FISH技術(shù)在血液腫瘤中應用

FISH技術(shù)在血液腫瘤中應用第1頁/共34頁FISH技術(shù)原理第2頁/共33頁第2頁/共34頁FISH技術(shù)原理第3頁/共33頁第3頁/共34頁FISH技術(shù)原理第4頁/共33頁第4頁/共34頁FISH技術(shù)原理第5頁/共33頁第5頁/共34頁FISH技術(shù)原理第6頁/共33頁第6頁/共34頁FISH技術(shù)原理第7頁/共33頁第7頁/共34頁FISH技術(shù)原理第8頁/共33頁第8頁/共34頁FISH的種類間期FISH（InterphaseFISH）染色體涂染分析（Chromosomepainting）多色FISH（Multicolor-FISH）反向涂染（Reversepainting）比較基因組雜交（Comparativegenomichybridization）第9頁/共33頁第9頁/共34頁FISH探針的種類和用途著絲粒探針用于檢測染色體數(shù)目異常如三體、單體等。亞端粒探針靠近端粒的200-300Kb為染色體特異性DNA，用于檢測涉及端粒的隱匿性易位。染色體臂或整條染色體涂染探針（WCP）用于檢測染色體易位和標記染色體。序列特異性探針包括臂、帶和基因探針等多種，用于檢測基因缺失和重排。第10頁/共33頁第10頁/共34頁

血液腫瘤FISH檢測常見探針類型

雙色雙融合探針（DC，DF）額外信號探針（ES）分離探針（BRK）第11頁/共33頁第11頁/共34頁FISH在血液腫瘤中的應用檢測樣本可以是血液、骨髓、石蠟切片診斷和鑒別診斷治療和預后分層監(jiān)測療效（微小殘留病灶檢測）

識別移植后骨髓細胞來源第12頁/共33頁第12頁/共34頁一、診斷和鑒別診斷核型分析缺點：有絲分裂象少或缺如染色體質(zhì)量低劣，顯帶不佳染色體異常復雜分子生物學檢測不足：常見的轉(zhuǎn)錄序列來設計引物，擴增的片段長度一般在100～700bp之間mRNA剪切方式比較特殊，假陰性結(jié)果，易造成漏診或誤診第13頁/共33頁第13頁/共34頁一、診斷和鑒別診斷FISH技術(shù)能彌補以上2種技術(shù)的不足之處間期細胞上分析（無需中期分裂象），極大地提高了敏感性、準確性和可靠性。對核型提示的染色體異常做進一步鑒定，從“正常核型”中篩查隱匿的染色體畸變，成為精確的染色體分析不可缺少的手段。FISH探針的片段相對較長，?？蛇_數(shù)百kb，甚至大于1Mb，跨越融合基因每一側(cè)多個外顯子區(qū)域，只要發(fā)生在這些區(qū)域的缺失或易位都能被檢測到，極少發(fā)生漏檢，假陰性率很低。第14頁/共33頁第14頁/共34頁舉例男性46歲患者，2003.2.24內(nèi)科急診發(fā)現(xiàn)白細胞增高（25×109/L）。骨髓顯示粒系極度增生，紅系、巨核系以及血小板增生尚可，NAP積分49分，核型分析結(jié)果為46,XY[20]。隨訪3年，其白細胞始終維持在20-30×109水平。一、診斷第15頁/共33頁第15頁/共34頁2006.5.4發(fā)現(xiàn)白細胞增高至170×109，血小板511×109，血紅蛋白118g/dL。骨髓象顯示早幼粒細胞占6%，中幼粒細胞占13%，核型分析未見分裂象。BCR-ABL210基因陰性，經(jīng)單融合FISH探針證實骨髓59%細胞BCR-ABL融合基因陽性。接受格列衛(wèi)治療，2006.9.7復查，F(xiàn)ISH陽性細胞比例降低至7.4%，2006.10.23以后的復查結(jié)果FISH都為陰性。一、診斷第16頁/共33頁第16頁/共34頁其他常用于診斷的探針還有：PML/RARA，AML1/ETO，CBFβ，TEL/AML1等。以CBFβ探針為例：發(fā)生16號染色體倒位的細胞其熒光信號由2F變成1F/1R/1G。有研究表明CBFβ探針對inv(16)導致的CBFβ-MYH11融合基因的檢出率與分子生物學的方法相當。一、診斷第17頁/共33頁第17頁/共34頁一、診斷—急性淋巴細胞白血病急性淋巴細胞白血病檢測探針探針定位異常染色體GLP4/GLP10GLP4:4p11.1-q11.1GLP10:10p11.1-q11.1+4，+10GLP17GLP17:17q11+17GLPTEL/GLPAML1GLPAML1：21q22GLPTEL：12p13

t(12;21)GLPMLLGLPMLL：11q23t(11;v)GLPBCR/GLPABL(DF)GLPBCR:22q11.2GLPABL:9q34t(9;22)第18頁/共33頁第18頁/共34頁一、診斷—淋巴瘤B細胞淋巴瘤—IGH基因斷裂重組濾泡性淋巴瘤—IGH/BCL2融合基因套細胞淋巴瘤—IGH/CCND1融合基因彌漫大B細胞淋巴瘤—BCL6基因Burkitt淋巴瘤—C-MYC基因粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤—MALT基因斷裂重組第19頁/共33頁第19頁/共34頁鑒別診斷，以BCR/ABL探針為例：額外信號的BCR/ABL探針（ES）根據(jù)熒光信號的模式不同，可以鑒別MBCR斷裂點（P210）和mBCR斷裂點(P190)。MBCR斷裂點的細胞呈現(xiàn)1Y/2R/1G的信號模式，而mBCR斷裂點的細胞則是2Y/1R/1G的信號模式。一、鑒別診斷第20頁/共33頁第20頁/共34頁一、鑒別診斷雙色雙融合信號探針（DF）—雖不能區(qū)分MBCR和mBCR，但能檢測der（9）的部分序列缺失。ABL和BCR基因同時缺失：1R/1G/1YABL基因單獨缺失：1R/2G/1Y。ES探針卻無法檢測der（9）的部分序列缺失，其信號均顯示1R/1G/1Y。第21頁/共33頁第21頁/共34頁一、鑒別診斷IgH-CCND1男性，54歲患者，左頜下腫塊2月余白細胞增高（21.3×109/L）骨髓涂片見到增生活躍，以成熟淋巴細胞增生為主，考慮慢性淋巴細胞白血病。流式分析顯示CD5+CD19+細胞占86.5%，以CD19+的細胞群設門，CD23+細胞約占16.3%。FISH檢測患者外周血，約50%的圓形細胞顯示融合信號，提示套細胞淋巴瘤可能性大。病理證實了左頜下淋巴結(jié)非霍奇金套細胞淋巴瘤。。第22頁/共33頁第22頁/共34頁

CLL中的應用CLL的細胞大多處于間期，有絲分裂活性較低，細胞往往不分裂，即使分裂的細胞絕大多也是正常核型，核型分析的異常檢出率很低。CLL的遺傳學異常被認為與存活期有關(guān)：正常核型和13q-預后相近+12、11q-和17p-的預后均較差二、治療和預后分層第23頁/共33頁第23頁/共34頁FISH共檢出了23例異常（76.7%）。完成核型分析的18例中僅2例檢出異常。正常核型的9例中，F(xiàn)ISH檢出7例異常。未見分裂象的7例中，F(xiàn)ISH檢出5例異常。而且這些由FISH檢出的異?？寺”壤径荚?0%以上。CEP12P53D13S25RB1ATM核型陽性例數(shù)11213121異常2正常9未見7未做12二、治療和預后分層第24頁/共33頁第24頁/共34頁MM中的應用MM的骨髓瘤細胞有絲分裂指數(shù)低，且由于骨髓浸潤程度不同，常規(guī)核型分析異常檢出率相對較低，檢出的異常往往是超二倍體和/或復雜核型。MM的遺傳學異常同樣被認為與預后相關(guān)，13q14的缺失被認為是復發(fā)和預后不良的獨立危險因素，1q21擴增、p53缺失也都提示預后不良。二、治療和預后分層第25頁/共33頁第25頁/共34頁二、治療和預后分層FISH共檢出了17例異常（56.7%）。完成核型分析的27例中6例檢出異常（22.2%）。正常核型的15例中，F(xiàn)ISH檢出9例異常。未見分裂象的7例中，F(xiàn)ISH檢出3例異常。FISH檢出的異常克隆比例大多都低于30%。漿細胞比例低于20%，異常檢出率會大大降低。1q21P53D13S319RB1IgH核型陽性例數(shù)628710異常6正常15未見6未做3第26頁/共33頁第26頁/共34頁MDS中的應用FISH在MDS中的應用價值相對較低。MDS的患者大多能成功完成核型分析，且被分析的分裂象數(shù)目和質(zhì)量尚可。FISH檢測普遍采用組合探針（-5/5q-、-7/7q-、+8、20q-和-Y）對五大類常見異常進行分析。二、治療和預后分層第27頁/共33頁第27頁/共34頁在我院新近完成的70例MDS患者的研究中：核型和FISH分別檢出21例和22例異常，異常檢出率相當。核型異常但FISH正常的6例，這6例異常均發(fā)生于探針覆蓋范圍以外區(qū)域。核型正常而FISH異常7例，這7例的異常克隆細胞比例大多較低（<10%）。對于未見分裂像和正常核型的患者有一定的應用價值，能提高小克隆異常的檢出率。二、治療和預后分層第28頁/共33頁第28頁/共34頁三、監(jiān)測療效

對于某些不具有特定分子水平改變，或者是基因重排方式比較特殊，常規(guī)的分子生物學方法不能檢測，但其在疾病初發(fā)時有較大片段的易位、缺失、擴增或重排并能被現(xiàn)有的FISH探針檢出的患者，可在治療后進行FISH監(jiān)測。第29頁/共33頁第29頁/共34頁FISH在異性別異基因造血干細胞移植后供受者嵌合比例的監(jiān)測中也有非常重要的價值。比較未分選細胞的STR和FISH兩種技術(shù)，F(xiàn)ISH的敏感性和準確度更高，對于早期提示復發(fā)或排斥反應的臨床應用價值更大。四、識別移植后骨髓細胞來源第30頁/共33頁第30頁/共34頁小結(jié)FISH的優(yōu)點：簡便迅速。雜交和檢測效率高。敏感性和特異性高，能對間期細胞進行分析。缺點包括：價格相對較高。受探針來源的限制。檢測三體敏感性高于單體或缺失。石蠟包埋或冰凍切片較難處理。需熒光顯微鏡和分析系統(tǒng)