《產(chǎn)葉酸菌株的篩選及安全性分析的研究進(jìn)展【論文7400字】》

產(chǎn)葉酸菌株的篩選及安全性分析的研究進(jìn)展目錄TOC\o"1-2"\h\u20991產(chǎn)葉酸菌株的篩選及安全性分析的研究進(jìn)展 19091.葉酸介紹 176042.菌株的分離、鑒定及保存 254353.葉酸的篩選與安全性 295753.1葉酸產(chǎn)量的鑒定 2303523.2菌株安全性研究 331304.產(chǎn)葉酸菌株的生物特性 7177205.總結(jié) 71.葉酸介紹葉酸是一種水溶性B族維生素(B9)，來(lái)源于四氫葉酸(THF)，最還原的葉酸形式。THF包含三個(gè)組成部分——蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸酯和谷氨酸部分它們分別產(chǎn)生然后結(jié)合在一起(圖1)。葉酸可以在谷氨酸尾的長(zhǎng)度上有所不同(范圍從一個(gè)到大約八個(gè)γ-連接的l-谷氨酸鹽和附著在分子上的一個(gè)碳)REF_Ref78875644\r\h[1]。黃色或橙黃薄片狀或針狀晶體，無(wú)臭無(wú)味，加熱至約250℃，色漸變深，最后成黑色膠狀物。不易溶于水和乙醇，易溶于酸性或堿性溶液。葉酸主要在近端空腸吸收。在高濃度下，葉酸的攝取是被動(dòng)的，遵循一個(gè)梯度，而在低濃度下，攝取是主動(dòng)的，并受轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的控制。葉酸的活性形式5-MTHF是由葉酸通過(guò)肝臟中的一系列分子反應(yīng)生物合成的。首先，葉酸的6-甲基蝶呤部分經(jīng)歷了二氫葉酸還原酶催化的兩次還原(DHFR)。第一次還原產(chǎn)生二氫葉酸，然后在肝細(xì)胞中還原成四氫葉酸。四氫葉酸參與單碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并作為中間轉(zhuǎn)運(yùn)體。然后被絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶代謝為5，10-亞甲基四氫葉酸，最后被亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)代謝為5-甲基四氫葉酸REF_Ref78890374\r\h[2]REF_Ref78890768\r\h[3]。葉酸缺乏的典型癥狀是巨幼細(xì)胞性貧血。在這種情況下，紅細(xì)胞生成前體成熟的抑制導(dǎo)致紅細(xì)胞平均細(xì)胞體積的增加。因此，骨髓中出現(xiàn)了大量異常的有核紅細(xì)胞。葉酸狀態(tài)與心血管疾病、癌癥和認(rèn)知功能障礙等慢性病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。葉酸具有多種功能，包括同型半胱氨酸再甲基化為甲硫氨酸、嘌呤和嘧啶的合成，以及DNA和組蛋白中胞嘧啶的甲基化。因此，葉酸狀態(tài)不佳可能會(huì)導(dǎo)致由某些蛋白質(zhì)合成、脫氧核糖核酸合成和基因表達(dá)異常引起的慢性疾病REF_Ref78890768\r\h[3]?；谌~酸對(duì)人體健康的重要程度不斷上升，葉酸的提取、合成便成了重要的研究方向。且目前葉酸的生產(chǎn)主要是以化學(xué)合成為主，安全性不高，不能有效改良人體腸道菌群的豐富度REF_Ref78891565\r\h[4]，通過(guò)微生物方法發(fā)酵所得的葉酸品質(zhì)很高，對(duì)人體無(wú)副作用，但所得的葉酸含量比較低。因此，從自然界存在的菌株中篩選出高產(chǎn)葉酸的菌株成為了研究熱點(diǎn)。2.菌株的分離、鑒定及保存目前，國(guó)內(nèi)外通用的產(chǎn)葉酸菌株的分離一般都采用MRS固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，然后在不含葉酸的培養(yǎng)基—葉酸酪蛋白培養(yǎng)基(FACM)上進(jìn)行分離REF_Ref78986785\r\h[5]。簡(jiǎn)而言之，將外界篩選的來(lái)的菌株接種于MRS培養(yǎng)基上活化2-3次，在去葉酸的培養(yǎng)基(FACM)中加入溴甲酚紫做指示劑，Ph6.8。取活化好的待測(cè)菌株液體培養(yǎng)物1-2滴接種，置于37℃1-3d，若培養(yǎng)基溶液變黃，則指示為陽(yáng)性，表示該菌株能夠合成葉酸。菌株一般保存可通過(guò)液體石蠟和甘油保存，液體石蠟保存時(shí)先將液體石蠟滅菌，然后放于37℃恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。再將需要保存的菌種在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無(wú)菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好的斜面培養(yǎng)基上，用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)。試管需直立，置4℃或室溫下保存，一般無(wú)芽胞細(xì)菌可保存1年左右。甘油保存時(shí)將甘油和菌液以1：1的比例放置在離心管中，-80℃冰箱保存。3.葉酸的篩選與安全性3.1葉酸產(chǎn)量的鑒定近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同產(chǎn)品中葉酸含量的檢測(cè)方法進(jìn)行了深入的研究,根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同開(kāi)發(fā)出了多種檢測(cè)樣品中葉酸的方法,如比色法、薄層層析法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、微生物法和同位素放射免疫法等。比色法分為直接比色法和衍生比色法，直接比色法通過(guò)測(cè)定葉酸的最大吸收峰來(lái)定量分析樣品中葉酸的質(zhì)量濃度，應(yīng)用范圍較為小只適合葉酸藥劑及針劑的檢測(cè)。衍生比色法又可分為Folin-cioalten衍生、N-(1-N)-二乙二胺衍生、茚三酮衍生、高錳酸鉀衍生。Folin-cioalten衍生樣品中葉酸與Folin-cioalten試劑作用(室溫,堿性介質(zhì)中)產(chǎn)生的藍(lán)色化合物在760nm處有最大吸收峰因此適合檢測(cè)純品葉酸；N-(1-N)-二乙二胺衍生是基于將葉酸還原裂解為2-氨基-4-羥基-6-甲基蝶啶和對(duì)氨基苯甲酰谷氨酸,后者經(jīng)重氮化后與N-(1-N)-二乙二胺偶合形成紫紅色的偶氮化合物,于550nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，該方法適合檢測(cè)藥物中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；茚三酮衍生是采用1,2-萘并喹啉-4磺酸鈉將葉酸還原生成對(duì)氨基苯谷氨酸,生成的化合物在485nm處有最大吸收峰，主要用于測(cè)定藥劑中的葉酸；高錳酸鉀衍生是由于葉酸的蝶啶環(huán)使它本身有弱的熒光性,可以利用一些氧化劑使葉酸衍生生成具有強(qiáng)熒光性的物質(zhì)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，該方法測(cè)定植物材料及復(fù)合維生素制劑中的葉酸REF_Ref79074271\r\h[7]。薄層層析法，即葉酸經(jīng)醋酸乙酯以及氫氧化氨和正丙醇混合液展層后將斑點(diǎn)洗下,用高錳酸鉀液除去其他雜質(zhì),然后進(jìn)行重氮化反應(yīng),在550nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,計(jì)算葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。色-質(zhì)聯(lián)用也是近年來(lái)檢測(cè)葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)使用的較先進(jìn)的方法。由于有些食品成份當(dāng)中的基質(zhì)比較復(fù)雜,色譜法無(wú)法使其與葉酸完全分離,這樣引入質(zhì)譜技術(shù)就可以從定性的角度更好的解決這個(gè)問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)C18硅膠固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行處理,并對(duì)萃取液進(jìn)行濃縮后進(jìn)樣分析，色-質(zhì)聯(lián)用法分析速度快、前處理簡(jiǎn)單,比較適合于進(jìn)行批量樣品分析的實(shí)驗(yàn)室。高效液相色譜法特點(diǎn)是測(cè)定結(jié)果精確、操作步驟簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、分析速度快、分離效果理想，是近年來(lái)發(fā)展速度較快的測(cè)定葉酸的方法。天然存在的葉酸存在很多同分異構(gòu)體，應(yīng)用高效液相色譜法可以將葉酸的同分異構(gòu)體分別檢測(cè)出來(lái)REF_Ref79481029\r\h[9]。高效液相色譜法檢測(cè)葉酸通常與熒光法或者紫外法、柱后衍生等連用更能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性REF_Ref79480584\r\h[8]。微生物法利用乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)依賴(lài)葉酸生長(zhǎng)的特性為原理,是檢測(cè)生物體內(nèi)葉酸的經(jīng)典方法。微生物改良法采用了氯霉素耐藥菌株,并將酶標(biāo)板和酶標(biāo)儀引入方法中,使該方法操作簡(jiǎn)便,更適于大規(guī)模人群研究。微生物法對(duì)所有單谷氨酸葉酸及其衍生物的反應(yīng)靈敏度相同,所以在用葉酸水解酶處理樣品使所有葉酸形式轉(zhuǎn)變?yōu)閱喂劝彼崛~酸后進(jìn)行檢測(cè),就有可能得到生物樣品中葉酸的總含量值REF_Ref79481294\r\h[10]。核素放射免疫法主要利用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制反應(yīng)原理。該方法對(duì)多谷氨酸葉酸反應(yīng)的相對(duì)靈敏度有較大差別,隨著葉酸濃度增加,反應(yīng)的相對(duì)靈敏度增加,但多谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線(xiàn)不可能與單谷氨酸葉酸的反應(yīng)曲線(xiàn)重合;與單谷氨酸葉酸相比,多谷氨酸葉酸與結(jié)合蛋白的親合性較高;并且放射免疫法對(duì)不同的單谷氨酸葉酸衍生物反應(yīng)靈敏度不同,不適用于檢測(cè)單谷氨酸葉酸衍生物的混合物REF_Ref79481357\r\h[11]。3.2菌株安全性研究菌株在應(yīng)用食品發(fā)酵工業(yè)使用前，其安全性評(píng)價(jià)非常必要。具有抗藥性的菌株，有可能將抗藥基因轉(zhuǎn)移到人體胃腸道內(nèi)病原菌中，從而威脅人體健康，表現(xiàn)為溶血性的菌株被人體攝入后可能會(huì)引起敗血癥。因此抗生素耐藥性評(píng)價(jià)及溶血性評(píng)價(jià)是評(píng)價(jià)菌株安全性的重要指標(biāo)，菌株投入生產(chǎn)前對(duì)乳酸菌的安全性的不容忽略。3.2.1致病基因與產(chǎn)生毒性代謝采用所篩選菌株的基因組序列分別與抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD（theComprehensiveAntibioticsResistanceDatabase）和毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)VFDB（VirulenceFactorsofPathogenicBacteria）進(jìn)行比對(duì)分析?？剐曰虮葘?duì)中，將相似性50%以上設(shè)為可信預(yù)測(cè)。毒力因子分析將相似性70%以上設(shè)為可信預(yù)測(cè)REF_Ref79996981\r\h[12]。即可得到他們的抗性基因以及毒力因子，進(jìn)一步分析得到他們有何作用，如何起作用，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生那些影響。同時(shí)，有學(xué)者對(duì)乳酸脫氫酶的釋放進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒測(cè)量培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的釋放量。細(xì)胞毒性百分比(乳酸脫氫酶釋放)根據(jù)以下等式計(jì)算:OD490(490nm處的光密度)為(處理樣品的吸光度-樣品對(duì)照孔的吸光度)/OD490(最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔的吸光度)×100REF_Ref80605580\r\h[13]。3.2.2溶血活性溶血是紅細(xì)胞的分解，血紅蛋白分解的最后階段是從紅細(xì)胞中釋放出來(lái)。因此，溶血是細(xì)菌的關(guān)鍵毒力因子。通常情況下實(shí)驗(yàn)室所采用的檢測(cè)溶血活性的培養(yǎng)基是無(wú)菌脫纖維兔血REF_Ref80607483\r\h[14]、無(wú)菌脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂REF_Ref80607489\r\h[15]培養(yǎng)基。細(xì)菌的溶血活性類(lèi)型有3種，即甲型(α)溶血:菌落周?chē)霈F(xiàn)較窄的草綠色溶血環(huán),習(xí)慣上稱(chēng)這類(lèi)菌為甲型溶血性鏈球菌,即草綠色鏈球菌;乙型(β)溶血:菌落周?chē)霈F(xiàn)較寬的透明溶血環(huán),這類(lèi)菌被稱(chēng)為乙型溶血性鏈球菌,能產(chǎn)生溶血素等毒素,致病性強(qiáng);丙型(r)溶血:菌落周?chē)鸁o(wú)溶血環(huán)。一般情況下血平板的制作過(guò)程如下:先無(wú)菌采血,脫纖。將普通培養(yǎng)基加熱溶化,待冷卻至50-55℃時(shí),以5%-10%比例,無(wú)菌加入新鮮脫纖血,無(wú)菌室倒鋪平皿,冷卻即成。實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的細(xì)菌培養(yǎng)特性如下：大腸桿菌培養(yǎng)特性：麥康凱瓊脂上形成紅色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上產(chǎn)生黑色金屬閃光的菌落；在SS瓊脂上一般不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較差，生長(zhǎng)者呈紅色。一些致病性菌株在綿羊血平板上可產(chǎn)生β溶血。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)24h后，形成圓形突起、光滑、濕潤(rùn)、半透明、灰白色菌落，直徑2-3mm，S型菌株在肉湯中培養(yǎng)18-24h，呈均勻渾濁，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌環(huán)；沙門(mén)氏菌培養(yǎng)特性：麥康凱瓊脂培養(yǎng)時(shí)形成無(wú)色透明或半透明的菌落。尤為重要的是金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生四種溶血模式，α、β、γ、δ。α-溶血在羊血瓊脂(SBA)上產(chǎn)生邊緣模糊的廣泛的完全溶血區(qū)。β-溶血產(chǎn)生寬范圍的不完全溶血，邊緣銳利。γ-溶血是邊緣模糊的不完全溶血的狹窄區(qū)域。在SBA上看不到δ-溶血，因?yàn)樗画傊种啤＆?溶血部分抑制α-溶血，導(dǎo)致比α-溶血單獨(dú)產(chǎn)生的區(qū)域更渾濁。δ-溶血與β-溶血有很強(qiáng)的協(xié)同作用，產(chǎn)生的渾濁帶比δ-溶血產(chǎn)生的渾濁帶更寬REF_Ref81211739\r\h[16]。3.2.3藥敏試驗(yàn)致病菌抵抗抗生素的特性就是耐藥性，分固有和獲得兩大類(lèi)耐藥性[17]。對(duì)某些抗菌藥物天生不敏感的細(xì)菌為固有耐藥性。如大腸桿菌等G-菌對(duì)青霉素類(lèi)抗生素敏感性較弱，金葡菌等G+菌對(duì)鏈霉素敏感性比較弱。目前對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康危害較為嚴(yán)重的是細(xì)菌的獲得性耐藥性，是細(xì)菌自發(fā)轉(zhuǎn)變敏感性形成耐藥性的狀態(tài)，是因?yàn)樗幬镞x擇性壓力引起的，與其生物學(xué)特性無(wú)關(guān)，這是細(xì)菌為了應(yīng)對(duì)環(huán)境變化而產(chǎn)生生存的本能反應(yīng)，是適者生存自然選擇現(xiàn)象[18]。近年來(lái)，細(xì)菌界又增加了多重耐藥性的病原菌，其耐藥性更強(qiáng)，危險(xiǎn)程度更高，甚至到了沒(méi)有藥物可以抵抗的地步。肉湯稀釋法(BrothDilutionMethod)方法通過(guò)測(cè)定MBC和MIC的結(jié)果來(lái)判定受試細(xì)菌對(duì)指定藥物的敏感程度?？煞譃楹炅亢臀⒘?jī)煞N肉湯稀釋法，實(shí)驗(yàn)的基本原理基本相同。都是利用一定濃度的抗菌藥物與含有待試菌的培養(yǎng)液進(jìn)行系列稀釋?zhuān)?7℃恒溫培養(yǎng)后，肉眼觀(guān)察培養(yǎng)液的渾濁程度，最低抑菌濃度是無(wú)菌生長(zhǎng)的藥物濃度。然后將全部完全無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)液分別接菌于適于被試菌生長(zhǎng)的普通瓊脂板上，12h后無(wú)菌落生長(zhǎng)的瓊脂平板中的最低藥物濃度即為最低殺菌濃度（minimalbactericidalconcentration）。微量肉湯稀釋法（MicrobrothDilutionMethod）該方法是在肉湯稀釋法的基礎(chǔ)發(fā)展而來(lái)的，只是試管變成了96孔聚苯乙烯微孔板，實(shí)驗(yàn)步驟與宏量肉湯稀釋法基本相同。但微孔的結(jié)構(gòu)便于觀(guān)察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。96孔微孔板可以同時(shí)測(cè)定8種或者12種抗生素的最低抑菌濃度，大大提高了檢測(cè)效率。K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法（DiskDiffusionMethod）目前使用最為廣泛的細(xì)菌藥物敏感測(cè)定方法之一是K-B紙片法，此法是將浸有抗菌藥物的紙片平鋪與涂有細(xì)菌的瓊脂板上。濃度按倍數(shù)依次遞減的抗菌藥物在瓊脂平板上擴(kuò)散，細(xì)菌被抑制于紙片周?chē)纬梢志?，通過(guò)測(cè)定抑菌圈大小即可判定受試菌的藥敏性。通常情況下，抑菌圈的直徑跟受試藥物的濃度呈負(fù)相關(guān)。試管法是一種對(duì)藥物進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑥亩^(guān)察不同濃度的藥物對(duì)細(xì)菌的抑制作用，以此來(lái)判定該藥是否對(duì)細(xì)菌有抑制作用的常用藥敏方法REF_Ref83727942\r\h[19]。同時(shí)，我們開(kāi)發(fā)了一種藥敏試驗(yàn)，它利用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定細(xì)菌釋放的ATP和細(xì)菌溶液的總光密度(OD600)REF_Ref83727262\r\h[20]。細(xì)菌在生長(zhǎng)階段或在有效抗生素存在下裂解時(shí)會(huì)釋放ATP。由于光密度在生長(zhǎng)階段增加，但在細(xì)菌裂解過(guò)程中不改變，在細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段(這是穩(wěn)定的)后ATP：光密度比的增加將表明抗生素的有效性。具體地說(shuō)，在允許具有卡那霉素抗性的大腸桿菌(E.coli)菌株通過(guò)生長(zhǎng)階段并達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，加入大腸桿菌敏感的抗生素左氧氟沙星，與單獨(dú)使用卡那霉素相比，ATP：OD600的比率(1.80+/-0.50比1.12+/-0.28)顯著增加(1.80+/-0.50vs.1.12+/-0.28)，與單獨(dú)使用卡那霉素相比，左氧氟沙星的加入顯著增加了ATP：OD600的比率(1.80+/-0.50比1.12+/-0.28)。這一差異可以在細(xì)菌樣本中加入抗生素(細(xì)菌對(duì)抗生素敏感)20分鐘后測(cè)量。此外，這種方法對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也是有效的，因?yàn)樵诳莶菅挎邨U菌(B.subtilis)的氯霉素抗性菌株中加入卡那霉素，ATP：OD600的比值為2.14+/-0.26，而不使用該抗生素的細(xì)菌的ATP：OD600比值為0.62+/-0.05，而對(duì)該細(xì)菌敏感的抗生素則為0.62+/-0.05，而加入卡那霉素的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株的ATP：OD600比值為2.14+/-0.26。3.2.4益生菌對(duì)宿主組織的粘附對(duì)于益生菌粘附性能的檢測(cè)，目前還沒(méi)有一個(gè)合適的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。腸粘膜是進(jìn)入腸道的微生物與之結(jié)合的起始膜，它在益生菌的粘附和定植方面具有重要的作用。腸粘膜表面覆蓋一層由粘蛋白組成的粘液(Mucus)，由于腸上皮細(xì)胞的不斷更新和粘液糖蛋白的不斷分泌?進(jìn)入腸道的益生菌首先粘附于粘液粘蛋白上，而不是直接到達(dá)上皮細(xì)胞，并且在粘附的過(guò)程中還受到一些環(huán)境因素的影響，使得粘附過(guò)程呈現(xiàn)出一個(gè)動(dòng)態(tài)的復(fù)雜體系，這為我們研究益生菌的粘附定植帶來(lái)了一定的困難。國(guó)外學(xué)者在研究益生菌粘附性能這方面?大都采用與體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞共孵育的辦法來(lái)檢測(cè)候選菌株的粘附力。目前，國(guó)內(nèi)外用于評(píng)價(jià)粘附的體外模型主要包括革蘭氏染色模型，同位素標(biāo)記模型和酶聯(lián)免疫標(biāo)記模型(EUSA)?粘附抑制實(shí)驗(yàn)也能從側(cè)面反映益生菌的粘附能力。體內(nèi)模型主要采用免疫組化?原位標(biāo)記等方法。Elina等采用革蘭氏染色和放射性同位素標(biāo)記的方法檢測(cè)了12株乳桿菌對(duì)CaCo-2細(xì)胞的粘附,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌、鼠李糖亞種的粘附率可高達(dá)14.40。ehauviere等以CaCo-2細(xì)胞為模型，采用細(xì)胞培養(yǎng)革蘭氏染色的方法對(duì)25株乳桿菌進(jìn)行了粘附性能的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有7株乳桿菌對(duì)CaCo-2細(xì)胞的粘附力較強(qiáng)。其中一株從人糞便中分離出的高粘附力菌株嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidhilus)LB的粘附性是不依賴(lài)于鈣離子的。在粘附過(guò)程中，一般共孵育1.5h后達(dá)到最大粘附量，并且具有濃度依賴(lài)性，酸性環(huán)境有利于其粘附。鄧一平等采用ELIsA法檢測(cè)雙歧桿菌與豬胃粘液糖蛋白的粘附，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌表面分子脂磷壁酸和完整膚聚糖均參與了菌體與粘液粘蛋白粘附。近年來(lái)，在革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及古細(xì)菌的細(xì)胞壁表面均發(fā)現(xiàn)存在一種表面層蛋白(5layerprotein)，這種蛋白一般呈單分子晶體排列，具有方形或六邊形對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，化學(xué)分析S層蛋白由單一蛋白質(zhì)或糖蛋白組成，分子量約為40-200kD大量的研究表明，S層蛋白可能與細(xì)菌的粘附有關(guān)。實(shí)驗(yàn)室條件下，我們先將細(xì)菌培養(yǎng)24h后，將生長(zhǎng)在MRS肉湯中的細(xì)菌以5000rpm離心15min，洗滌兩次，再懸浮在0.1MKNO3(pH6.2)中，細(xì)胞數(shù)約為108CFUmL-1。在600nm(A0)處測(cè)量細(xì)胞懸液的光密度。在3mL細(xì)胞懸液中加入1mL溶劑。在室溫下孵育10min后，將兩相體系混合2min。室溫孵育20min后除去水相，在600nm(A1)處測(cè)量其光密度。細(xì)菌對(duì)溶劑的粘附率計(jì)算為：粘附率=（1-A1/A0）*100：本研究測(cè)試了三種不同的溶劑：二甲苯；氯仿,單極性和酸性溶劑；乙酸乙酯，單極性和堿性溶劑。3.2.5血小板凝集一般情況下，我們使用PFA-100血小板功能分析儀在全血樣本中評(píng)估菌株誘導(dǎo)血小板聚集的可能性。將細(xì)菌培養(yǎng)物離心、洗滌，然后用生理鹽水(OD600=1)獲得顆粒。血液(2.7mL；血小板2.28×108)與細(xì)菌(50μL；~5×107CFU)或生理鹽水(50μL)混合，作為陰性對(duì)照。將混合樣品(900μL)分別加入含有膠原/二磷酸腺苷(C/ADP)和膠原/腎上腺素(C/EPI)的一次性藥盒中，測(cè)量閉合時(shí)間(CT)REF_Ref84599685\r\h[20]。3.2.6對(duì)胃腸黏膜蛋白分解能力現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外關(guān)于粘蛋白降解方面逐漸形成了一個(gè)較為成熟的方法。將細(xì)菌接種到含有0.3%粘蛋白的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，無(wú)葡萄糖的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含1%葡萄糖的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含0.3%粘蛋白和1.0%葡萄糖的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)8h和24h后，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物在600nm處的吸光度和pH值來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況REF_Ref84599685\r\h[21]。4.產(chǎn)葉酸菌株的生物特性對(duì)于產(chǎn)葉酸菌株的生物特性，當(dāng)前研究較少。在趙宏飛學(xué)者的研究中提出產(chǎn)葉酸菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)較為一致，在2h后產(chǎn)酸開(kāi)始加快，在12h左右產(chǎn)酸達(dá)到頂峰，在20h左右開(kāi)始結(jié)束對(duì)數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期，與徐玲燕學(xué)者的研究一致REF_Ref78986785\r\h[22-23]。在生長(zhǎng)溫度方面，研究提出產(chǎn)葉酸菌株最適宜的生長(zhǎng)的溫度為37℃，當(dāng)溫度達(dá)到40℃以上后菌體的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，但是不同的菌株具體的適應(yīng)溫度不一致。在生長(zhǎng)環(huán)境方面，研究提出產(chǎn)葉酸菌株在葡萄糖、蔗糖和乳糖碳源條件下生長(zhǎng)速度最快，但是在乳糖碳源條件下生長(zhǎng)速度稍遜于葡萄糖和蔗糖。除此之外，不同的菌株在葡萄糖以及蔗糖碳源條件下生長(zhǎng)速率會(huì)呈現(xiàn)不同的利用率。不同的氮源條件也對(duì)菌株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，一般的氮源條件對(duì)于菌株的生長(zhǎng)促進(jìn)作用是一樣的，沒(méi)有很大的區(qū)別，因此，產(chǎn)葉酸菌株對(duì)于氮源條件要求不高。在pH值方面，由于微生物細(xì)胞對(duì)于pH值比較敏感，因此pH值對(duì)于產(chǎn)葉酸菌株來(lái)說(shuō)較為重要。研究提出產(chǎn)葉酸菌株一般在PH值5.0-6.5之間生長(zhǎng)較快，在PH值在5.0以下時(shí)，生長(zhǎng)速率會(huì)受到影響，逐漸降低，同時(shí)不同菌株適應(yīng)的PH值也有細(xì)微不同。5.總結(jié)葉酸對(duì)于人體健康具有重要作用，當(dāng)前運(yùn)用產(chǎn)葉酸菌株合成葉酸成為主要的研究方向，但是在運(yùn)用中產(chǎn)葉酸菌株的篩選及安全性是運(yùn)用產(chǎn)葉酸菌株合成葉酸的前提，具有重要意義。當(dāng)前對(duì)于產(chǎn)葉酸菌株的篩選主要運(yùn)用比色法、薄層層析法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、微生物法和同位素放射免疫法等，在安全性方面也已有很多方法進(jìn)行測(cè)定，在未來(lái)關(guān)于產(chǎn)葉酸菌株的測(cè)定與安全性測(cè)定方法優(yōu)化需通過(guò)更多具體且專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)與測(cè)試，為工業(yè)化生產(chǎn)提供更多有效驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)BlancquaertD,DeSteurH,GellynckX,VanDerStraetenD.Presentandfutureoffolatebiofortificationofcropplants.JExpBot.2014Mar;65(4):895-906.doi:10.1093/jxb/ert483.PMID:24574483.FerrazziE,TisoG,DiMartinoD.Folicacidversus5-methyltetrahydrofolatesupplementationinpregnancy.EurJObstetGynecolReprodBiol.2020Oct;253:312-319.doi:10.1016/j.ejogrb.2020.06.012.Epub2020Jun13.PMID:32868164.EbaraS.Nutritionalroleoffolate.CongenitAnom(Kyoto).2017Sep;57(5):138-141.doi:10.1111/cga.12233.Epub2017Jul25.PMID:28603928.ZhangJ,CaiD,YangM,HaoY,ZhuY,ChenZ,AzizT,SarwarA,YangZ.Screeningoffolate-producinglacticacidbacteriaandmodulatoryeffectsoffolate-biofortifiedyogurtongutdysbacteriosisoffolate-deficientrats.FoodFunct.2020Jul22;11(7):6308-6318.doi:10.1039/d0fo00480d.PMID:32602881.TameneA,BayeK,KariluotoS,EdelmannM,BationoF,LeconteN,HumblotC.LactobacillusplantarumP2R3FAIsolatedfromTraditionalCereal-BasedFermentedFoodIncreaseFolateStatusinDeficientRats.Nutrients.2019Nov18;11(11):2819.doi:10.3390/nu11112819.PMID:31752138;PMCID:PMC6893693.徐玲燕.產(chǎn)葉酸菌株的篩選、生物學(xué)特性研究和發(fā)酵條件優(yōu)化[D].浙江工業(yè)大學(xué),2012石丹,賈云虹,包怡紅,生慶海.葉酸檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)乳品工業(yè),2009,37(03):42-45.張毅.葉菜中葉酸含量的HPLC測(cè)定條件優(yōu)化及不同處理方式對(duì)葉酸保留效果研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2016.VanDaeleJ,BlancquaertD,KiekensF,VanDerStraetenD,LambertWE,StoveCP.FolateProfilinginPotato(Solanumtuberosum)TubersbyUltrahigh-PerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry.JAgricFoodChem.2014Apr9;62(14):3092-3100.doi:10.1021/jf500753v.Epub2014Mar31.PMID:24655154.郝玲,鄭俊池,田熠華,范大為,李竹.血漿葉酸兩種常用檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的比較[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,(02):210-214.KOHASHIM,INOUEK,SOTOBAYASHIH,etal.Microdetermi-nationofFolateMonoglutamatesinSerumbyLiquidChromatographywithElectrochemicalDetection[J].JChromatogr,1986,382:303-307.]張一爽.副干酪乳桿菌抗生素耐藥性分析及蛋白酶活性評(píng)價(jià)[D].哈爾濱工業(yè)大學(xué),2020.HassanHA,DingX,ZhangX,ZhuG.FishborneEdwardsiellatardaehainvolvedinthebacterialbiofilmformation,hemolyticactivity,adhesioncapabilityandpathogenicity.ArchMicrobiol.2020May;202(4):835