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關(guān)于革蘭氏染色和抗酸染色法第1頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日革蘭染色法革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家漢斯·克里斯蒂安·革蘭(Hans
ChristainGran)創(chuàng)立的。第2頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日實驗?zāi)康暮鸵?.掌握革蘭氏染色方法的操作步驟及注意事項。2.了解革蘭氏染色的臨床意義。第3頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日一、實驗原理二、實驗器材三、操作步驟四、注意事項五、革蘭染色的臨床意義第4頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日(一)基本步驟:
1、初染:草酸胺結(jié)晶紫染色
2、媒染:碘液媒染
3、脫色:乙醇脫色
4、復(fù)染:石炭酸復(fù)紅復(fù)染一、實驗原理第5頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日細菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)是由于它們細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。初染后,所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑,它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物,增強染料與細菌的結(jié)合力。(二)原理:第6頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日當(dāng)用脫色劑處理時,G+菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成,壁厚、類脂質(zhì)含量低,用乙醇脫色時細胞壁脫水,使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小,透性降低,從而使結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi),經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍紫色。G-菌則不同,由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高,所以當(dāng)脫色處理時,類脂質(zhì)被乙醇溶解,細胞壁透性增大,使結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來,用復(fù)染劑復(fù)染后,細胞被染上復(fù)染劑的紅色。第7頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日細胞保留初染劑藍紫色的細菌為G+菌;細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色(紅色)的細菌為G-菌。G-G+第8頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日二、實驗器材大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,革蘭氏染色液,生理鹽水,載玻片,接種環(huán),顯微鏡等。第9頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日三、操作步驟第10頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日1、涂片:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別涂片、干燥、固定。
2、染色:(1)初染:加草酸銨結(jié)晶紫一滴,約一分鐘,水洗(2)媒染:滴加碘液沖去殘水,并覆蓋一分鐘,水洗(3)脫色:將水甩凈,并襯以白背景,用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止,約20—30秒,立即用水沖凈乙醇(4)復(fù)染:用番紅液染1--2分鐘,水洗
3、鏡檢:干燥后,油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準,革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。第11頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日四、注意事項第12頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日1、注意涂片不宜過于濃厚。
2、火焰固定溫度要適宜。
3、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度,革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌;如脫色時間過短,革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響,難以嚴格規(guī)定。
4、染色過程中應(yīng)吸去玻片上的殘水,以免染色液被稀釋而影響染色效果。
5、選擇幼齡的細菌。G+菌培養(yǎng)12-16h,E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老,由于菌體死亡或自溶常使G+菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。第13頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日五、革蘭染色的臨床意義1.對細菌的鑒別有重要意義2.指導(dǎo)臨床選擇用藥3.研究細菌與致病性的關(guān)系第14頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日思考題:
當(dāng)你對一株未知菌進行革蘭染色時,怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確,結(jié)果可靠?
第15頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日抗酸染色法第16頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日【原理】結(jié)核桿菌對苯胺染料不易著色,若加溫或延長染色時間使其著色后,再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色,再經(jīng)美蘭復(fù)染,結(jié)核桿菌及其它分枝桿菌仍呈紅色,而非抗酸菌和細胞雜質(zhì)等呈藍色。第17頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日【材料】①結(jié)核病人的咳痰液:采取清晨第一口粘痰,或濃縮集落菌法處理過的痰標本。②石炭酸復(fù)紅染色液,3%鹽酸酒精,堿性美藍染液③生理鹽水④載物玻片,濾紙片、接種環(huán)、玻片夾、酒精燈、蠟筆等第18頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日【方法】1.涂膜痰的涂片:用滅菌的接種環(huán)采取痰中干酪壞死的小塊或帶血的痰液,在載玻片上涂成薄而均勻的膜(在燒接種環(huán)時為防止痰中的細菌濺出,可先將接種環(huán)在內(nèi)焰燒干,然后再于外焰中滅菌)。第19頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日2.染色(1)在已固定好的涂片上放置濾紙片(濾紙的作用是濾去染液中的沉渣,使標本清晰),滴加石炭酸變紅染色液于濾紙片上(應(yīng)滴滿濾紙片)。(2)將加有染液的涂片加溫,在火焰上保持一定的高度,直到出現(xiàn)蒸汽(不得沸騰)如此反復(fù)2—3次(約5分鐘)。在加溫過程中防止將染液烘干(應(yīng)及時添加染液)。(3)去掉濾紙片,使涂片冷卻,水洗。(4)用3%鹽酸酒精脫色,直到流下的脫色劑無色為止,水洗。(5)用堿性美藍染液復(fù)染30秒,水洗、干燥、鏡檢。第20頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日【結(jié)果觀察】1.結(jié)核桿菌染成紅色,細長,直的或為微彎曲,有的可表現(xiàn)出分枝特征,偶而有著色不勻,成顆粒狀者。亦可以見到有縱行條索狀排列。標本的其余部分及非抗酸性細菌染成藍色。必須逐一觀察各個視野,直待全部涂片找不到結(jié)核桿菌時,才可報告陰性。第21頁,共23頁,2023年,2月20日,星期日2.涂片染色能查到結(jié)核桿菌者,一般需要每ml痰液
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