染色體以外的遺傳物質，是環(huán)狀閉合的雙鏈DNA。可自主復制編碼生物學形狀基因工程常用載體第二十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日

第二十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日真核生物基因組基因組龐大3×106bp、染色質、染色體.基因不連續(xù)性斷裂基因、內含子、外顯子（大部分基因含有內含子）含有大量重復序列非編碼區(qū)域多于編碼區(qū)域非編碼區(qū)較多多于編碼序列(9:1）轉錄和翻譯不偶聯(lián)第二十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、基因工程的基本過程一、目的基因的制備(donorDNA)二、體外DNA重組(DNArecombination)三、重組DNA導入宿主細胞(Transformation)四、重組體的篩選鑒定(identification)五、控制外源基因的表達(geneexpression)第三十頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因工程過程示意圖①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質粒④DNA重組⑤用重組質粒轉化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達③③第三十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、微生物學與基因工程的關系1.提供豐富而獨特的基因資源2.工具酶3.克隆載體4.基因克隆的宿主5.基因表達的反應器6.有關基因結構、性質和表達調控的理論主要來自對微生物的研究一切基因工程操作都離不開微生物—操作技術和理論指導第三十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日一、從基因文庫或cDNA文庫分離目的基因二、酶法或化學方法人工合成基因三、PCR擴增基因四、基因的定位誘變§2 基因的分離、合成和定位誘變第三十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日基因文庫基因組DNA片段的全部克隆

一、從基因文庫或cDNA文庫分離目的基因建立基因文庫步驟：1、提取基因組DNA2、DNA片段化3、選擇合適載體4、DNA與載體連接5、重組體轉化或者轉染第三十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日cDNA文庫：生物體全部mRNA的cDNA的克隆總體mRNA的提取利用逆轉錄酶以寡聚dT或隨機寡聚核苷酸為引物合成cDNA的第一條鏈利用DNA聚合酶Ⅰ，以cDNA的第一條鏈為模板，用適當引物合成cDNA的第二條鏈，常用RNA酶H在雜交分子的mRNA鏈上造成缺口和切口，產生一系列引物，或是除去雜交分子的mRNA后，加入隨機引物合成第二條鏈其它同基因文庫的構建第三十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日第三十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日適于遺傳背景清楚的細菌染色體

酶切電泳分離DNA化學方法人工合成基因應用：1、合成基因2、合成核酸探針

探針(probe)：用同位素或其它非放射物質標記的一段特定的DNA或RNA片段3、合成DNA引物

二、酶法或化學方法人工合成基因第三十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日聚合酶鏈式反應

PolymeraseChainReaction,PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法高溫變性92～96℃低溫復性（退火）40～60℃中溫延伸70～72℃三、PCR擴增基因第三十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日PCR基本原理第四十頁，共八十三頁，2022年，8月28日第四十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日所用DNA聚合酶：Klenow聚合酶1988年Saiki等從水生棲熱菌(Thermusaquaticus)分離到TaqDNA聚合酶火球菌(Pyrococcusfuriosus)分離到PfuDNA聚合酶;從Thermococcuslitoralis分離到VentDNA聚合酶從Thermusthermophilus中分離TthDNA聚合酶校正功能第四十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日PCR注意事項：引物的設計2.退火溫度3.實驗操作第四十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日PCR應用1、基因擴增和制備DNA探針2、臨床醫(yī)學上傳染病的檢測等3、法醫(yī)上判定親緣關系4、定性、定量檢測基因表達水平第四十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日qRT-PCR(quantitativereal-timePCR)第四十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日四、基因的定位誘變

在基因精確限定的位點引入突變1、寡核苷酸指導的定位誘變2、盒式誘變3、PCR定位誘變第四十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日1.寡核苷酸指導的定位誘變第四十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日2.盒式誘變(cassettemutagenesis)

較大片段的誘變第四十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日PCR定位誘變3.PCR誘變1）變異部位位于基因的末端引物5‘端限制位點的引入2）變異部位位于基因的中間

重組PCR(recombinantPCR)—Higuchi,1988年第四十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日§3 微生物與克隆載體

克隆載體(cloningvector)：

以擴增外源DNA為目的的載體

到目前為止，基因工程中使用的載體基本上均來自微生物第五十頁，共八十三頁，2022年，8月28日克隆載體的基本要求應是一個獨立的復制子(replicon)具有多克隆位點具有選擇標記安全性第五十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日載體的種類一、質?？寺≥d體二、λ噬菌體克隆載體三、柯斯質粒載體(cosmidvector—黏粒載體)四、M13噬菌體載體五、噬菌質粒載體(phagemid/phasmid)第五十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日一、質?？寺≥d體1.質?？寺≥d體的特性：具有獨立的復制起點含有多種限制酶的單一識別位點具有較小的相對分子質量1~200kbp外源DNA<15kbp具有較高拷貝數(shù)具有便于選擇的標記易于導入細胞具有安全性第五十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日2.質粒pBR322的結構特點1977年Bolivar構建環(huán)狀雙鏈DNA4,361bp外源DNA5kbp左右松弛型質粒，一個復制起點兩個抗性基因Tetr

Ampr多克隆位點（multiplecloningsite;polylinker;24）插入失活(insertionalinactivation):

因外源DNA的插入而導致基因失活的現(xiàn)象第五十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日第五十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日3.其它質粒載體pUCpGEM系列第五十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、λ噬菌體克隆載體λ噬菌體克隆載體的優(yōu)點分子遺傳學背景十分清楚容量較大（23kbp）具有較高的感染率λ噬菌體克隆載體的構建刪除基因組中非必需區(qū)除去多余的限制酶切位點第五十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日λ噬菌體克隆載體的種類插入型載體(insertvector)取代型載體(replacementvector)78%~105%第五十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日三、柯斯質粒載體(cosmidvector—黏粒載體)由λ噬菌體的粘性末端(cos位點)和質粒構建而成黏粒的優(yōu)點具有噬菌體的高效感染率，以質粒形式存在具有質粒的復制方式具有克隆大片段外源DNA的能力(45kbp)第五十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日四、M13噬菌體載體

E.coli絲狀噬菌體環(huán)狀ssDNA6,407bp感染雄性菌后變成復制型dsDNA,以滾環(huán)方式復制出ssDNA特點：

1.間隔區(qū)插入β-半乳糖苷酶N端一小段編碼序列，編碼β-半乳糖苷酶的α肽，可與E.coli

lacZ突變基因產物ΔM15進行α互補，產生有活性的β-半乳糖苷酶。在含有異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和顯色物5-

溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板上時出現(xiàn)藍色噬菌斑

2.在α肽的編碼區(qū)插入多克隆位點，外源基因插入這一區(qū)段，破壞

α互補作用，使β-半乳糖苷酶失活，重組體產生白色噬菌斑第六十頁，共八十三頁，2022年，8月28日M13噬菌體載體克隆能力較小300~400bp特別適合用于制備單鏈DNA模板、單鏈DNA探針、定位誘變模板第六十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日五、噬菌粒載體(phagemid/phasmid)

又稱噬粒，由噬菌體M13的基因間隔區(qū)和質粒載體共同構建的載體

pUC118將野生型M13的基因間隔區(qū)插入質粒載體

pUC18構建而成在宿主細胞內以質粒形式存在，產生雙鏈DNA；當輔助噬菌體M13感染宿主細胞后，以滾環(huán)方式復制，產生單鏈DNA特點：分子小容量大10kbp可制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達外源基因第六十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日幾類大腸桿菌克隆載體比較載體類型 克隆容量 主要用途質粒載體 <15kbp 克隆和表達外源基因，DNA測序λ噬菌體載體<23kbp 構建基因文庫和cDNA文庫柯斯質粒載體<45kbp 構建基因文庫M13載體 300~400bp 制備單鏈DNA，定位誘變，噬菌體展示噬菌質粒載體<10kbp 制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達外源 基因第六十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日六、真核生物的克隆載體1.酵母質粒載體

利用酵母的2μm質粒和其他染色體組分與pBR322構建而成，為穿梭質粒附加體質粒（episomalplasmid)復制質粒(replicatingplasmid)整合質粒(integratingplasmid)第六十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日附加體質粒（episomalplasmid)具有較高拷貝數(shù)第六十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日酵母染色體的自主復制序列復制質粒(replicatingplasmid)中等拷貝數(shù)第六十六頁，共八十三頁，2022年，8月28日整合質粒(integratingplasmid)第六十七頁，共八十三頁，2022年，8月28日2.真核生物病毒載體哺乳動物病毒載體—SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒昆蟲病毒載體—桿狀病毒：高容量（100kbp)、高表達效率(25%)、安全植物病毒載體—花椰菜花葉病毒載體，Ti質粒載體第六十八頁，共八十三頁，2022年，8月28日七、人工染色體

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC) Murray1983年構建，Burke等1987年用以構建成YAC克隆庫，1000kbp容量細菌人工染色體(BAC)-120-300kb第六十九頁，共八十三頁，2022年，8月28日§4微生物與基因工程工具酶

基因工程所用到的工具酶大多數(shù)是從不同微生物中獲得的第七十頁，共八十三頁，2022年，8月28日一、限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease)

限制性酶(restrictionenzyme)：能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點或其附近特異切割DNA的一類內切酶1.命名與分類EcoRⅠHpaⅠ,HpaⅡ(Haemophilusparainfluenzae，副流感嗜血桿菌)HphⅠ(Haemophilusparahaemolyticus，副溶血嗜血桿菌)Ⅰ、Ⅱ

、Ⅲ三種類型第七十一頁，共八十三頁，2022年，8月28日2.限制性核酸內切酶的基本特性

識別序列通常由4~8bp組成，具有二重旋轉對稱軸，序列呈回文結構(paliindromicstructure)

切割片段理論大小為4nA.黏性末端(cohesiveend)HindⅢ5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’PstⅠ 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’第七十二頁，共八十三頁，2022年，8月28日B.平末端HpaⅠ 5’-GTTAAC-3’ 3’-CAATTG-5’同裂酶(isoschizomers)同尾酶(isocaudomers)Mun

ⅠEcoRⅠ5’-CAATTG-3’ 5’-GAATTC-3’3’-GTTAAC-5’ 3’-CTTAAG-5’表10-2

常用限制酶第七十三頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、DNA連接酶(DNAligase)T4DNA連接酶：Mg2+和ATP能催化平端連接大腸桿菌DNA連接酶：Mg2+和NAD+其它酶第七十四頁，共八十三頁，2022年，8月28日§5外源基因導入宿主細胞一、外源基因與載體的體外連接

1.黏性末端連接法

2.接頭或銜接物連接法

3.均聚物加尾法

4.平末端連接法第七十五頁，共八十三頁，2022年，8月28日二、宿主的基本要求與性質1.具有安全性2.能高效吸收外源DNA3.不具有限制修飾系統(tǒng)4.一般為重組缺陷型(RecA-)菌株5.