HRM應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

HRM應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析第1頁(yè)/共34頁(yè)內(nèi)容一、背景介紹二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三、反應(yīng)體系四、結(jié)果分析第2頁(yè)/共34頁(yè)一、背景介紹HRM分析技術(shù)高分辨率熔解（HighResolutionMelting，HRM）分析技術(shù)是基于核酸的物理性質(zhì)，通過(guò)飽和的插入染料監(jiān)控DNA熔解曲線(xiàn)變化而進(jìn)行分析的一種技術(shù)。HRM檢測(cè)不受突變堿基位點(diǎn)和種類(lèi)的局限，無(wú)需使用序列特異性探針，具有高靈敏度、操作簡(jiǎn)單、高通量、成本低等優(yōu)點(diǎn)。HRM是美國(guó)猶他大學(xué)保健科學(xué)中心病理學(xué)部CarlWittwer實(shí)驗(yàn)室與美國(guó)IdahoTechnology公司于2003年共同合作開(kāi)發(fā)出來(lái)的建立在實(shí)時(shí)熒光基礎(chǔ)上的分析技術(shù)，并于2006生產(chǎn)出世界上第一臺(tái)HRM儀器HR-1。第3頁(yè)/共34頁(yè)HRM分析過(guò)程原始曲線(xiàn)隨著DNA熔解，插入DNA雙鏈中的染料被釋放，熒光信號(hào)驟降導(dǎo)數(shù)圖“速率”曲線(xiàn)的最高峰是分離速率最大的點(diǎn)，即等于熔解溫度對(duì)PCR的擴(kuò)增子進(jìn)行加熱，溫度從50℃逐漸上升到95℃。擴(kuò)增子逐漸解鏈，到達(dá)熔解溫度（Tm）時(shí)，DNA雙鏈完全分開(kāi)。初期，熒光強(qiáng)度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強(qiáng)度下降。通過(guò)檢測(cè)器，記錄熒光變化的過(guò)程。對(duì)數(shù)據(jù)作圖，就生成了熔解曲線(xiàn)。第4頁(yè)/共34頁(yè)HRM發(fā)明者CarlWittwer博士HRM應(yīng)用主要基于兩種技術(shù)的進(jìn)步：雙鏈DNA嵌入型飽和熒光染料如LCGreen具有精確控溫裝置和高密度數(shù)據(jù)采集的儀器第5頁(yè)/共34頁(yè)嵌入型染料--非飽和染料SYBR?GreenISYBR?GreenI對(duì)PCR有抑制作用，必需使用低濃度；即使是高濃度，也不能飽和插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝非飽和態(tài)結(jié)合使染料在熔解過(guò)程中發(fā)生重排，染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒(méi)有變化，特異性下降第6頁(yè)/共34頁(yè)嵌入型染料--飽和染料LCGreen飽和染料在飽和濃度（熒光最大）下，也不會(huì)抑制PCR；高濃度的染料飽和插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過(guò)程中就不會(huì)發(fā)生重排，熔解曲線(xiàn)有更高的分辨率飽和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、CYTO9等第7頁(yè)/共34頁(yè)目前市場(chǎng)上HRM分析儀器的供應(yīng)商，有專(zhuān)用于HRM的儀器，還有附帶HRM功能的RealTimePCR儀，包括：IdahoTechnologyQIAGENRocheHRM對(duì)檢測(cè)儀器的要求擴(kuò)增子的熔解曲線(xiàn)完全取決于DNA堿基序列。只要一個(gè)堿基發(fā)生了突變，就會(huì)改變DNA鏈的解鏈溫度。解鏈溫度差異極小，零點(diǎn)幾攝氏度，使用高分辨率的儀器才可以檢測(cè)?？组g溫度差異（溫度均一性：Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264℃），孔間溫度均一性要達(dá)到0.264℃以?xún)?nèi)才能保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。大多數(shù)RealTimePCR儀的孔間溫度差在0.3-0.5℃，決定了無(wú)法勝任HRM

熔解速率（最低要求：0.1℃/秒）

數(shù)據(jù)密度（最低要求：10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)/℃）第8頁(yè)/共34頁(yè)可以區(qū)分單堿基差異HRM基因分型不需要設(shè)計(jì)特異性的TaqMan探針，只是通過(guò)溶解曲線(xiàn)的分析來(lái)區(qū)分等位基因，從而大大降低了檢測(cè)成本。使用兩種不同的等位基因特異性正向引物，正向引物3’端的最后一個(gè)堿基對(duì)應(yīng)于SNP位點(diǎn)的二等位基因，反向引物都一樣，并使用熒光染料（SYBR

GreenI）來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物。純合子基因組DNA只能被與其完全匹配的正向引物擴(kuò)增，而雜合子基因組DNA能同時(shí)和兩種正向引物結(jié)合擴(kuò)增出兩種PCR產(chǎn)物。HRM應(yīng)用第9頁(yè)/共34頁(yè)HRM區(qū)分單堿基差異同源雙鏈（Homoduplex）純合子通過(guò)Tm值（C>T）容易區(qū)分HRM應(yīng)用TACG第10頁(yè)/共34頁(yè)TACGHRM區(qū)分單堿基差異同源雙鏈（Homoduplex）雜合子形成異源雙鏈（heteroduplexes），雜合子的熔解曲線(xiàn)是由4種配對(duì)方式混合而成++TACG+TGCAHRM應(yīng)用第11頁(yè)/共34頁(yè)1.突變發(fā)現(xiàn)/篩查/掃描2.SNP基因分型/等位基因區(qū)分3.物種鑒定4.表觀遺傳學(xué)/DNA甲基化5.微衛(wèi)星分析

HRM應(yīng)用第12頁(yè)/共34頁(yè)HRM的本質(zhì)二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第13頁(yè)/共34頁(yè)成功的HRM分析的先決條件分析小片段DNA分析純度單一的產(chǎn)物使用足夠的PCR的模板檢查擴(kuò)增曲線(xiàn)是否異常保持?jǐn)U增產(chǎn)物濃度接近確保樣品間的均一性保證在熔解前相和熔解后相都有足夠的數(shù)據(jù)采集時(shí)間第14頁(yè)/共34頁(yè)實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證?鎂離子濃度?緩沖液鹽濃度?Taq儲(chǔ)存液中的添加劑?內(nèi)摻染料種類(lèi)及濃度?反應(yīng)體積?熔解升溫速率(=溫度變化速度)?反應(yīng)容器熔解曲線(xiàn)異?？赡苡梢韵乱蛩匾穑旱?5頁(yè)/共34頁(yè)樣品準(zhǔn)備防止核酸降解避免過(guò)量的抑制劑,如乙醇為使結(jié)果更佳，盡可能保證起始樣品濃度一致建議用分光光度計(jì)檢測(cè)核酸的濃度和純度注意:260nm時(shí)1OD等于50μg/mL的雙鏈DNA純的其260nm/280nm應(yīng)為2第16頁(yè)/共34頁(yè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)準(zhǔn)則對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行充分了解確定目標(biāo)序列內(nèi)的各種變化形式檢查種屬同源性?xún)?nèi)含子外顯子邊界剪切位點(diǎn)已知SNP等將引物的退火溫度設(shè)計(jì)在60度左右，片段長(zhǎng)度100-250bp

可以使用長(zhǎng)片段，但長(zhǎng)片段檢測(cè)的靈敏度會(huì)受影響確定產(chǎn)物和引物在退火溫度時(shí)的折疊特征(使用如DINAMelt，并確定特異性(BLAST搜索)第17頁(yè)/共34頁(yè)擴(kuò)增子的設(shè)計(jì)方法第一步：確定正確的周邊序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找含有多態(tài)性位點(diǎn)的序列，NCBISNP在線(xiàn)搜索引擎(/SNP)第二步：鑒定其它序列特性將你的序列與全基因組序列進(jìn)行BLAST，以確定目標(biāo)序列內(nèi)是否存在其它多態(tài)性位點(diǎn)（這些位點(diǎn)會(huì)以藍(lán)色標(biāo)出，而目標(biāo)位點(diǎn)以黃色標(biāo)出）第三步：拷貝含有目標(biāo)位點(diǎn)的序列，避免那此藍(lán)色位點(diǎn)第四步：將目標(biāo)序列粘貼到擴(kuò)增子設(shè)計(jì)軟件（這里用Primer3軟件/cgibin/primer3/primer3_www.cgi）第五步：建立引物設(shè)計(jì)參數(shù)。如片段長(zhǎng)度60–90bp(最多達(dá)250bp)，引物長(zhǎng)度18-27bp，TM值57-63℃

，GC含量20-80%第六步：選擇引物。分別選擇兩三條上下游引物第七步：檢查二級(jí)結(jié)構(gòu)。用二級(jí)結(jié)構(gòu)解釋軟件檢查引物和擴(kuò)增子的折疊特性。這里使用了DINAMeltServers(/applications/hybrid/twostate-fold.php)第八步：將引物序列與該物種基因組序列相BLAST，以確定其特異性第18頁(yè)/共34頁(yè)第一步：確定正確的周邊序列例（FactorVLeiden）：第19頁(yè)/共34頁(yè)第二步：鑒定其它序列特性第20頁(yè)/共34頁(yè)第三步：拷貝含有目標(biāo)位點(diǎn)的序列，避免那些藍(lán)色位點(diǎn)第21頁(yè)/共34頁(yè)第四步：將目標(biāo)序列粘貼到擴(kuò)增子設(shè)計(jì)軟件第22頁(yè)/共34頁(yè)第五步：建立引物設(shè)計(jì)參數(shù)第23頁(yè)/共34頁(yè)第六步：選擇引物第24頁(yè)/共34頁(yè)第七步：檢查二級(jí)結(jié)構(gòu)第25頁(yè)/共34頁(yè)第八步：將引物序列與該物種基因組序列相BLAST，以確定其特異性第26頁(yè)/共34頁(yè)三、反應(yīng)體系ComponentConcentrationDiluent(Mol.Biol.Gradewater)-PCRBuffer1XMgCl21.5mMdNTPs0.2mMForwardprimer300nMReverseprimer300nMSYTO?91.5μMEvaGreen1-2XTaqDNApolymerase1.25UDNATemplate3x109 copies/μL第27頁(yè)/共34頁(yè)所需的試劑與耗材試劑耗材熱啟動(dòng)TaqPlatinum?TaqDNApolymerase(Invitrogen)Hotstart

Taq

(Qiagen)10XPCR緩沖液隨Taq酶50mMMgCl2隨Taq酶100mMdNTP溶液Invitrogene,NEB等飽和內(nèi)摻染料SYTO9(Invitrogen)EvaGreen(Biotium)LCGreen(IdahoTechnology)EcoplatesEcoAdhesiveSeals第28頁(yè)/共34頁(yè)試劑的處理與保存條件ReagentStorageTemp.StorageStateTaqDNApolymerase–20oCNotCritical10XPCRBuffer–20oCNotCritical50mMMgC