新藥發(fā)展策略及基本過程2016教材講義

藥物研究與發(fā)展新藥發(fā)展策略及基本過程StrategiesandBasicProcessofNewDrug-Development授課教師:雷林生藥物發(fā)現(xiàn)的基本方式偶然發(fā)現(xiàn)①從食物中發(fā)現(xiàn)藥物有目的尋找②藥物新適應(yīng)癥的發(fā)現(xiàn)③非常規(guī)過程發(fā)現(xiàn)藥物利用一定的程序和方法①從食物中發(fā)現(xiàn)藥物含有礦物的食物

含有維生素的食物夜盲癥豬肝(維生素A)

(大脖子病)單純性甲狀腺腫海帶(碘)維生素A是構(gòu)成視覺細(xì)胞中感受弱光的視紫紅質(zhì)的組成成分,視紫紅質(zhì)是由視蛋白和11–順–視黃醛組成，與暗視覺有關(guān)。呋喃唑酮（痢特靈）(治潰瘍)金剛烷胺

(治療帕金森病)Viagra

（sildenafil,西地那非)

②藥物新適應(yīng)癥的發(fā)現(xiàn)青霉素③非常規(guī)過程發(fā)現(xiàn)藥物偉哥萬艾可美國輝瑞（Pfizer）青霉素的發(fā)現(xiàn)

發(fā)現(xiàn)者:英國細(xì)菌學(xué)家弗萊明。

1928年的一天，弗萊明休假回到他的實(shí)驗(yàn)室，發(fā)覺棄置在消毒槽中的細(xì)菌培養(yǎng)皿瓊脂上附著一塊青霉菌。使弗萊明感到驚訝的是，在青霉菌的周圍，葡萄球菌無法生長。這個(gè)偶然的發(fā)現(xiàn)深深吸引了他，他設(shè)法培養(yǎng)這種霉菌進(jìn)行多次試驗(yàn)，證明其產(chǎn)生的青霉素可以在幾小時(shí)內(nèi)將葡萄球菌全部殺死。弗萊明據(jù)此發(fā)明了葡萄球菌的克星—青霉素。青霉素的發(fā)現(xiàn)

由于當(dāng)時(shí)的醫(yī)學(xué)界不相信青霉素的治療效果，而且弗萊明所在的研究所的所長也不支持對(duì)青霉進(jìn)行深入研究，弗萊明只好孤軍奮戰(zhàn)。由于缺乏必要的實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)及合作者，他終究沒有成功地將青霉素分離提純出來，從而未能進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

1929年，弗萊明發(fā)表了學(xué)術(shù)論文，報(bào)告了他的發(fā)現(xiàn)。青霉素的發(fā)現(xiàn)

直到二戰(zhàn)爆發(fā)(1939)，巨大的戰(zhàn)爭傷亡對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生了迫切的需求，凡是有可能搶救生命、防止感染死亡的藥物都得到了前所未有的關(guān)注與支持，此時(shí)青霉素才被人們所重視。英國牛津大學(xué)生物化學(xué)家錢恩和病理學(xué)家弗羅里對(duì)弗萊明的發(fā)現(xiàn)大感興趣。錢恩負(fù)責(zé)青霉菌的培養(yǎng)和青霉素的分離、純化，使其抗菌力提高了幾千倍，弗羅里負(fù)責(zé)動(dòng)物試驗(yàn)。完善的設(shè)備、充足的經(jīng)費(fèi)以及弗洛里和錢恩等20多名病理學(xué)家、生物學(xué)家、細(xì)菌學(xué)家、醫(yī)學(xué)家一年的分工合作，才奠定了青霉素的治療學(xué)基礎(chǔ)。青霉素這種特效藥花了近十年的時(shí)間才走完從發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用的過程。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1945

"forthediscoveryofpenicillinanditscurativeeffectinvariousinfectiousdiseases"AlexanderFlemingErnstBorisChainHowardWalterFlorey啟示1.不要放過任何一種實(shí)驗(yàn)異?，F(xiàn)象對(duì)異?，F(xiàn)象的深入研究可能導(dǎo)致新的發(fā)現(xiàn)2.合作出效益藥物發(fā)現(xiàn)的基本方式偶然發(fā)現(xiàn)①從食物中發(fā)現(xiàn)藥物有目的尋找②藥物新適應(yīng)癥的發(fā)現(xiàn)③非常規(guī)過程發(fā)現(xiàn)藥物利用一定的程序和方法第一節(jié)新藥發(fā)展策略一、 篩選二、 先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造三、 合理藥物設(shè)計(jì)四、 模仿創(chuàng)新五、 手性均一體創(chuàng)新一、 篩選（一）定向篩選（二）篩選特定樣品（三）比較篩選（四）隨機(jī)篩選單一模型篩選多種樣品單一模型篩選某類樣品單一模型篩選性質(zhì)相似的樣品多模型篩選多種樣品二、先導(dǎo)化合物(LeadCompound)的結(jié)構(gòu)改造對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行優(yōu)化，以便進(jìn)一步提高活性、降低毒性、增加特異性或改善藥代動(dòng)力學(xué)特性等。通過結(jié)構(gòu)改造能夠使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N性能更優(yōu)(毒性和副作用更小/少,效應(yīng)更優(yōu))的化合物(新藥)。舉例喹諾酮類藥物的發(fā)展簡史1962年發(fā)現(xiàn)萘啶酸,合成氯喹的副產(chǎn)物有抗菌作用,抗菌譜窄,毒副作用多。以萘啶酸為先導(dǎo)化合物合成第二代喹諾酮藥物吡哌酸。進(jìn)一步優(yōu)化成第三代氟喹諾酮類藥物氟哌酸(諾氟沙星)﹑環(huán)丙沙星﹑氧氟沙星。三、合理藥物設(shè)計(jì)依據(jù)生物化學(xué)、酶學(xué)、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)等生命學(xué)科的研究成果，針對(duì)這些基礎(chǔ)研究中所揭示的包括酶、受體、離子通道及核酸等潛在藥物作用靶位的空間結(jié)構(gòu)，再參考其內(nèi)源性配體或天然底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)藥物分子，以發(fā)現(xiàn)選擇性作用于靶位的新藥，這些藥物往往具有活性強(qiáng)、作用專一，且副作用較低的特點(diǎn)。

(rationaldrugdesign)

四、模仿創(chuàng)新(me-too)在別人專利藥物的基礎(chǔ)上，對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)加以修飾和改造，研究出自己的專利藥物。是當(dāng)今世界各國廣泛采用的戰(zhàn)略，即使是實(shí)力很強(qiáng)的大公司也不例外，因?yàn)檫@種方法投資少，周期短，成功率高，市場回報(bào)也很可觀。SmithKline根據(jù)H2-受體拮抗劑理論，成功開發(fā)出西咪替丁(cimetidine)，于1976年投放市場。Glaxo在1981年推出了他們稍加改造的類似物雷尼替丁(ranitidine)

，成為世界最暢銷的藥品，年銷售量達(dá)30多億美元。之后，Merk又推出了療效更高的法莫替丁(famotidine)。成功的例子西米替丁雷尼替丁法莫替丁咪唑環(huán)呋喃環(huán)噻唑環(huán)五、手性均一體創(chuàng)新手性藥物是指只含單一旋光異構(gòu)體(enantiomers)的藥物。手性藥物在藥效學(xué)性質(zhì)上存在四種情形：反應(yīng)停(thalidomide)的S―構(gòu)型為鎮(zhèn)靜劑，R―構(gòu)型無鎮(zhèn)靜作用而有致畸作用；(1)異構(gòu)體具有完全不同的藥理作用乙胺丁醇(ethambutol)的S，S―構(gòu)型具有抗結(jié)核菌作用，而R，R―構(gòu)型則可導(dǎo)致失明；例：(2)異構(gòu)體中一個(gè)具有藥理活性，另一個(gè)沒有藥理活性甲基多巴(methyldopa)只有S―構(gòu)型具有抗高血壓作用。例：普萘洛爾(propranolol)，S―異構(gòu)體的β―受體阻斷作用比R―異構(gòu)體強(qiáng)約100倍；(3)兩個(gè)異構(gòu)體雖藥理作用類型相同但作用強(qiáng)度不同。例：萘普生(naproxen)，其S―異構(gòu)體療效為R―異構(gòu)體的28倍。(4)兩個(gè)異構(gòu)體的藥理作用類型和作用強(qiáng)度完全相同異丙嗪(promethazine)的兩個(gè)異構(gòu)體具有相同的抗組織胺活性和毒性。例：目前世界藥品市場共約1,700種藥物中，含有手性的藥物占57％，但目前僅有20％以單一對(duì)映體作為藥用，其余80％仍以外消旋體用于臨床。自1990年初期開始，美國FDA就鼓勵(lì)大制藥公司開發(fā)單一異構(gòu)體藥物，代替消旋體上市。因此,開發(fā)單一異構(gòu)體藥物的機(jī)會(huì)越來越少。五種新藥發(fā)展策略一、 篩選二、 先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造三、 合理藥物設(shè)計(jì)四、 模仿創(chuàng)新五、 手性均一體創(chuàng)新第二節(jié)新藥研究技術(shù)一、組合化學(xué)技術(shù)組合化學(xué)(combinatorialchemistry)是由Furka等于1988年首先提出的，但直至1991年在一次專題討論會(huì)上才正式應(yīng)用這一名詞。在不同結(jié)構(gòu)的構(gòu)建塊(buildingblock)之間以共價(jià)鍵系統(tǒng)、反復(fù)地進(jìn)行連結(jié)，從而產(chǎn)生一批不同的分子實(shí)體的方法。優(yōu)點(diǎn)：合成路線簡單、產(chǎn)物種類多樣、適合高通量篩選、效率高YYYYYYYYYYZYZYZ組合化學(xué)固相合成通常有分混法和平行合成法兩種.分混法(splitmixmethod)即將固相載體等分成幾份,分別與不同反應(yīng)物作用,然后將鍵合不同反應(yīng)物的載體先混合,再分組,分別再與某一反應(yīng)物作用,如此混合、分組逐步進(jìn)行直到反應(yīng)結(jié)束.例如3個(gè)化合物ｘ,ｙ,ｚ經(jīng)三次組合合成,得3組混合物,每組9個(gè)化合物,一共產(chǎn)生33即27個(gè)化合物(圖2)二、反義技術(shù)反義核酸包括反義DNA、反義RNA和酶性核酸三種，它們可特異性地作用于靶基因或其相應(yīng)的mRNA，從基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯等各個(gè)環(huán)節(jié)上調(diào)控基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)疾病的治療。反義核酸與常規(guī)藥物相比有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①有關(guān)疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，設(shè)計(jì)、合成特異性的反義核酸比較容易；②反義寡核苷酸與靶基因能通過堿基配對(duì)原理發(fā)生特異和有效的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。天然的寡核苷酸難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而一旦進(jìn)入又易于被胞內(nèi)核酸酶水解，很難直接用于治療。缺點(diǎn)：為此人們采用藥物化學(xué)的原理和方法，對(duì)天然寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，以達(dá)到治療藥物的要求。修飾工作可以從其骨架、核糖和堿基入手,也可在核酸片段的末端進(jìn)行偶聯(lián)修飾。其中甲基化和硫代化的反義核酸藥物已進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。福米韋森(fomivirsen，Vitravene)1998年已由美國FDA批準(zhǔn)上市，用于二線治療艾滋病所致巨細(xì)胞病毒(CMV)視網(wǎng)膜炎，這是全球獲準(zhǔn)上市的第一個(gè)反義藥物。成功的例子福米韋森(fomivirsen，Vitravene，21個(gè)核苷酸)福米韋森(fomivirsen，Vitravene)硫代核酸三、高通量篩選技術(shù)(Highthroughputscreening)是使用機(jī)器人和自動(dòng)化系統(tǒng),從大量的樣品中鑒別出對(duì)確定的分子靶標(biāo)有相互作用的少量活性化合物的一種技術(shù)。被篩選出來的化合物可作為先導(dǎo)化合物,進(jìn)一步研究開發(fā)成為安全、有效的新型藥物。每天可以對(duì)數(shù)千至數(shù)萬樣品的藥物活性進(jìn)行檢測分析。多數(shù)的高通量篩選分析方法是以微孔板為基礎(chǔ)，加上高度自動(dòng)化的操作設(shè)備。具體方法因檢測對(duì)象不同而不同，但都是建立在對(duì)檢測對(duì)象分子或細(xì)胞水平的生物學(xué)機(jī)制基礎(chǔ)之上。(細(xì)胞采集設(shè)備、樣品轉(zhuǎn)移、沖洗、孵育、離心等設(shè)備、信號(hào)檢測及數(shù)據(jù)處理設(shè)備等)所使用的技術(shù)包括：不經(jīng)過濾分離直接測定信號(hào)的“同質(zhì)”技術(shù)，閃爍親近測定法(scintillationproximityassay,SPA),基于熒光、發(fā)光或比色的檢測技術(shù)，基于放射性的檢測技術(shù)，基于ELISA、報(bào)告基因、雙雜交技術(shù)等自動(dòng)化技術(shù)，SPAisbasedontheprinciplethatrelativelyweakβemitters,suchas3Hβparticlesand125IAugerelectrons,needtobeclosetoscintillantmoleculestoproducelight,otherwisetheenergyisdissipatedandlosttothesolvent.ThisconcepthasbeenusedbyAmershamPharmaciaBiotechtoproducearangeofhomogeneousimmunoassayproductsbycouplingsecondantibodiesorProteinAtofluomicrospheres.Fluomicrospheresaresolid-phasesupportparticlesorbeadsimpregnatedwithsubstancesthatfluorescewhenexcitedbyradioactiveenergy.Whenaddedtoanantibody/antigenmixturetheantibodyiscapturedonthefluomicrosphere,bringinganyboundradiolabeledantigencloseenoughtoallowtheradiationenergyemittedtoactivatethefluorescentcompoundandemitlightenergy(seetheFigurebelow).包被驢抗兔抗體的螢光微球兔抗被檢測物抗體被檢測物樣品放射物標(biāo)記的被檢測物樣品結(jié)合的放射物標(biāo)記的被檢測物激活螢光微球未結(jié)合的放射物的能量消失在液體中四、基因芯片技術(shù)基因芯片上集成了成千上萬的網(wǎng)絡(luò)狀密集排列的基因探針,能夠在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因,迅速讀取與生命相關(guān)的基因信息。它是受到在固相支持物上合成多肽的啟發(fā)而發(fā)明的。(GeneChip,DNAChip,DNAarray)(一)基因芯片用于尋找藥靶的研究一些慢性疾病為多基因相關(guān)疾病,每種這類疾病可能涉及5～10個(gè)基因。人類約有3萬種疾病,許多疾病由遺傳因素引起。這些疾病相關(guān)基因都有可能成為藥靶(藥物作用靶點(diǎn))。每一基因產(chǎn)物及與其發(fā)生作用的蛋白質(zhì)也有可能成為藥靶。利用基因芯片可以比較正常組織(細(xì)胞)及病變組織(細(xì)胞)中大量(可達(dá)數(shù)千)相關(guān)基因表達(dá)的變化,從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關(guān)基因作為藥物篩選靶.(二)ＤＮＡ芯片用于新藥篩選1997年Heller等首次使用cDNA的微矩陣檢測炎癥條件下基因的表達(dá)情況,該芯片包含與炎癥有關(guān)的部分基因。通過培養(yǎng)關(guān)節(jié)炎病人軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在TNF和IL-1的刺激下有與炎性組織相似的基因表達(dá)圖譜,從而建立以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的人類炎癥的模型。對(duì)在抗炎藥物作用下表達(dá)情況的檢測,發(fā)現(xiàn)氟輕松(fluocinolone)、地塞米松(dexamethasone)、潑尼松

(prednisone)、氫化可的松(hydrocortisone)作用極其相似。提示該模型可作為抗炎藥物的篩選。AB:cDNAmicroarraytechnologyisusedtoprofilecomplexdiseasesanddiscovernoveldisease-relatedgenes.Ininflammatorydiseasesuchasrheumatoidarthritis,expressionpatternsofdiversecelltypescontributetothepathology.Wehavemonitoredgeneexpressioninthisdiseasestatewithamicroarrayofselectedhumangenesofprobablesignificanceininflammationaswellaswithgenesexpressedinperipheralhumanbloodcells.MessengerRNAfromculturedmacrophages,chondrocytecelllines,primarychondrocytes,andsynoviocytesprovidedexpressionprofilesfortheselectedcytokines,chemokines,DNAbindingproteins,andmatrix-degradingmetalloproteinases.Comparisonsbetweentissuesamplesofrheumatoidarthritisandinflammatoryboweldiseaseverifiedtheinvolvementofmanygenesandrevealednovelparticipationofthecytokineinterleukin3,chemokine

Groalphaandthemetalloproteinasematrixmetallo-elastaseinbothdiseases.Fromtheperipheralbloodlibrary,tissueinhibitorofmetalloproteinase1,ferritinlightchain,andmanganesesuperoxidedismutasegeneswereidentifiedasexpresseddifferentiallyinrheumatoidarthritiscomparedwithinflammatoryboweldisease.TheseresultssuccessfullydemonstratetheuseofthecDNAmicroarraysystemasageneralapproachfordissectinghumandiseases.五、生物工程技術(shù)利用生物學(xué)及工程學(xué)原理為人類制造有用產(chǎn)品及提供服務(wù)的技術(shù)。工程學(xué)

研究自然科學(xué)應(yīng)用在各行業(yè)中的應(yīng)用方式、方法的一門學(xué)科，同時(shí)也研究工程進(jìn)行的一般規(guī)律，并進(jìn)行改良研究。所謂工程學(xué)，是指利用我們現(xiàn)在已經(jīng)知道的各種技術(shù)，去完成某種任務(wù)的學(xué)問，比如去完成建設(shè)任務(wù)、制造任務(wù)或共他各種各樣的任務(wù)。工程學(xué)是指按照某種有價(jià)值的實(shí)踐目的來控制、改造自然和社會(huì)的事物及過程并受到科學(xué)方法制約的知識(shí)總和。不僅包括了字面意義上的自然科學(xué)，如人機(jī)工程學(xué)、化工工程學(xué)等等，還包括社會(huì)科學(xué)，如社會(huì)工程學(xué)。如果認(rèn)為工程學(xué)只跟技術(shù)相關(guān)，那是相當(dāng)狹義的。上世紀(jì)40年代以純種微生物發(fā)酵工藝稱為近代生物工程；發(fā)展可分3個(gè)階段：上古時(shí)期，用非純種微生物自然發(fā)酵工藝稱為原始生物工程；上世紀(jì)70年代以基因工程為標(biāo)志的生物工藝稱為現(xiàn)代生物工程。一般上古時(shí)代是指文字記載出現(xiàn)以前的歷史時(shí)代.對(duì)世界各地上古時(shí)代的定義也因此不同.在中國上古時(shí)代一般指夏以前的時(shí)代.在兩河流域和埃及一般指公元前5000年以前的歷史時(shí)代.因?yàn)樯瞎艜r(shí)代沒有當(dāng)時(shí)直接的文字記載.那個(gè)時(shí)候發(fā)生的事件或人物一般無法直接考證.這些事件和人物也往往帶有神話色彩.中國上古時(shí)代傳說的帝王有:炎帝.黃帝.少昊.顓頊(zhuān

xū).帝嚳(kù)

.帝摯.堯和舜.甜酒曲是糖化菌及酵母制劑，其所含的微生物主要有根霉、毛霉及少量酵母。在發(fā)酵過程中糖化菌首先將糯米中的淀粉分解成葡萄糖，蛋白質(zhì)分解成氨基酸，接著少量的酵母又將葡糖糖經(jīng)糖酵解途徑轉(zhuǎn)化成酒精。這樣就制成了香甜可口、營養(yǎng)豐富的甜酒釀。

生物工程的內(nèi)容基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、微生物工程(發(fā)酵工程)、蛋白質(zhì)工程及生物反應(yīng)工程等。理論上任何有機(jī)物皆可由現(xiàn)代生物工程制造，足見現(xiàn)代生物工程在產(chǎn)業(yè)革命中擁有巨大潛力及發(fā)展前景。生物反應(yīng)工程:本書內(nèi)容分為生物反應(yīng)過程動(dòng)力學(xué)和生物反應(yīng)器兩部分。前者著重討論了酶反應(yīng)和細(xì)胞。反應(yīng)過程的基本動(dòng)力學(xué)規(guī)律，并重點(diǎn)探討了傳遞因素對(duì)反應(yīng)過程動(dòng)力學(xué)的影響及其處理方法；后者重點(diǎn)討論了不同操作方式反應(yīng)器的設(shè)計(jì)方法和優(yōu)化，同時(shí)討論了反應(yīng)器內(nèi)各種傳遞特性及其放大。每章列出了其內(nèi)容要點(diǎn)，并附有例題和習(xí)題，以幫助讀者理解和掌握有關(guān)概念和方法。（一）基因工程在分子水平上定向改造生物遺傳性的技術(shù)。主要環(huán)節(jié)是制備目的基因、基因重組、重組基因轉(zhuǎn)移、基因工程細(xì)胞篩選、鑒定，大規(guī)模陽性細(xì)胞培養(yǎng)、產(chǎn)物表達(dá)及純化等。主要特點(diǎn)是打破生物種間界限，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，獲得特異功能細(xì)胞，生產(chǎn)名貴藥品。人胰島素、人生長激素、人促紅細(xì)胞生成素(EPO)、人尿激酶(UK)、組織纖溶酶原激活劑(tPA)、乙肝疫苗、干擾素(IFN)、IL-2，3，6及60多種單克隆抗體(McAb)等。已上市的基因工程藥品（二）細(xì)胞工程定向改變細(xì)胞遺傳性，創(chuàng)造特異功能細(xì)胞，用于生產(chǎn)藥用產(chǎn)品及提供服務(wù)的技術(shù)稱為細(xì)胞工程。主要內(nèi)容有細(xì)胞融合、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、細(xì)胞生物反應(yīng)器等，并涉及動(dòng)植物及微生物細(xì)胞。

細(xì)胞工程學(xué)是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)原理與方法，在細(xì)胞水平研究改造生物遺傳特性，以獲得具有目標(biāo)性狀的細(xì)胞系或生物體的有關(guān)理論和技術(shù)的學(xué)科。它是一門現(xiàn)代生物科學(xué)理論和工程技術(shù)相結(jié)合的綜合性學(xué)科。細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分，同時(shí)也是現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要技術(shù)工具。其研究技術(shù)涉及到細(xì)胞器、細(xì)胞、組織和器官水平利用工程技術(shù)原理和手段所進(jìn)行的各類體外操作。生物細(xì)胞反應(yīng)工程主要研究生物細(xì)胞反應(yīng)工程工藝過程及裝備，強(qiáng)化生物反應(yīng)過程的控制和優(yōu)化。近幾年來，在生物細(xì)胞反應(yīng)工程領(lǐng)域，進(jìn)行了生物抗氧化劑蝦青素的開發(fā)研究，生產(chǎn)水平和生產(chǎn)規(guī)模居國際領(lǐng)先；成功開發(fā)了氣升式生物反應(yīng)器、固態(tài)發(fā)酵工藝和裝備，在國內(nèi)處于領(lǐng)先水平；篩選了能利用淀粉的微生物菌種，優(yōu)化衣康酸的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。細(xì)胞工程（cellengineering）是指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法，按照人們的需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上的遺傳操作，重組細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。干細(xì)胞工程是在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新的細(xì)胞工程。它是利用干細(xì)胞的增殖特性，多分化潛能及其增殖分化的高度有序性，通過體外培養(yǎng)干細(xì)胞、誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化或利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)處理干細(xì)胞以改變其特性的方法，以達(dá)到利用干細(xì)胞為人類服務(wù)的目的。其主要研究內(nèi)容一方面是胚胎干細(xì)胞的研究，如建立ES細(xì)胞系并利用ES細(xì)胞的發(fā)育多能性即環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞分化發(fā)育的影響，定向誘導(dǎo)細(xì)胞分化為特定的細(xì)胞如肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等作為細(xì)胞移植的新來源。另一方面成體干細(xì)胞的研究主要包括成體組織干細(xì)胞的分離培養(yǎng)體內(nèi)和植入體內(nèi)，更新機(jī)體病變的組織器官恢復(fù)正常功能；并用干細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞；研究體內(nèi)有效活化組織干細(xì)胞的方法，增強(qiáng)其功能。分泌人腫瘤壞死因子α的基因工程細(xì)胞系的建立

將含有人腫瘤壞死因子α(hTNFα)全長cDNA插入表達(dá)載體pSNAV2.0,產(chǎn)生重組質(zhì)粒pSNAV2.0-TNFα,利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染到人HEK-293（腎胚）細(xì)胞中,含G418(氨基糖苷類抗生素)培養(yǎng)基篩選陽性克隆hTNF/293,采用ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中hTNF蛋白的表達(dá)。

G418是一種氨基糖苷類抗生素。這種氨基糖類抗生素的結(jié)構(gòu)和新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，在分子遺傳試驗(yàn)中,是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601，Tn5的基因,干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對(duì)原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素,包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲?？剐援a(chǎn)物為氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶。pSNAV2.0載體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在E.coli質(zhì)粒骨架上含有amp抗性基因或Kan抗性基因、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)ori以及neo基因的表達(dá)單位（SV40啟動(dòng)子-neo-SV40或BGHpolyA）。中國在細(xì)胞工程方面的研究已進(jìn)入世界先進(jìn)行列。不少植物的細(xì)胞原生質(zhì)體部已再生成為完整的植株。突破了水稻、小麥、玉米、棉花和大豆的原生質(zhì)體再生成株的難關(guān),為利用原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種以及向原生質(zhì)體引入外源基因，從而為達(dá)到改良性狀，創(chuàng)建新物種的目的打下了基礎(chǔ)。原生質(zhì)指的是細(xì)胞內(nèi)的生命物質(zhì)，分化為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜。一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞即為一團(tuán)原生質(zhì)。

原生質(zhì)體：植物細(xì)胞工程中去掉細(xì)胞壁后剩余的植物細(xì)胞稱為原生質(zhì)體，實(shí)際上就是植物細(xì)胞的原生質(zhì)。

原生質(zhì)層：植物細(xì)胞中的特有名詞，指的是細(xì)胞膜、液泡膜以及兩層膜之間的細(xì)胞質(zhì)。原生質(zhì)層具有選擇透過性，當(dāng)成熟的植物細(xì)胞與外界溶液接觸時(shí)，如果存在濃度差，細(xì)胞液就會(huì)和外界溶液發(fā)生滲透作用。

此外，用花粉培養(yǎng)技術(shù)已培育出小麥、水稻等的優(yōu)良品種，并大面積進(jìn)行了推廣，利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)試管苗木，可大大加快繁殖速度，有些已進(jìn)入工廠化生產(chǎn)。當(dāng)前正在研究將組織培養(yǎng)的胚包上外衣，制成人工種子，播種后可發(fā)育成植株。

在動(dòng)物方面，人或家畜的生殖細(xì)胞通過體外受精和胚胎移植技術(shù)，已產(chǎn)生了試管嬰兒、試管牛、羊等，利用胚胎分割技術(shù)已將牛、羊等的受精卵一分為二或四，并各自發(fā)育成完整的動(dòng)物，加速了繁殖的速度。此外，向受精卵中注入特定的外源基因，可獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如在老鼠受精卵中注入人的生長素基因，可發(fā)育成巨大的超級(jí)老鼠。（三）酶工程酶或含某種特定酶的細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)加工處理后用于藥品生產(chǎn)與疾病治療的技術(shù)稱為酶工程。固定化是指通過物理或化學(xué)方法將酶或細(xì)胞限制或定位于特定空間范圍內(nèi)的技術(shù)，以期反復(fù)使用。酶或細(xì)胞固定化、生物傳感器及酶反應(yīng)器。核心內(nèi)容酶工程將生物體內(nèi)具有特定催化作用的酶類分離出來，在體外進(jìn)行催化反應(yīng)．酶反應(yīng)特點(diǎn)是在常溫、常壓下，專一性地快速進(jìn)行使化反應(yīng)；但酶不穩(wěn)定，容易失活,為了提高酶的穩(wěn)定性和適于連續(xù)作業(yè)，發(fā)展了酶的固定化技術(shù)，將酶固定在特定的載體上，當(dāng)反應(yīng)物通過固定化酶時(shí),即可快速催化生成相應(yīng)產(chǎn)物。當(dāng)前酶制劑的生產(chǎn)，主要依靠微生物發(fā)酵技術(shù)，自微生物發(fā)酵液或細(xì)胞中提取有用的酶類，如：α淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂酶、果膠酶、纖維素酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶以及用于DNA重組技術(shù)的各種工具酶等。這些酶類已被廣泛用于食品加工、紡織、制革、醫(yī)藥、加酶洗滌劑生產(chǎn)和基因工程中。

從動(dòng)、植物中提取的酶類尚不多，但也有巨大潛力，如從木瓜中可提取木瓜蛋白酶，用作肉的嫩化和啤酒的防濁，從牛胃中提取的凝乳酶，可用以制作奶酪；從尿或蚯蚓中提取的尿激酶或蚯蚓酶，可用以治療腦血栓等．人們已開始研究來源于動(dòng)、植物的酶基因，將其引入微生物體進(jìn)行表達(dá)，企圖快速大量地生產(chǎn)廉價(jià)的酶。

被稱為第二代生物技術(shù)的蛋白質(zhì)工程的一個(gè)重要任務(wù)，是將酶分子定向地加以化學(xué)修飾和改造，使之成為更有效的酶分子。（四）蛋白質(zhì)工程采用物理化學(xué)或生物學(xué)方法制造非天然蛋白質(zhì)類藥物及制藥工業(yè)用工具酶的技術(shù)稱為蛋白質(zhì)工程。蛋白質(zhì)分子主鏈切割、連接、分子內(nèi)及分子間再組合、主鏈的部分或全部人工設(shè)計(jì)、合成與組裝及側(cè)鏈修飾。或者人工定向設(shè)計(jì)非天然基因及基因定點(diǎn)突變制造特定基因，通過宿主細(xì)胞表達(dá)制造非天然蛋白質(zhì)及酶類新藥或制藥用工具酶，亦稱為第二代基因工程。研究的主要內(nèi)容克服天然蛋白質(zhì)和酶類藥物的熱不穩(wěn)定性、高免疫原性及其它缺陷，以獲得高效治療藥物及高效率制藥工具酶，推動(dòng)醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展。研究目的六、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)指將外源基因?qū)肽撤N細(xì)胞或組織，并使其得以表達(dá)的技術(shù)。它不僅是研究特定基因結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控的重要手段，而且也是基因治療的關(guān)鍵?；蜣D(zhuǎn)移除了確定特異的靶基因和適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞(組織)外，選擇有效的基因轉(zhuǎn)移方法或基因運(yùn)載系統(tǒng)(genedeliverysystem)至關(guān)重要。理想的基因轉(zhuǎn)移方法應(yīng)該是安全、高效、特異、穩(wěn)定、簡便，并具有可控性?，F(xiàn)有的基因轉(zhuǎn)移方法雖然很多，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)，但均不夠理想，因此，發(fā)展更好的基因轉(zhuǎn)移方法是當(dāng)前基因治療研究的重要課題。第三節(jié)新藥研發(fā)的基本過程

藥物研發(fā)是一項(xiàng)極其艱苦、需要高科技、高投入、高風(fēng)險(xiǎn)、同時(shí)又是高回報(bào)的活動(dòng)。

就美國來說，一種新藥的研制周期為10年左右。一個(gè)有臨床應(yīng)用前景的新藥化合物，要從8,000～10,000個(gè)化合物中篩選而得。

一種新藥的開發(fā)投資1987年平均1.25億美元，1991年達(dá)2.3億，開發(fā)投資隨時(shí)間的推進(jìn)呈上漲的趨勢。70年代以來，每5年用于開發(fā)研究的費(fèi)用就翻一番。目前約8億至10億美元。化合物的普篩組合化學(xué),高通量篩選天然產(chǎn)物（發(fā)酵產(chǎn)物，植物或海洋生物的提取物）篩選合理藥物設(shè)計(jì)先導(dǎo)化合物1～2年先導(dǎo)化合物的篩選合成結(jié)構(gòu)衍生物生物活性評(píng)價(jià)代謝研究計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)研究先導(dǎo)化合物臨床候選藥物1～2年先導(dǎo)化合物的優(yōu)化合成工藝研究臨床候選藥物生物活性評(píng)價(jià)制劑穩(wěn)定性