儀器及藥物分析熒光質(zhì)譜

儀器及藥物分析熒光質(zhì)譜第一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日五、熒光分子光度法（一）基本原理（二）熒光分光光度計(jì)（三）特點(diǎn)、方法與應(yīng)用第二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光（fluorescence）現(xiàn)象的第一次記錄：1575年，西班牙內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，觀察到LignumNephriticum木頭切片的水溶液呈現(xiàn)天藍(lán)色。第一次被提議用于分析：1864年，Stokes第一次用于分析：1867年，Goppelsr?der根據(jù)Al-桑色素配合物的熒光，建立了Al3+的熒光測(cè)定方法。第三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日當(dāng)物質(zhì)分子吸收了一定波長(zhǎng)的紫外光能之后，基態(tài)電子躍遷到第一激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的電子首先以無(wú)輻射的方式下降到第一激發(fā)態(tài)的低能級(jí)，而后再回到基態(tài)時(shí)，所發(fā)射出的光稱為熒光。熒光是一種以光能為激發(fā)源的發(fā)射光，且波長(zhǎng)比激發(fā)態(tài)波長(zhǎng)更長(zhǎng)，所以，利用物質(zhì)的熒光現(xiàn)象而建立的分析方法稱為熒光分光光度法。（一）基本原理第四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光定量分析原理熒光是由物質(zhì)在吸收光能之后產(chǎn)生的發(fā)射光，其熒光強(qiáng)度與物質(zhì)吸收光能的程度和產(chǎn)生熒光的物質(zhì)有關(guān)。熒光效率φ——反映熒光強(qiáng)度的重要參數(shù)熒光強(qiáng)度If

應(yīng)與熒光物質(zhì)的吸光強(qiáng)度(I0

－I

)和熒光效率φ成正比，即If=φ(I0

－I

)根據(jù)朗伯–比爾定律，和有關(guān)的運(yùn)算，在一定的條件下，得：If=2.3φ

I0εcl=Kc

第六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（二）熒光分析光度計(jì)光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器檢測(cè)器信號(hào)處理顯示I0

IfI第七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日熒光分光光度計(jì)部件1．光源：鎢燈、汞燈、氙燈、激光激發(fā)光源應(yīng)具有穩(wěn)定性好、強(qiáng)度大、適用波長(zhǎng)范圍寬等特點(diǎn)。其中穩(wěn)定性：影響測(cè)定的重現(xiàn)性和精密度；強(qiáng)度：影響測(cè)定的靈敏度。2．單色器：濾光片、光柵激發(fā)單色器和發(fā)射單色器3．檢測(cè)器 PMTPhotomultiplier CCDChargeCoupledDevice CIDChargeInjectedDevice4．信號(hào)處理第八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日J(rèn)obinYvonFluorolog-3熒光光譜儀1.穩(wěn)態(tài)：S/Nmin4000:1(光子計(jì)數(shù)和全反射光路)

2.10us-10s以上(磷光壽命)10ps-10us(熒光壽命)

3.波長(zhǎng)范圍：200-900nm(UV-VIS-NIR)

4.掃描速度：150nm/s第九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日靈敏度高：比紫外-可見(jiàn)分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)； 檢測(cè)下限：0.1～0.1μg/cm-3

相對(duì)靈敏度：（0.05MH2SO4)選擇性高重現(xiàn)性好取樣量少儀器不復(fù)雜（三）熒光分析方法的特點(diǎn)、方法及應(yīng)用1．特點(diǎn)

第十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日2．方法及應(yīng)用

檢測(cè)：金屬離子、有機(jī)物、生物分子生物分子相互作用研究疾病診斷定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所發(fā)射的熒光波長(zhǎng)不同；定量分析：同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系。分析方法直接熒光法（能產(chǎn)生較強(qiáng)熒光的藥物）間接熒光法（不能產(chǎn)生熒光或熒光很弱的藥物）第十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日六、有機(jī)質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識(shí)質(zhì)譜儀質(zhì)譜分析原理質(zhì)譜圖2.離子峰的主要類型3.有機(jī)質(zhì)譜中的裂解反應(yīng)4.有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見(jiàn)質(zhì)譜圖第十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)譜法將化合物分子在高真空條件下，用高能電子轟擊或強(qiáng)電場(chǎng)使其電離，電離產(chǎn)物按質(zhì)荷比(m/z)大小進(jìn)行分離記錄所得圖譜即所謂的質(zhì)譜圖。基峰第十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日高真空條件

10-4-10-6Pa質(zhì)荷比質(zhì)量/電荷分離聚焦電離電場(chǎng)或高能電子轟擊(~70ev,~6,000KJ.mol-1)M＋e-→M

＋2e-

?第十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）質(zhì)譜計(jì)

質(zhì)譜計(jì)須有進(jìn)樣系統(tǒng)、電離系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測(cè)記錄系統(tǒng)。為了獲得良好分析，必須避免離子和氣體分子的碰撞，凡有樣品分子及離子存在和通過(guò)的地方，都處于真空狀態(tài)。進(jìn)樣系統(tǒng)電離系統(tǒng)質(zhì)量分析器檢測(cè)記錄系統(tǒng)1.氣體擴(kuò)散2.直接進(jìn)樣3.氣相色譜1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場(chǎng)致電離和場(chǎng)解吸4.快原子轟擊5.電噴霧電離1.單聚焦2.雙聚焦

高真空系統(tǒng)第十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日電子轟擊利用高速電子束撞擊氣態(tài)分子，將分解出的陽(yáng)離子高速導(dǎo)入質(zhì)量分離器中，按質(zhì)荷比（m/z）的大小順序收集，并以質(zhì)譜圖記錄下來(lái)，根據(jù)質(zhì)譜峰位置進(jìn)行定性和結(jié)構(gòu)分析，或根據(jù)強(qiáng)度進(jìn)行定量分析?；瘜W(xué)電離高能電子束和小分子反應(yīng)氣體，甲烷等，反應(yīng)生成初級(jí)離子，CH4+.，再和樣品分子反應(yīng)，使之電離。強(qiáng)致電離

電場(chǎng)作用下，汽化樣品分子的電離第十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日?qǐng)鼋馕恍枰?，將樣品吸附在處理過(guò)的金屬尖端，通以微電流，金屬成為場(chǎng)離子發(fā)射體，使樣品解吸，離子化?？煸愚Z擊高能原子束轟擊，采用基質(zhì)負(fù)載樣品，用于不穩(wěn)定的極性分子。電噴霧電離樣品溶液在強(qiáng)靜電場(chǎng)作用下形成帶高度電荷的霧狀小液滴，溶劑不斷揮發(fā)，液滴裂分，最終形成帶電離子，可用于分子量大于20000的生物分子和絡(luò)合物分析。第十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日離子源重離子路徑離子收集器第二十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日離子源結(jié)構(gòu)第二十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）質(zhì)譜分析原理

質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進(jìn)行分離的裝置。離子電離后經(jīng)加速進(jìn)入磁場(chǎng)中，其動(dòng)能與勢(shì)能相等，即(1/2)m

2=zU

質(zhì)量為m,電荷為z的正電荷離子，經(jīng)外加電場(chǎng)U的加速，離子的運(yùn)動(dòng)速度為υ。在磁場(chǎng)存在下，帶電離子按曲線軌跡飛行；

向心力=離心力；Hz=m

2/R第二十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)譜方程式：m/z=(H2R2)/2U離子在磁場(chǎng)中的軌道半徑R取決于：m/z、H

、U向心力=離心力；Hz=m

2/R固定U值，將H由小到大連續(xù)改變,在狹縫收集的離子的m/z比也由小到大地改變。第二十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日單聚焦質(zhì)譜計(jì)雙聚焦質(zhì)譜計(jì)第二十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日各種峰表示不同質(zhì)/荷比的離子；縱坐標(biāo)以相對(duì)豐度表示，峰越高表示形成的離子越多；（即譜圖中以最強(qiáng)峰高為100%，分別計(jì)算其他峰強(qiáng)度）（3）質(zhì)譜圖基峰：質(zhì)譜圖中離子強(qiáng)度最大的峰第二十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日六、有機(jī)質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識(shí)2.離子峰的主要類型分子離子峰同位素離子峰碎片離子峰重排離子峰兩價(jià)離子峰3.有機(jī)質(zhì)譜中裂解反應(yīng)4.有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見(jiàn)質(zhì)譜圖第二十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）分子離子峰質(zhì)譜信號(hào)十分豐富。分子在離子源中可以產(chǎn)生各種電離，即同一種分子可以產(chǎn)生多種離子峰，其中比較主要的有分子離子峰、重排離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰等。試樣分子在高能電子撞擊下失去一個(gè)價(jià)電子，即

M＋e-→M

＋2e-

生成的離子稱為分子離子或母離子。其中“+”代表正離子，“.”代表不成對(duì)電子。?分子離子的質(zhì)量與化合物的分子量相等。第二十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日分子離子母離子奇電子離子碎片離子+.第二十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)譜圖上哪個(gè)是分子離子峰，哪個(gè)是基峰？思考！13057298710141第二十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日有機(jī)化合物分子離子峰的相對(duì)強(qiáng)度：在質(zhì)譜中，分子離子峰的強(qiáng)度和化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。環(huán)狀化合物比較穩(wěn)定，不易碎裂，因而分子離子較強(qiáng)。支鏈較易碎裂，分子離子峰就弱，有些穩(wěn)定性差的化合物經(jīng)?？床坏椒肿与x子峰。芳香化合物＞共軛鏈烯＞烯烴＞脂環(huán)化合物＞直鏈烷烴＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支鏈烷烴＞醇．第三十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日M=93Ｎ律——分子中若含有偶數(shù)個(gè)氮原子，則相對(duì)分子質(zhì)量將是偶數(shù)；反之，將是奇數(shù)。這就是所謂的“氮律”。第三十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日例如：CH4M=1612C+1H×4=16M13C+1H×4=17M+112C+2H+1H×3=17M+113C+2H+1H×3=18M+2同位素峰分子離子峰（2）同位素離子峰（M+1峰）

由于同位素的存在，可以看到比分子離子峰大一個(gè)質(zhì)量單位的峰；有時(shí)還可以觀察到M+2，M+3…….；1615m/zRA13.1121.0133.9149.2158516100171.1m/z第三十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）碎片離子峰

一般有機(jī)化合物的電離能為7－13電子伏特，質(zhì)譜中常用的電離電壓為70電子伏特，過(guò)剩的能量使分子離子化學(xué)鍵斷裂，產(chǎn)生各種“碎片”離子。第三十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日H3CH3CC=O+·–CH3·CH3–C≡O(shè)+–COCH3+M+·=58m/z=43m/z=15碎片可以來(lái)剖析分子的結(jié)構(gòu)第三十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日常見(jiàn)丟失碎片常見(jiàn)穩(wěn)定離子第三十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（4）重排離子峰當(dāng)分子中裂解為碎片離子時(shí)，在鍵斷鏈的同時(shí)，分子內(nèi)部的原子或基團(tuán)重排，形成隨片離子，這種離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰稱為重排離子峰。第三十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（5）兩價(jià)離子峰分子受轟擊后，失去兩個(gè)電子，形成M2+離子，M2+離子產(chǎn)生的質(zhì)譜峰稱為兩價(jià)離子峰。一些雜環(huán)、芳環(huán)和高度不飽和的化合物也易形成兩價(jià)離子峰，而決大多數(shù)藥物和毒物均有雜環(huán)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)。

除上述離子峰外，還可能有亞穩(wěn)離子峰以及碎片與中性碎片反應(yīng)形成的離子峰等。對(duì)于一張未知化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析時(shí)，必須慎重、全面考慮。第三十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日六、有機(jī)質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識(shí)2.離子峰的主要類型3.有機(jī)質(zhì)譜中裂解反應(yīng)自由基引發(fā)的裂解反應(yīng)自由基引發(fā)的重排反應(yīng)4有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見(jiàn)質(zhì)譜圖生物質(zhì)譜第三十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日α―裂解C-Y或C=Y（Y=O，N，S）基團(tuán)的化合物與這些基團(tuán)相連的化學(xué)鍵斷裂。自由基或電荷定位在分子中某個(gè)特定的位置上，然后以一個(gè)電子或電子對(duì)的轉(zhuǎn)移來(lái)引發(fā)裂解反應(yīng)。C的價(jià)電子基本上都用于成鍵；O，N，S有非鍵電子（1）自由基的位置引發(fā)的裂解反應(yīng)第三十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日α―裂解CH3(CH2)9CH2NH2M=15730α―裂解——丟失最大烴基的可能性最大丟失最大烴基原則第四十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日麥?zhǔn)现嘏牛∕claffertyrearrangement)位的H

轉(zhuǎn)移到雜原子上，同時(shí)鍵發(fā)生斷裂，生成一個(gè)中性分子和一個(gè)自由基陽(yáng)離子（2）自由基位置引發(fā)的重排反應(yīng)鍵斷裂的同時(shí)有氫原子發(fā)生轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生重排離子；第四十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日六、有機(jī)質(zhì)譜法1.質(zhì)譜基本知識(shí)2.離子峰的主要類型3.有機(jī)質(zhì)譜中裂解反應(yīng)4有機(jī)化合物的一般裂解規(guī)律和常見(jiàn)質(zhì)譜圖烴類化合物的裂解雜原子化合物的裂解常見(jiàn)質(zhì)譜圖第四十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）烴類化合物的裂解優(yōu)先失去大的基團(tuán)，優(yōu)先生成穩(wěn)定的正碳離子。C6H5CH2+

CH2=CHCH2+

R3C+

R2CH+

RCH2+

CH3+穩(wěn)定性第四十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日①直鏈烷烴正癸烷ΔM=14M-29CH3CH2CH2+CH3CH+CH3異構(gòu)化生成穩(wěn)定的正碳離子第四十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日有m/z：29，43，57，71，……CnH2n+1系列峰ΔM=14M-29基峰為43或57第四十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日②支鏈烷烴CH3CH2CH2CH2CH3C+（CH3）2第四十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日③環(huán)烷烴環(huán)烷烴分子離子峰較強(qiáng)第四十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第四十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日④烯烴41基峰是烯丙基正離子，M=41CH2=CHCH2+第四十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日⑤芳香烴第五十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十一頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十二頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日ΔM=14M-29基峰為43或57直鏈烷烴和支鏈烷烴質(zhì)譜圖有什么異同之處？支鏈烷烴有M-15環(huán)烷烴分子離子峰較強(qiáng)芳香烴芐基正離子一般是基峰（91）有苯環(huán)斷裂的特征峰77，65，37…..烯烴的基峰一般是烯丙基正離子，M=41小結(jié)第五十三頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日特征：m/z=31+n*14;CH2=OH；出現(xiàn)M-18峰,失去一分子的水；+（2）含雜原子化合物的裂解醇，酚，醚類的裂解第五十四頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十五頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日M-18第五十六頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十七頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日第五十八頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日芐醇：M-1峰比較強(qiáng)；m/z=79峰比較特征.苯酚的質(zhì)譜與芐醇會(huì)有什么不同呢？基峰第五十九頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日苯酚94的峰強(qiáng)，77的峰很弱。第六十頁(yè)，共七十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）常