基因工程酵母基因工程

基因工程酵母基因工程第1頁(yè)/共38頁(yè)E酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)C酵母菌的載體系統(tǒng)B酵母菌的宿主系統(tǒng)A酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征F利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗D酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第2頁(yè)/共38頁(yè)A酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征酵母菌的分類(lèi)學(xué)特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔(dān)子菌綱（擔(dān)子酵母菌）、半知菌類(lèi)（半知酵母菌），共由56個(gè)屬和500多個(gè)種組成。酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第3頁(yè)/共38頁(yè)A酵母菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)(GenerallyRecognizedAsSafeGRAS)酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核模式生物第4頁(yè)/共38頁(yè)B酵母菌的宿主系統(tǒng)提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛素依賴(lài)型蛋白降解作用的突變宿主菌廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌第5頁(yè)/共38頁(yè)目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母（Hansenulapolymorpha）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。第6頁(yè)/共38頁(yè)提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌能導(dǎo)致釀酒酵母中重組蛋白產(chǎn)量提高或質(zhì)量改善的突變類(lèi)型ssc1

改善重組蛋白分泌ssc2

提高重組蛋白表達(dá)rgr1

提高重組蛋白表達(dá)ose1

提高重組蛋白表達(dá)ssc11改善重組蛋白分泌rho-

提高重組蛋白表達(dá)突變類(lèi)型生物效應(yīng)第7頁(yè)/共38頁(yè)抑制超糖基化作用的突變宿主菌能抑制超糖基化的突變類(lèi)型mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och外側(cè)糖鏈添加缺陷型突變類(lèi)型生物效應(yīng)

許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對(duì)異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此選擇超糖基化缺陷株非常重要。第8頁(yè)/共38頁(yè)減少泛素依賴(lài)型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用蛋白酶體LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白第9頁(yè)/共38頁(yè)酵母菌泛素依賴(lài)型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因酵母菌共有四個(gè)泛素編碼基因：UBI1編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI2編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI3編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定期關(guān)閉UBI4編碼泛素五聚體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期關(guān)閉穩(wěn)定期表達(dá)酵母菌共有七個(gè)泛素連接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7第10頁(yè)/共38頁(yè)泛素降解途徑衰減的釀酒酵母在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達(dá)，UBI4-突變株能正常生長(zhǎng)，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低得多，因此UBI4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體UBI4缺陷型：Ubc4-ubc5雙突變型：泛素連接酶基因的突變對(duì)衰減蛋白降解作用同樣有效第11頁(yè)/共38頁(yè)C酵母菌的載體系統(tǒng)酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建酵母菌中的野生型質(zhì)粒第12頁(yè)/共38頁(yè)酵母菌中的野生型質(zhì)粒釀酒酵母中的2m環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個(gè)。第13頁(yè)/共38頁(yè)酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有ARS的YRp質(zhì)粒的構(gòu)建酵母菌自主復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建組成包括自主復(fù)制序列、標(biāo)記基因、克隆位點(diǎn)、大腸桿菌質(zhì)粒DNA。以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱(chēng)為YRp。以2m質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱(chēng)為YEp。上述兩類(lèi)質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè)，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。第14頁(yè)/共38頁(yè)含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建CEN為酵母菌染色體DNA著絲粒區(qū)，與染色體均勻分配有關(guān)的序列。將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱(chēng)為YCp。YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1-5個(gè)。含有TEL的YAC質(zhì)粒的構(gòu)建第15頁(yè)/共38頁(yè)含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建

在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來(lái)的質(zhì)粒稱(chēng)為Yip。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。第16頁(yè)/共38頁(yè)D酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)酵母菌的轉(zhuǎn)化程序用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因第17頁(yè)/共38頁(yè)堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有下列特性：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少發(fā)生酵母菌的轉(zhuǎn)化程序第18頁(yè)/共38頁(yè)酵母菌電擊轉(zhuǎn)化法優(yōu)點(diǎn)：不依賴(lài)于受體細(xì)胞的遺傳特征培養(yǎng)容易轉(zhuǎn)化率可高達(dá)105/mgDNA。第19頁(yè)/共38頁(yè)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)單鏈的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10-30倍含有復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后能高效地同源整合克隆在YIp整合型質(zhì)粒上的外源基因，如果含有染色體DNA的同源序列，會(huì)發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50-80%第20頁(yè)/共38頁(yè)用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類(lèi)營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA

但對(duì)于多倍體酵母來(lái)說(shuō)，篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的受體非常困難營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因第21頁(yè)/共38頁(yè)顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物是毒性物質(zhì)的抗性蛋白顯性標(biāo)記基因aph

氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418cat

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素dhfr

二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

銅離子螯合物耐受銅離子suc2

蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型第22頁(yè)/共38頁(yè)E酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素酵母菌啟動(dòng)子的可控性酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇第23頁(yè)/共38頁(yè)酵母菌啟動(dòng)子的可控性pho4TS-PHO5啟動(dòng)子：釀酒酵母中PHO5啟動(dòng)子的正調(diào)控因子是PHO4PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產(chǎn)物在35℃時(shí)失活裝在pho4TS-PHO5啟動(dòng)子下游的外源基因在35℃時(shí)關(guān)閉23℃誘導(dǎo)表達(dá)溫度控制型啟動(dòng)子第24頁(yè)/共38頁(yè)a–a型啟動(dòng)子：釀酒酵母有a和a兩種單倍體，分別由MATa和MATa兩個(gè)等位基因決定。a1因子決定a細(xì)胞特征表達(dá)a2因子阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)a1-a2阻遏a細(xì)胞特征表達(dá)編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產(chǎn)生a2變體，它能滅活a1，同時(shí)阻遏a型。溫度控制型啟動(dòng)子a型啟動(dòng)子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動(dòng)子受體細(xì)胞基因組重組質(zhì)粒a型啟動(dòng)子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型啟動(dòng)子a2a125℃35℃第25頁(yè)/共38頁(yè)釀酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和

GAL10基因編碼超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)效果不明顯，基因基底水平表達(dá)GeneXUASGAL4GAL80半乳糖誘導(dǎo)時(shí)，GAL4高效表達(dá)，外源基因受誘導(dǎo)且超高效表達(dá)GAL10Promoter限制因子第26頁(yè)/共38頁(yè)外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個(gè)密碼子編碼的第27頁(yè)/共38頁(yè)酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。但最大問(wèn)題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白與細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)彌補(bǔ)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)第28頁(yè)/共38頁(yè)乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無(wú)選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。第29頁(yè)/共38頁(yè)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長(zhǎng)迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)外源基因一般整合入染色體DNA上。表達(dá)水平取決于整合拷貝數(shù)。目前已有20余種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。第30頁(yè)/共38頁(yè)重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)第31頁(yè)/共38頁(yè)F利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重的傳染病，每年約有200萬(wàn)病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對(duì)乙型肝炎病毒還沒(méi)有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒感染具有重大的社會(huì)效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。第32頁(yè)/共38頁(yè)產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母第33頁(yè)/共38頁(yè)乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來(lái)的。雖然這種質(zhì)膜來(lái)源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備