Notch信號通路對小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)分化無影響,神經(jīng)生物學論文

Notch信號通路對小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)分化無影響,神經(jīng)生物學論文Notch信號通路在生物進化中具有高度保守性，介入生物體內(nèi)諸多重要生命經(jīng)過，如細胞的增殖、分化、存活、凋亡等．蛋白O-連接巖藻糖基轉移酶1(proteinO-fucosyltransferase1，Pofut1)介入Notch受體蛋白中蛋白-O-連接巖藻寡糖的合成，Pofut1基因缺失使得Notch受體蛋白構造發(fā)生改變而無法與相應配體結合，導致Notch信號無法傳遞．在哺乳動物中Notch有4種受體(Notch1，2，3，4)、2種Jagged配體(Jagged1，2)和3種Delta配體(Delta1，3，4)．Notch信號分子與相鄰細胞外表配體結合，激活ADAM蛋白酶(Adistintegrinandmetalloprotease)使之水解，產(chǎn)生Notch的胞外區(qū)，在分泌酶復合體介導下，釋放Notch蛋白的可溶性胞內(nèi)區(qū)(Notchintracellulardomain，NICD)并轉移至核內(nèi)，與轉錄抑制因子CSL(CBFl/SuppresorofHairless/Lag1)結合，誘導其下游靶基因如Hes1、Hes5等的表示出．有研究證實，在胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞分化經(jīng)過中，Notch信號轉導通路的活化狀態(tài)對細胞分化經(jīng)過發(fā)揮重要作用．本研究應用Pofut1基因敲除小鼠胚胎干細胞體外誘導分化為神經(jīng)細胞，研究Notch信號通路對小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)分化的影響．結果表示清楚，Notch信號傳遞能力缺失對小鼠胚胎干細胞生長無明顯影響，但對擬胚體的構成和向神經(jīng)細胞分化起到促進作用．1材料與方式方法1.1材料Pofut1基因敲除胚胎干細胞(ESC)和對照的野生型ESC，以及飼養(yǎng)層SNL2細胞由美國愛因斯坦醫(yī)學院PamelaStanley教授惠贈．低粘附的6孔培養(yǎng)板(Cat#3471)購自StemCell公司;逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司;實時定量PCR試劑盒購自MJ公司;全反式維甲酸購自Sigma公司．抗O4、GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)和NFM(neurofilamentmedium)單克隆抗體購自Chemicon公司;驢抗兔、抗山羊IgG購自JacksonImmunology公司．其余用于ESC分化的常規(guī)培養(yǎng)用器材購自BD公司．1.2細胞培養(yǎng)飼養(yǎng)層細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將3105細胞鋪在10cm培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)．胚胎干細胞常規(guī)培養(yǎng)在鋪有單層飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1000ULIF/mL的DMEM，于37℃培養(yǎng)．1.3擬胚體的構成和神經(jīng)細胞的分化胚胎干細胞經(jīng)胰酶消化成單細胞，并重新懸浮于EB(embryoidbody)培養(yǎng)基(含15%EB級胎牛血清的DMEM)，以5104細胞接種于低粘附的6孔板中，應用RA4+4－懸浮培養(yǎng)8d以構成擬胚體，前4d培養(yǎng)基中含5107細胞全反式維甲酸，后4d去除維甲酸．EB繼續(xù)在預先包被poly-L-ornithine/laminin的細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)8d，使EB分化構成神經(jīng)細胞，并于顯微鏡下觀察分化細胞的形態(tài)．1.4細胞免疫組化染色用預先包被poly-L-ornithine/laminin的蓋玻片培養(yǎng)生長分化的細胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定30min，0.5%TritonX-100/PBS室溫處理5min，參加1∶400兔抗NFM抗體，或者1∶100羊抗GFAP或者1∶500羊抗O4抗體，于4℃孵育過夜，經(jīng)PBS清洗3次，參加熒光標記(FITC或者羅丹明)1∶100驢抗IgG，37℃孵育1h，PBS清洗3次，100g/mLDAPI染色1h，水洗后，以Anti-fadegoldTMmountMedium封片．1.5Real-timePCR分析用Trizol提取細胞總RNA，根據(jù)TaKaRa反轉錄試劑盒操作講明進行cDNA第一鏈合成，并以此為模板，進行實時定量PCR檢測基因表示出，引物序列見Table1，根據(jù)操作講明書進行．PCR反響程序:95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共45個循環(huán)．基因相對表示出量應用2－Ct法計算，以GAPDH作為內(nèi)參基因．1.6統(tǒng)計分析本文統(tǒng)計分析采用Studentst檢驗，使用GraphPadPrism軟件進行分析．2結果2.1Pofut1缺失對ES細胞生長的影響研究表示清楚，Pofut1負責催化Notch家族分子(包括Notch1～4)細胞外段的O-巖藻糖化，該基因的突變將導致Notch家族所有成員均無法與相應配體結合，進而不能啟動和傳遞Notch信號．因而，Pofut1基因敲除小鼠表型比單一Notch分子敲除小鼠更為嚴重．本文首先分析了Notch信號缺失對ES細胞增殖的影響，F(xiàn)ig．1結果顯示，與對照組相比，在Notch信號缺失時，體外培養(yǎng)ES細胞本身的生長未見明顯影響．2.2Pofut1缺乏對擬胚體構成的影響擬胚體的構成是ES細胞體外分化的必經(jīng)經(jīng)過，擬胚體在構造上能夠模擬早期胚胎發(fā)育經(jīng)過，包括在內(nèi)細胞團外表構成內(nèi)胚層、柱狀上皮細胞的分化，以及空腔的構成．Notch信號缺失的ES細胞構成的擬胚體(EB)數(shù)量增加(Fig．2A)，并且構成的EB體積增大，形狀相對不規(guī)則，且大小不均一(Fig．2B)．2.3Pofut1缺乏對神經(jīng)細胞纖維的影響經(jīng)過維甲酸(RA)誘導后的擬胚體在鋪有poly-L-ornithine/laminin的培養(yǎng)皿中繼續(xù)分化，部分貼壁生長的EB向外生長分化為具有分支的神經(jīng)樣細胞團，見Fig．3B～D，缺乏Notch信號的EB與正常對照的EB相比，產(chǎn)生具有神經(jīng)樣的細胞明顯比對照組多(Fig．3E)，表示清楚Notch信號缺失有助于ES細胞經(jīng)過EB向神經(jīng)細胞分化．2.4Pofut1缺乏對神經(jīng)細胞標志分子的影響為確認Notch信號傳遞系統(tǒng)對神經(jīng)細胞分化的影響，應用神經(jīng)細胞特異性的單克隆抗體，對貼壁生長的分化細胞進行免疫組化染色，結果如Fig．4．抗神經(jīng)纖維(neurofilamentmedium，NFM)單克隆抗體在突變的ES分化細胞中被標記，神經(jīng)纖維明顯長于對照組;星形膠質細胞標記物GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)和少突膠質細胞標記分子O4的免疫組化結果表示清楚，在突變EB分化的神經(jīng)細胞中的表示出強于對照組．2.5Pofut1缺乏對神經(jīng)分化經(jīng)過中Notch靶基因表示出的影響進一步應用實時定量RT-PCR分析了Notch信號缺失對靶基因Hes1表示出的影響．如Fig．5結果顯示，無論在ES向神經(jīng)分化前或后，Pofut1基因表示出缺失對Notch1基因本身的表示出均沒有明顯影響;在ES細胞分化前，Pofut1缺失與對照組相比靶基因Hes1的表示出未見差異不同，但在ES分化后，Pofut1缺失組Hes1基因的表示出則明顯下降(P＜0.01)．3討論Notch信號系統(tǒng)幾乎牽涉所有細胞的增殖和分化活動，普遍達到胚胎發(fā)育期的各種組織及各種成熟組織中未分化并具有增殖能力的細胞，是影響細胞命運的保守而重要的信號通路之一．研究表示清楚，Notch信號系統(tǒng)激活能抑制胚胎干細胞的分化，當Notch與其配體結合后胚胎干細胞進行增殖，當Notch活性被抑制時，干細胞進入分化程序，進而發(fā)育為功能細胞．Notch受體胞外段的EGF(epidemicgrowthfactor)重復序列能被Pofut1所修飾．Pofut1基因敲除小鼠具有其體內(nèi)所有Notch信號通路被阻斷的特點，并導致其體內(nèi)全部Notch受體信號失活的表型．本文應用Pofut1基因敲除的ES細胞，討論了Notch對ES細胞向神經(jīng)分化的影響．結果表示清楚，Notch信號缺失不影響ES細胞的增殖．但在誘導神經(jīng)分化經(jīng)過中促進擬胚體數(shù)量增加、體積增大;分化后Notch信號缺失的ES細胞產(chǎn)生的神經(jīng)樣細胞明顯增加，且神經(jīng)細胞標志物如NFM、GFAP以及O4等的表示出明顯增加，講明Notch信號缺失能夠促進ES細胞經(jīng)EB向神經(jīng)的分化．基因表示出分析表示清楚，在Pofut1缺失的分化細胞中，Notch1表示出沒有明顯變化，但其下游靶基因Hes1轉錄水平明顯降低，講明Pofut1缺失不影響Notch基因本身的表示出但抑制Notch下游靶基因的表示出．曾有研究結果以為，在哺乳動物ES細胞中缺失Pofut1后，其細胞外表仍然具有與野生型一樣水平的Notch受體，但是其不能與Notch配體相結合，并使Notch信號通路全部被阻斷．這與本文利用real-timePCR檢測ES、EB細胞中Notch1和Hes1轉錄水平結果一致．某些研究顯示，Notch信號對于神經(jīng)軸突抑制生長和維護具有重要作用．Sestan等和Berezovska等證實，激活Notch能夠抑制神經(jīng)軸突的生長或使神經(jīng)軸突萎縮，而抑制Notch1信號能夠促進神經(jīng)軸突的延伸．Tanigaki等利用逆轉錄病毒將活化的Notch1和Notch3轉入大鼠海馬區(qū)，發(fā)現(xiàn)少突膠質細胞則減少．同時，Sdrulla等發(fā)現(xiàn)，在視神經(jīng)中Notch也能夠抑制少突膠質細胞分化的發(fā)生．本文結果表示清楚，在EB向神經(jīng)分化經(jīng)過中少突膠質細胞在Notch信號缺失下明顯多于對照組，這與上述研究結果相符．Ramasamy等研究表示清