葡聚糖凝膠層析脫鹽

葡聚糖凝膠層析脫鹽生化實(shí)驗(yàn)六葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!學(xué)習(xí)凝膠層析的工作原理和操作方法；掌握利用葡聚糖凝膠層析進(jìn)行蛋白質(zhì)脫鹽的技術(shù)。目的葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!原理凝膠層析又稱凝膠過濾，分子篩或排阻層析。凝膠過濾的主要裝置是填充有層析介質(zhì)的層析柱。凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!原理1、層析介質(zhì)的特點(diǎn)（1）遇水為不溶解的固相；（2）是化學(xué)惰性物質(zhì)；（3）離子基團(tuán)含量少；（4）顆粒大小和網(wǎng)眼均勻；（5）機(jī)械強(qiáng)度較強(qiáng)；（6）具有可選擇的多種孔徑。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!原理當(dāng)葡聚糖分子量越小，交聯(lián)劑用量越大，則交聯(lián)度越大，凝膠網(wǎng)眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干膠吸水量（mL）的十倍。例如SephadexG-25其吸水量應(yīng)為2.5mL/g干膠。常用的葡聚糖凝膠有多種規(guī)格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!原理···葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!原理葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!操作步驟2、裝柱

每組用50mL燒杯取溶脹的凝膠懸漿25～30mL，靜置片刻，觀察凝膠沉淀與水的體積之比，約為1:1即可，否則應(yīng)作調(diào)整。輕輕攪勻杯中凝膠，用玻璃棒引流入柱，打開出水口，并不斷地向柱內(nèi)補(bǔ)充凝膠，直到凝膠沉淀高度位于標(biāo)記上方約2cm為止，凝膠柱內(nèi)若有氣泡和斷層或柱床表面干水和歪斜，都將影響分離效果。必要時(shí)，需倒出凝膠，重新裝柱。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!操作步驟5、上樣與收集打開出口排水，當(dāng)膠床與上方水層的彎月面相切時(shí)，加入0.6mL混合樣液。上樣完畢，開始收集一號(hào)管。每管收集洗脫液2mL。當(dāng)樣液進(jìn)入膠床，其彎月面與膠平面相切時(shí)，暫停排液，用滴管將洗脫劑沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著加入1cm高水位，然后排液，至其彎月面與膠平面相切，再緩緩注入3～5cm高的洗脫劑。6、洗脫不斷向柱內(nèi)加洗脫劑，保持膠床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6號(hào)管達(dá)2mL。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!操作步驟管號(hào)項(xiàng)目1234567891011白色沉淀量+++藍(lán)色深淺+++8、再生鑒定完畢，打開出水口，繼續(xù)用２～３倍床體積洗脫劑洗脫，洗脫后關(guān)閉出口，以備下次使用。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!

檢查膠平面是否水平；加樣品及洗脫液時(shí)勿沖到膠平面；控制流速；注意事項(xiàng)葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!思考題

1、凝膠的選擇：視分離混合物的組成而定，是大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，即組別分離；還是相對(duì)分子質(zhì)量比較接近的物質(zhì)進(jìn)行分離，即分級(jí)分離。選擇凝膠的另一方面是凝膠的顆粒大小。顆粒小，分辨率高，但流速慢，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)造成擴(kuò)散嚴(yán)重；顆粒大，分辨率低。但條件得當(dāng)，也可以得到滿意的結(jié)果。影響凝膠分離效果的因素：葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!思考題

5、洗脫：洗脫液只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性就可以了。洗脫速度要恒定且合適。一般來講，洗脫速度慢，一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇，區(qū)帶變寬，切實(shí)驗(yàn)時(shí)間大大延長(zhǎng)。6、分配系數(shù)Kav：Kd=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）

影響凝膠分離效果的因素：葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!原理O

目前使用較多的是葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠及其衍生物。

葡聚糖凝膠（商品名稱Sephadex）是最常用的層析介質(zhì)。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷（CH2-CH-CH2Cl）交聯(lián)成的具有三維結(jié)構(gòu)不溶水的高分子化合物。調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑配比，可以獲得網(wǎng)眼大小不同，型號(hào)各異的凝膠。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!原理2、分離原理當(dāng)混合樣液加到凝膠柱上，隨著洗脫劑而通過凝膠柱時(shí)，分子大小不同的物質(zhì)受到不同的阻滯作用。顆粒接近或大于網(wǎng)眼的分子，不能進(jìn)入凝膠的網(wǎng)眼中，在重力作用下它們隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿較短流程向下流動(dòng)，受到的阻滯作用小，移動(dòng)速度快，先出層析柱（此現(xiàn)象叫作被排阻。被排阻的最小分子量稱為該規(guī)格凝膠的排阻極限）；顆粒小于網(wǎng)眼的分子可滲入凝膠網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時(shí)不斷地從一個(gè)網(wǎng)眼穿到另一個(gè)網(wǎng)眼，逐層擴(kuò)散，阻滯作用大，流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，因而后出層析柱。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!原理葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!操作步驟1、層析柱的準(zhǔn)備（1）清洗：每組取一支層析柱，用清水沖洗干凈。

（2）安裝與檢查：檢查出口裝置中尼龍綢或燒結(jié)濾板是否完好干凈。安裝層析柱，讓其垂直固定于滴定臺(tái)架上。對(duì)準(zhǔn)出口處，放一只250mL燒杯。向?qū)游鲋鶅?nèi)灌洗脫劑，打開出口螺旋夾，檢查有無滲漏、出口乳膠管是否通暢等情況。（3）排氣泡：保持柱內(nèi)一定的水位，用手指彈擊柱壁，部分氣泡會(huì)從溶液中上浮排出。出口處的小氣泡易停留在螺旋夾附近的乳膠管內(nèi)，要想法排盡，否則會(huì)影響分離結(jié)果，排氣完畢，保留柱內(nèi)1～2cm高水位，關(guān)緊螺旋夾。（4）標(biāo)記高度：在距頂端8～10cm處做一標(biāo)記，作為衡量灌裝層析介質(zhì)床體高度（15～17cm）的依據(jù)。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!操作步驟3、平衡

取15mL洗脫劑，用滴管沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著緩緩流下，不可沖動(dòng)膠平面，打開出水口，經(jīng)洗脫液的流動(dòng)，一方面清洗內(nèi)壁，另一方面使膠床收緊。洗脫平衡完畢，膠床上方保留約4cm高水位，關(guān)閉出水口。此時(shí)，膠床高度≥15cm為宜。4、準(zhǔn)備收集

取6只干凈的刻度試管（除凈試管內(nèi)殘留的水），1～6編號(hào)，并在試管2mL處作一標(biāo)記。葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!操作步驟7、鑒定

另取6只干凈試管，按收集順序?qū)⑾疵撘阂环譃槎?。排每管?滴BaCl2，根據(jù)白色沉淀多少，判斷SO42-在各管中的濃度。第二排每管加1mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，根據(jù)藍(lán)色情況，判斷蛋白質(zhì)在各管中的濃度。將結(jié)果記錄于下表中。若鑒定的第6號(hào)管中，仍有樣品，表明洗脫和收集不夠，需增加7號(hào)、8號(hào)……葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在同一坐標(biāo)系中，以收集的管號(hào)為橫坐標(biāo)，檢測(cè)物質(zhì)的量為縱坐標(biāo)，繪制二條（蛋白質(zhì)及（NH4）2SO4）洗脫曲線。2、分析混合樣品分離效果。結(jié)果處理葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!思考題

半透膜透析超濾離子交換色譜等蛋白質(zhì)脫鹽的方法：葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!思考題

2、柱子的影響：柱的長(zhǎng)短粗細(xì)對(duì)層析效果都會(huì)產(chǎn)生影響。一般柱內(nèi)徑為1cm，如果樣品較多，最好用2-3cm。直徑太小時(shí)會(huì)發(fā)生“管壁效應(yīng)”。即柱管中心組分移動(dòng)較慢，管壁周圍移動(dòng)較快。進(jìn)行脫鹽時(shí)，柱高50cm比較合適；分級(jí)分離時(shí)，100cm就足夠了。3、凝膠的裝填：要均勻，不能有斷路或氣泡。4、加樣：樣品濃度和黏度合適。一般樣品所用體積為柱體積的1-4%。影響凝膠分離效果的因素：葡聚糖凝膠層析脫鹽共23頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!相關(guān)知識(shí)Vt：床的總體積=外水